Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nella fisiopatologia dell'aterosclerosi precoce nei topi. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'efficienza, la rapidità con cui l'aldosterone induce lo sviluppo di placche di aterosclerosi nella crescita adulta. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto alcuni passaggi tecnici sono difficili da imparare solo attraverso l'istruzione di testo.
A dimostrare la procedura sarà Caterina Mammi, scienziata dello staff del mio laboratorio. Indossando guanti chirurgici, attaccare il tubo di riempimento della mini-pompa a una siringa da un millilitro e caricare il tubo con 125 microlitri della soluzione aldosterone o del veicolo. Inserire il tubo di riempimento attraverso il foro nella parte superiore della mini-pompa fino a quando non può avanzare ulteriormente e riempire lentamente la pompa con la soluzione di aldosterone.
Interrompere il riempimento della pompa quando un tallone di fluido esce dal corpo della pompa e rimuovere con cura il tubo di riempimento. Inserire il regolatore di flusso nel corpo della mini-pompa, facendo attenzione che il regolatore sia seminato saldamente contro il corpo della pompa e innescare la pompa riempita in un becher contenente soluzione salina sterile a 37 gradi Celsius, fino a 24 ore prima dell'impianto. Per impiantare le pompe, utilizzare un rasoio per rimuovere i capelli dal sito chirurgico e disinfettare la pelle esposta con il 70% di alcol isopropilico imbevuto di materiale tampone non tessuto.
Successivamente, fare un'incisione da 0,8 a un centimetro attraverso la pelle, ma non i tessuti sottostanti e utilizzare le forcep per aprire l'incisione. Utilizzando un trocar d'altra parte, stendere la pelle per creare una tasca per la pompa dall'incisione verso la scapola e inserire la pompa nell'incisione, con la testa del regolatore orientata verso la parte anteriore del mouse, spingendo delicatamente la pompa completamente in tasca in modo che ci sia abbastanza pelle per chiudere la ferita senza tensione o allungamento. Una volta inserita la pompa, suturare l'incisione con filo chirurgico e utilizzare un tampone pulito per applicare un unguento di iodio topico al 10%povidone.
Quindi consentire al mouse di riprendersi in una fase di riscaldamento con monitoraggio fino alla piena reclinabile. Nel punto finale sperimentale appropriato, perfondere il topo attraverso il ventricolo sinistro usando la perfusione di gravità con da 10 a 15 millilitri di DPBS ghiacciato, seguito da 40-50 millilitri del 10% di formula tamponata neutra. Dopo 10-20 minuti, posizionare il mouse sotto stereoscopio e utilizzare forcelle e forbici per rimuovere il tessuto adiposo periaortico e pericardico in eccesso.
Tenere il cuore fisso con le flessione e tagliare perpendicolarmente all'accesso dell'arco aortico, il più vicino possibile al cuore, senza causare danni. Una volta che il cuore è stato separato dall'aorta, utilizzare un bisturi per tagliare trasversalmente lungo una linea retta, unendo i punti inferiori dell'atrio destro e sinistro e riempiendo la parte superiore del cuore aperto con un composto di temperatura di taglio ottimale. Posizionare il tessuto reinsediato con uno stampo di plastica crio-sezione con l'asse dell'aorta posto perpendicolarmente alla base dello stampo rettangolare e coprire il tessuto con OCT fresco.
Retroilluminare lo stampo per assicurarsi che il tessuto sia correttamente orientato, quindi posizionare con cura lo stampo su una piastra metallica su ghiaccio secco, avvolgendo l'intero stampo con un foglio d'argento per meno 80 gradi Celsius di stoccaggio quando lo Strumento di personalizzazione di Office diventa bianco. Quando la criostatica raggiunge meno 20 gradi Celsius, montare il blocco cardiaco congelato sul supporto del campione con il ventricolare rivolto verso l'esterno e inserire il supporto del campione nella testa orientante del campione. Regolare l'orientamento del supporto del campione per sedire il blocco con la radice aortica perpendicolare alla lama e tagliare il blocco fino a raggiungere la radice aortica.
Raccogliere sezioni seriali su vetrini, monitorando il profilo anatomico della radice aortica, fino a visualizzare tutte e tre le valvole aortiche. Quindi raccogliere sezioni spesse da sei a otto, 10 micrometri o fino a quando una delle tre valvole scompare o non è più intatta. Per la colorazione del grasso neutro o rosso olio, fissare le sezioni in 70 millilitri di formaldeide al 37% per cinque minuti, seguita da un lavaggio accurato in acqua del rubinetto.
Dopo due o tre minuti, cancellare l'acqua di accesso e macchiare le sezioni in 70 millilitri dello 0,3% di olio rosso O per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per 10 minuti e macchiare le cellule per un minuto in 70 millilitri dell'ematossilina di Meyer, seguita da un lavaggio dell'acqua di un minuto e un minuto in 70 millilitri dello 0,5% di carbonato di litio. Quindi lavare le cellule in acqua per un ultimo minuto e montare le sezioni con un mezzo di montaggio acquoso per l'imaging mediante microscopia ottica.
Dopo quattro settimane di trattamento, i topi knockout apolipoproteina-E hanno mostrato un aumento significativo del contenuto lipidico, rispetto agli animali di tipo selvatico di controllo. Inoltre, il trattamento con aldosterone aumenta il contenuto di macrofagi negli animali knockout come evidenziato dalla colorazione mack-3 e indicando una placca aterosclerotica più infiammata in questi animali rispetto ai topi trattati con veicolo. Tuttavia, il trattamento con aldosterone non altera il contenuto di collagene delle placche aterosclerotiche.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che questo metodo è convalidato solo per i topi apolipoproteina che sono naturalmente inclini a sviluppare aterosclerosi quando alimentati con un colorante aterogenico. Pertanto, non può essere applicato a diversi modelli animali. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'infra-colorazione possono essere eseguiti per caratterizzare l'aterosclerosi in altre regioni aortiche e quantificare il totale del carico aterosclerotico.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'aterosclerosi per esplorare il meccanismo precoce dell'aterogenesi, come l'infiammazione e la disfunzione endoteliale. Non dimenticare che lavorare con composti volatili come isofano e formalina può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come indossare la maschera facciale del laboratorio di sicurezza, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
