Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la biologia gastrointestinale, come il modo in cui l'espressione genica cambia o le sfide ambientali alterano la funzione intestinale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede meno tempo ed è più facile da eseguire rispetto ai metodi tradizionali di misurazione del transito intestinale. Il giorno del saggio, le larve vengono nutrite con cibo contenente un'etichetta fluorescente e, mentre mangiano quel cibo, l'etichetta si accumulerà nel loro intestino.
Dopo l'alimentazione, vengono risciacquati, separati dal cibo non consumato e ogni larva viene trasferita in un pozzo di un piatto multi-pozzo. Il pozzo ha un fondo conico in modo che quando la materia fecale viene annullata, cade al centro del pozzo. Ora ricorda, ci sono molte larve nella piastra multi-pozzo che possono essere monitorate contemporaneamente utilizzando uno spettrofotometro a piastre, che misura la quantità di materia fecale annullata.
E poiché più viene annullato nel tempo, il segnale aumenta di conseguenza. In questo modo, abbiamo un metodo ad alta produttività per misurare il transito intestinale. Il quarto giorno dopo la fecondazione, cospargere due milligrammi di cibo di pesce larvale in polvere sopra l'acqua in ogni piatto di Petri per nutrire le larve.
Lasciare le larve quattro ore per nutrirsi. Dopo l'alimentazione, trasferire tutte le larve in un grande piatto di risciacquo contenente mezzo embrionale fresco. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 millilitri, aspirare delicatamente il più possibile il cibo rimasto, facendo attenzione a non catturare larve.
Trasferire le larve in una nuova piastra di Petri contenente 50 millilitri di mezzo embrionale fresco. Ripetere il processo di alimentazione, risciacquo e trasferimento per altri due giorni. Il sesto giorno dopo la fecondazione, inizia a preparare il cibo fluorescente aggiungendo 200 milligrammi di cibo essiccato a un bicchiere da orologio da 10 centimetri.
Aggiungere 300 microlitri di etichetta fluorescente e 100 microlitri di acqua deionizzata e mescolare brevemente. Stendere la pasta risultante in uno strato sottile sul vetro dell'orologio e lasciare asciugare a temperatura ambiente, al buio, per almeno otto ore. Dopo questo, raschiare la miscela essiccata dal vetro dell'orologio.
Schiacciarlo in una polvere e conservarlo a temperatura ambiente, al buio. Il settimo giorno dopo la fecondazione, nutrire il cibo fluorescente alle larve cospargendone due milligrammi sopra l'acqua in ogni piastra di Petri. Consentire alle larve di nutrirsi per due ore.
Nel frattempo, preparare le soluzioni di dosamento concentrate sciogliendo ogni composto di prova in mezzo embrione a una concentrazione che è due volte la dose target con un volume finale di almeno 2,5 millilitri. Alla fine del periodo di alimentazione, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostarli in un grande piatto di risciacquo. Risciacquare tutte le larve precedentemente descritte con un aspirapolvere più rigoroso.
È importante rimuovere il maggior numero possibile di alimenti fluorescenti rimanenti durante il risciacquo finale per ridurre la possibilità che venga inavvertitamente trasferito nel piatto da 96 po '. Dopo che ogni larva è stata risciacquata, ha usato una pipetta per ritirarla insieme a 100 microlitri di mezzo embrionale dal piatto di risciacquo. Erogare la larva e gli interi 100 microlitri di mezzo in un pozzo di un polistirolo a 96 po ', fondo conico, piastra multi-pozzo.
Una volta trasferite tutte le larve, aggiungere 100 microlitri delle soluzioni di dosamento preparate ai pozzi appropriati. Dopo aver aggiunto tutte le soluzioni di dosamento, caricare la piastra in uno spettrofotometro a piastre. Misurare la fluorescenza dalla piastra dal basso, cinque volte in successione immediata, senza scuotere la piastra.
La lettura più bassa da ogni pozzo sarà designata come sua fluorescenza iniziale durante l'analisi dei dati. Incubare la piastra a circa 28 gradi Celsius. Ripetere il processo di misurazione, leggendo la fluorescenza ogni 20 minuti per le prime due ore dopo il dosamento e incubando tra una lettura e l'altro.
Misurare la fluorescenza ogni 30 minuti per la terza e la quarta ora dopo il dosamento e quindi effettuare misurazioni orarie per le ore dalle cinque alle otto. Incubare le larve a 28 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, leggi la fluorescenza a 24 ore dopo il dosing.
Questo protocollo utilizza la spettrofotometria a piastre per valutare il transito gastrointestinale come sostituto ad alta produttività per la microscopia fluorescente. I risultati rappresentativi che confrontano questi due metodi vengono generati analizzando pesci trattati in modo identico per un periodo di 24 ore dopo il dosing. Come si vede qui, i risultati sono altamente correlati, con una pendenza negativa perché la microscopia misura il segnale di fluorescenza trattenuto e la spettrofotometria misura il segnale trasmesso.
L'analisi di composti con meccanismi disparati rivela che rispetto ai controlli trattati con veicolo, l'atropina e l'amitriptilina rallentano il transito GI. Tegaserod e metoclopramide, d'altra parte, sono visti accelerare i tempi di transito. L'eriomicina, che avrebbe dovuto accelerare il tempo di transito sulla base della risposta dei mammiferi, è invece vista non avere alcun effetto sul tempo di transito dei pesci zebra.
Ulteriori analisi dimostrano che l'atropina rallenta il transito dell'IG, dose dipendente, nelle larve di pesce zebrato. La dose più bassa testata, 042 micromolare, non ha avuto alcun effetto significativo. Mentre le due dosi più elevate sono viste ciascuna avere un impatto significativo.
Questo metodo ha molte applicazioni, tra cui il rilevamento di effetti IG tossici da farmaci o candidati ai farmaci, la modellazione delle malattie, come la sindrome dell'intestino irritabile, la scoperta di nuove terapie per tali malattie e la scoperta di composti procinetici.
