Questo metodo fornisce uno strumento diagnostico veloce e affidabile per l'identificazione di Bemisia tabaci, un parassita invasivo degli insetti che influisce sulla produzione di verdure e colture ornamentali in molti paesi del mondo. Grazie alla sua facilità, il metodo può essere eseguito in loco direttamente nei punti di ingresso per i prodotti di importazione degli impianti, come porti e aeroporti, e ha quindi il potenziale per ridurre la dispersione di Bemisia tabaci lungo le reti di trading. Per iniziare, utilizzare le forbici per tagliare una striscia LAMP a otto tubi in due strisce LAMP a quattro tubi.
Quindi, etichettare i tubi in base allo schema delineato nella figura uno del protocollo di testo. Dopo questo, preparare abbastanza B.tabaci LAMP reaction master mix per 80 reazioni. Quindi, erogare 22,5 microlitri del master mix in ciascuno dei tubi delle strisce LAMP a quattro tubi.
Centrifuga a impulsi e mettili sul ghiaccio. Rapida centrifuga a vortice e impulso B.tabaci LAMP PAC. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri nel tubo etichettato PAC in ciascuna delle strisce LAMP a quattro tubi.
Quindi, chiudere i coperchi e conservare le unità kit B.tabaci LAMP pronte all'uso a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare l'estrazione del DNA, utilizzare stuzzicadenti sterili per trasferire i campioni di insetti in tubi di microcentrifugo da 0,5 millilitri con 30 microlitri di soluzione di estrazione del DNA. Quindi, incubare i campioni per cinque minuti a 95 gradi Celsius in un ThermoMixer impostato su 300 giri/min.
Centrifugare brevemente i campioni con vortice e impulsi. Scongelare uno dei kit B.tabaci LAMP pronti all'uso. Quindi, vortice il kit rapidamente, e impulso centrifugarlo.
Aggiungere 2,5 microlitri di estratto di DNA campione ai tubi S-one e S-two. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri di pura soluzione di estrazione del DNA alcalino al tubo NAC. Dopo aver vorticato e centrifugato l'impulso, inserire il kit in un dispositivo di analisi LAMP ed eseguire analisi di amplificazione del DNA isotermico a 65 gradi Celsius per 60 minuti.
Nella stessa corsa, eseguire un'analisi della temperatura di fusione dei prodotti di amplificazione del DNA riscaldando prima il kit a 98 gradi Celsius e raffreddandolo a 75 gradi Celsius. Convalidare la lettura LAMP utilizzando l'applicazione di convalida LAMP automatizzata. Definire innanzitutto le specie di destinazione e il numero di campioni testati prima di fare clic sul pulsante Genera report.
Infine, trasferire la lettura nei campi di input appropriati dell'applicazione di convalida. Immediatamente dopo l'immissione dei dati, verrà visualizzato il risultato della convalida. In questo protocollo, i campioni di insetti B.tabaci intercettati nel corso del regolare processo di controllo delle importazioni svizzere sono stati analizzati tramite test LAMP.
Su un totale di 80 esemplari analizzati, 75 esemplari sono stati correttamente identificati come veri positivi e due campioni sono stati correttamente identificati come veri negativi. Tre esemplari, tuttavia, erano falsi negativi e sono stati erroneamente identificati come non essere B.tabaci. Un sottoinsieme dei test è stato eseguito in loco da ispettori fitosanitari all'aeroporto di Zurigo.
Nei risultati rappresentativi, i campioni uno e due sono stati correttamente identificati come B.tabaci tramite amplificazione del DNA dopo circa 30 minuti nella temperatura di ricottura prevista di circa 82 gradi Celsius. Dopo il suo sviluppo, questo metodo ha spianato la strada a un'identificazione in loco rapida e facile da eseguire di Bemisia tabaci. Il protocollo è progettato in modo tale che possa essere eseguito da ispettori fitosanitari con una formazione di laboratorio limitata.
Dopo aver convalidato con successo il metodo in un punto di ingresso svizzero per i prodotti di importazione vegetale, il metodo potrebbe essere adattato ad altri agenti patogeni vegetali ma anche, se necessario, ad altri agenti patogeni umani o veterinari.
