Ringraziamo i membri del laboratorio Ninov per commenti sul manoscritto, membri del centro per strutture di pesce e microscopia di Dresda di terapie rigenerative (CRTD) per assistenza tecnica. N.N. è sostenuto da finanziamenti da DFG-CRTD, Cluster of Excellence di TU-Dresden, Fondazione di ricerca tedesca (DFG) e il centro tedesco per la ricerca di diabete (DZD).

Tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate dall'Animal Welfare Act e con permesso della Landesdirektion Sachsen, Germania (AZ 24 – 9168.11-1/2013-14, T12/2016).
1. preparazione
Nota: Questo protocollo è per l'ex vivo imaging di zebrafish isolotto primario da doppi transgenici Tg (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafish. In questa linea transgenica, il promotore di insulina (ins) unità espressione specifica della cellula beta di due transgeni: nls-Renilla-mKO2, che segna il nucleo delle cellule beta con monomerico Kusabira orange 2 (mKO2) fluorescenza; e GCaMP6s15, che emette fluorescenza verde in risposta all'aumento dei livelli di calcio intracellulare. L'espressione della beta-cellula-specifico di GCaMP6s permette di studiare la reattività del glucosio delle cellule beta senza interferenze dalla variazione del calcio che circondano i tipi delle cellule.
<ol><li>Preparare il brodo di fibrinogeno fresco (10 mg/mL) sciogliendo 10 mg di fibrinogeno bovino in 1 mL di Ca2 +/Mg2 +-contenente soluzione salina bilanciata Hanks' (HBSS) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Vortice energicamente fino a quando la polvere di fibrinogeno si dissolve completamente. Mantenere la soluzione a temperatura ambiente per almeno 15 minuti di più. Nota: Lo stock può essere mantenuto a temperatura ambiente per 2 – 3 h. scartare il brodo se la soluzione inizia a polimerizzare e diventa viscosa.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavoro di fibrinogeno (3,3 mg/mL) diluendo il brodo di fibrinogeno triplice in HBSS. Per esempio, mix 300 µ l di brodo di fibrinogeno in 600 µ l di HBSS per preparare 900 µ l di soluzione di lavoro di fibrinogeno.</li>
	<li>Preparare la soluzione di trombina (10 U/mL) sciogliendo 10 unità di trombina in 1 mL di HBSS o fosfato tampone salino (PBS). Nota: Questa soluzione può essere preparata in anticipo, aliquotata in 50 parti di µ l e congelata a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 200 mM D-glucosio soluzione sciogliendo 1,8 g di D-glucosio in 50 mL di acqua. Conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Preparare 300 mM KCl soluzione sciogliendo 1,1 g di KCl in 50 mL di acqua. Conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Procurare piatti con fondo di vetro di diametro 35 mm per gli isolotti di montaggio.</li>
	<li>Per dissezione e montaggio dell'isolotto, utilizzare un microscopio stereo dotato di Lampada fluorescenza e filtro rosso cubo (TRITC: eccitazione: 532 – 554 nm, emissione: 570 – 613 nm; o Texas-rosso: eccitazione: 540-580 nm, emissione: 592 – 667 nm).</li>
	<li>Per l'imaging l'afflusso di calcio nelle cellule beta, uso un microscopio confocale invertito (Zeiss LSM 780 o simili) con 20 X (0,8 NA) aria obiettivo e dotato di un porta targa per i piatti con fondo di vetro di diametro 35 mm.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 200 mg/L di solfonato di tricaina metano (MS222) per eutanasia zebrafish.</li>
	<li>Procurare piastre di Petri di 90 mm per la dissezione di zebrafish.</li>
</ol>2. Zebrafish primaria dell'isolotto dissezione e montaggio
<ol><li>Eutanasia di un pesce tramite incubazione prolungata in MS222. Per questo, delicatamente togliere il pesce dal serbatoio di pesce utilizzando una rete da pesca e viene quindi incubato in una piastra Petri contenente la soluzione di MS222 fino a quando l'animale non mostra nessun movimento opercular (branchie); in genere, questo prende 5 minuti trasferimento il pesce a una piastra Petri contenente la soluzione HBSS con Ca2 +/Mg2 +.</li>
	<li>
Microscopio stereo dotato di una lampada a fluorescenza e cubo di filtro rosso, sezionare la pelle che copre il lato destro dell'addome dell'animale per isolare il pancreas.
	<ol>
<li>Per questo, tagliare la pelle di zebrafish dalla bocca alla pinna anale utilizzando pinze taglienti. Togliere la pelle tagliata per esporre l'addome; Questa cattura espone gli organi interni. Usando la fluorescenza rossa di mKO2 espressione in cellule beta, accertare la posizione degli isolotti da esame visivo sotto il microscopio. Se necessario, rimuovere i lobi del fegato, come essi potrebbero coprire l'isolotto, che lo rende difficile da trovare. Nota: L'isolotto primario si trova nei pressi della regione anteriore dell'addome, in genere sul lato destro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire l'isolotto primario rimuovendo accuratamente il tessuto circostante come fegato e adipociti. Prendere precauzioni per non ferire o poke l'isolotto; dopo l'eliminazione del tessuto circostante, le singole celle sulla superficie dell'isolotto diventano percepibile.</li>
	<li>Dispensare una goccia di 30 µ l di HBSS al centro di un piatto fondo di vetro. Trasferire l'isolotto dissecata questo calo.</li>
	<li>Lavare accuratamente l'isolotto una volta con HBSS e una volta con 30 µ l di soluzione di lavoro di fibrinogeno (3,3 mg/mL). Assicurati di evitare l'essiccazione dell'isolotto durante le fasi di lavaggio, perché in caso contrario si traduce nella morte delle cellule.</li>
	<li>Lentamente e delicatamente aggiungere 10 µ l di soluzione di trombina (10 U/mL). Lasciare intatta per 15 – 20 min. osservare che la goccia di fibrinogeno-trombina diventerà viscoso e leggermente opaco a questo punto l'isolotto e il piatto.</li>
</ol>3. Ex Vivo Live-imaging di intensità di fluorescenza di GCaMP in Zebrafish primaria isolotti
<ol><li>Aggiungere 200 µ l di HBSS sopra lo stampo e mettete il piatto con attenzione sul supporto piastra del microscopio confocale. Utilizzare un obiettivo di aria X, 0,8 NA, 20 per l'imaging confocale. Individuare l'isolotto utilizzando l'opzione di campo chiaro.</li>
	<li>Utilizzo del filtro per fluorescenza rossa per visualizzare la fluorescenza di mKO2 nucleare in cellule beta, concentrarsi sull'isolotto. Diversi nuclei devono essere chiaramente visibili.</li>
	<li>Individuare un chiaro piano di imaging modificando manualmente il piano focale del microscopio confocale in modo da muoversi attraverso lo spessore dell'isolotto lungo l'asse z. Assicurarsi che il piano di formazione immagine contiene un numero sufficiente (50 – 100) delle beta-cellule per l'imaging e la luminosità della fluorescenza mKO2 nucleare è uniforme, soprattutto nel centro dell'isolotto.</li>
	<li>Impostare un'acquisizione sequenza fluorescenza GCaMP6s e mKO2 utilizzando le seguenti impostazioni nel Menu"Smart Setup": GCaMP6s, eccitazione: 488 nm, emissione: 500 – 555 nm, falso-colore: verde (Select "GFP"); mKO2, eccitazione: 561 nm (mCherry), emissione: 570-630 nm, falso-colore: rosso (selezionare "mCherry"). Nota: Con questa impostazione, il canale rosso Registra la posizione dei nuclei delle cellule beta, mentre il canale verde registrerà l'intensità di fluorescenza di GCaMP.</li>
	<li>In modalità"acquisizione" impostare la risoluzione dell'immagine a 1.024 x 1.024 pixel, velocità a 10 e con una media di 1. Iniziato un continuo registrazione selezionando l'opzione per "Time-series", e impostando la "durata" per 500 cicli, con circa 2 s tempo di acquisizione per ogni frame. Nota: I primi 50 fotogrammi della serie tempo corrispondono all'attività delle beta-cellule a concentrazione nel glucosio di 5 mM. Questa è la risposta della linea di base. Una risposta della cellula beta mostrerà inceratura e calante dell'intensità di fluorescenza verde con tempo. Abbiamo osservato che alcuni (1 – 5%) delle beta-cellule oscillano al glucosio di 5 mM.</li>
	<li>
Tenere d'occhio il ciclo di formazione immagine. Dopo i primi 50 fotogrammi, aumentare la concentrazione di glucosio della soluzione circostante fino a 10 mM senza arrestare la registrazione.
	<ol>
<li>Senza perturbare l'acquisizione dell'immagine, delicatamente Pipettare 5 µ l della mM 200 D-glucosio soluzione sulla superficie del gel che tiene l'isolotto. Acquisire 150 fotogrammi al glucosio di 10 mM. Nota: L'aumento della concentrazione di glucosio aumenterà il numero delle beta-cellule che subiscono le oscillazioni fluorescente GCaMP nel verde del canale.</li>
		<li>Garantire che i nuclei delle cellule rimangono stabili durante il processo. Se l'isolotto è agitazione estesamente durante l'acquisizione e i nuclei sono in movimento fuori dal piano focale, scartare il campione (se necessario).</li>
		<li>Attendere un sufficiente periodo di tempo per attivare la polimerizzazione dello stampo del fibrinogeno-trombina al fine di garantire la stabilità dei campioni successivi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A 200 fotogrammi, aumentare ulteriormente la concentrazione della soluzione a 20 mM pipettando delicatamente 10 µ l di 200mm soluzione di D-glucosio. Acquisire 150 fotogrammi per la concentrazione di 20 mM.</li>
	<li>Dopo 350 telai, depolarizzare l'isolotto con 30 mM di KCl. Per questo, aggiungere 20 µ l di soluzione di KCl riserva di 300 millimetri. In questa fase, osservare che le oscillazioni di fluorescenza GCaMP6s verranno interrompere e difficoltà ad alta intensità; beta-cellule che non hanno risposto al glucosio possono inoltre essere visualizzato un aumento nell'intensità di fluorescenza verde con l'aggiunta di KCL.</li>
</ol>4. quantificazione degli GCaMP traccia di fluorescenza per Beta-cellule individuali
Nota: Per tracciare e quantificare le risposte delle beta-cellule individuali ai diversi livelli di glucosio, quantificare l'intensità di fluorescenza di GCaMP per l'intero periodo di formazione immagine. Quantificazione è effettuata al cellulare ad alta risoluzione. Per questo, è necessario utilizzare FIJI20 per estrarre i valori di intensità di fluorescenza GCaMP dalle immagini (punti 4.1-4.6) e software di foglio di calcolo o R21 per eseguire l'analisi (passaggi 4.8-4.9).
<ol><li>Aprire il file di immagine in Figi utilizzando "LSM casella degli strumenti". Per questo, selezionare "Plugin | LSM Toolbox | Visualizzare la casella degli strumenti LSM". Nellacasella"LSM", fare clic su "Open LSM" e selezionare il file di immagine. Nota: Per i formati non supportati da "LSM Toolbox", convertirli prima di tiff per analisi.</li>
	<li>Estrarre le risposte delle cellule utilizzando lo strumento area di interesse (ROI) in FIJI. Aprire il "ROI Manager" nel menu "Analizza" sotto "Strumenti". Disegnare manualmente il ROI utilizzando lo "strumento di selezione poligono" situato nella barra degli strumenti.</li>
	<li>Disegnare il ROI nel canale del rosso in cui sono visibili i nuclei delle cellule beta. Selezionare il ROI tale che copre un'area che è più grande di nucleo di una cellula al fine di includere alcuni di citoplasma della cellula. Assicurarsi che la posizione di ROI è coerenza tra i fotogrammi e se necessario, regolare la posizione.</li>
	<li>Aggiungere il ROIs selezionato al "manager di ROI" cliccando sul pulsante "Aggiungi [t]". Selezionare e aggiungere più ROIs il ROI per l'ottenimento di dati su più celle.</li>
	<li>Successivamente, dal menu "Analizza", selezionare "Set di misurazioni". Selezionare "Densità integrata" per la specifica estrazione dell'intensità di fluorescenza totale all'interno dell'area.</li>
	<li>Spostare il canale verde contenente la fluorescenza di GCaMP e selezionare "Multi misura" in "Gestione ROI". Nota: Ciò fornirà le misure di intensità per le cellule in tutto il tempo-serie.</li>
	<li>Nel caso in cui la posizione di ROI deve essere regolata a causa del movimento dell'isolotto, compilare manualmente le misure di intensità in fotogrammi diversi. Copiare e incollare i valori in un foglio di calcolo separato.</li>
	<li>Ottenere il timestamp dei frame immagine da "LSM Toolbox". Uso "Applica timbri | Applica timbri t | Nome del file | Dump di file di testo"per ottenere il timestamp. Salvare i timestamp usando l'opzione "Salva come", o li copia nel foglio di lavoro.</li>
	<li>Al momento di compilare i valori di intensità per tutte le celle, è necessario eseguire l'analisi una cella alla volta o automaticamente (ad esempio, utilizzando le formule di Excel o R).</li>
	<li>
Analizzare le singole celle in due passaggi.
	<ol>
<li>Nel primo passaggio, calcolare l'intensità di fluorescenza sopra la linea di base. A tal fine, è necessario calcolare l'intensità di fluorescenza della linea di base (F0) come la media delle intensità di fluorescenza per i primi 50 fotogrammi (glucosio 5 mM). Quindi sottrarre la linea di base (F0) dall'intera serie temporale (F-F0). Nota: alcune cellule possono mostrare chiare oscillazioni GCaMP sotto basale del glucosio, che in genere continuano a seguito di una stimolazione con concentrazioni più elevate. Per tali cellule, è solo possibile stimare F0 prendendo l'intensità media dei fotogrammi iniziali in cui le cellule hanno mostrato un calo in fluorescenza.</li>
		<li>Nella seconda fase dell'analisi, è possibile ottenere l'intensità di fluorescenza GCaMP finale normalizzando l'intensità di fluorescenza. Nota: Questo viene eseguito per rimuovere le differenze tra gli isolotti da diversi animali. Individuali degli isolotti visualizzare diversi livelli di emissione di fluorescenza su stimolo del glucosio.</li>
		<li>Normalizzare l'intensità di fluorescenza dividendo con il più alto valore di intensità. Per questo, calcolare l'intensità di picco (Fmax – F0) e dividere i valori basali sottratto per intensità di picco per produrre l'intensità di fluorescenza GCaMP finale (F – F0) / (Fmax – F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scartare le cellule che non presentano una variazione di intensità dopo stimolazione con KCl, come potrebbero essere integro o danneggiato.</li>
	<li>Per eseguire l'analisi (passaggi 4.9 – 4.10) in R, utilizzare lo script di R (plotcelltrace. R) fornito con questo manoscritto.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Qui dimostriamo una tecnica per la quantificazione-risposta delle cellule beta glucosio a cella singola risoluzione. Ciò è reso possibile da monitorare la concentrazione di calcio intracellulare utilizzando un indicatore di calcio geneticamente codificati, GCaMP6s. L'attività della beta-cellula è acquisito ex vivo montando l'isolotto in uno stampo di fibrinogeno-trombina. Un passaggio fondamentale del protocollo è la stabilità dello stampo. Tempo sufficiente deve essere dato per il fibrinogeno sciogliere nella soluzione di HBSS. Senza questo, la muffa non polimerizza sufficientemente per fornire la stabilità durante la sessione di imaging. Un isolotto montato in stampo di fibrinogeno-trombina e immersi in terreni di coltura delle cellule possa rimanere vitale per almeno una settimana (dati non mostrati). Alternative allo stampo di fibrinogeno-trombina, come dell'agarosi di basso-fusione, possono essere utilizzate per montare l' isolotto22. Un altro parametro critico è la dissezione dell'isolotto. Durante questo passaggio, il tessuto che circonda l'isolotto deve essere rimosso senza ferire o frugando l'isolotto. Una dissezione abile è dotato di pratica.
Una limitazione del protocollo imaging è la limitazione a un piano confocale dell'isolotto. Questo viene fatto per catturare le dinamiche di afflusso del calcio all'interno di singole cellule beta. Uno Z-stack attraverso l'intero spessore dell'isolotto conduce a bassa velocità e perdita di segnale oscillatorio da singole celle imaging. Questa limitazione potrebbe essere migliorata utilizzando mezzi più veloci di imaging confocale come microscopia di disco rotante, per consentire di catturare le dinamiche del calcio in 3 dimensioni. Un'altra frontiera sarebbe in vivo del calcio imaging12. La natura trasparente di embrione di pesce zebra o l'uso di ceppi di pigmento-meno di zebrafish adulti23 potrebbe aprire la possibilità per in vivo imaging in futuro.
L'imaging di attività della beta-cellula ad alta risoluzione spaziale e temporale consente di indagare l'eterogeneità funzionale tra beta-cellule individuali. Questo approccio può aiutare a far luce sull'esistenza di sub-popolazioni beta-cellula. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato l'esistenza delle sottopopolazioni nelle dimensioni nominali omogenee beta-cellule24,25,26. Ex vivo imaging può essere combinato con reporter genetici per la caratterizzazione della risposta della sub-popolazione a glucosio. Inoltre, combinando il programma di installazione di imaging con stimolo farmacologico può consentire per screening di composti che potrebbero migliorare la funzionalità delle cellule beta.
In sintesi, la tecnica presentata qui permette la quantificazione e confronto tra la velocità di risposta del glucosio per beta-cellule individuali. Fornisce una finestra diretta nella funzionalità delle cellule beta, un parametro importante nello sviluppo del diabete.

La nostra glicemia è mantenuta in un intervallo ristretto, in gran parte dovuto la funzione del pancreas endocrino. Il ruolo endocrino del pancreas è eseguito da degli isolotti di Langerhans, che contengono cellule disecrezione. Il beta-cellule secernenti insulina sono responsabili della riduzione dei livelli di glucosio nel sangue dopo un pasto contenente carboidrati. Secrezione di insulina insufficiente da beta-cellula può causare diabete1, che è caratterizzato da glicemia alta sostenuta. Tipo 1 e diabete di tipo 2, che attualmente affligge più di 400 milioni di persone nel mondo, conduce alla morbosità ed alla mortalità2. Indagando i fattori molecolari e ambientali che contribuiscono alla disfunzione beta-cellulare, comprenderemo meglio come diabete di tipo 2 inizia e progredisce. Inoltre, la capacità di differenziare cellule staminali umane in beta-cellule funzionali in vitro può fornire una fonte di nuove cellule beta per le terapie di sostituzione cellulare nel diabete di tipo 1. A tal fine, è importante studiare la funzione beta-cellulare e la maturazione in organismi modello genetico al fine di acquisire le conoscenze necessarie per rendere funzionale beta-cellule in un piatto.
Funzionalità delle cellule beta può essere monitorato a livello di intero-isolotto di quantificare la quantità totale di insulina secernuta in risposta a stimolazione del glucosio. Questo approccio cumulativo studia l'isolotto come un singolo gruppo di cellule senza differenziare le singole proprietà di una cella. Tuttavia, l'analisi delle risposte del glucosio delle cellule beta individuali ha rivelato una diversità nelle proprietà funzionali delle cellule beta e la presenza di eterogeneità3. Per valutare la funzione delle beta-cellule individuali, è possibile monitorare i cambiamenti intracellulari che portano alla secrezione di insulina4. La secrezione dell'insulina è preceduta da un'entrata del glucosio nelle cellule beta. Il glucosio che entra nelle cellule beta viene rapidamente metabolizzato all'ATP. Più alte concentrazioni di ATP intracellulare diminuiscono la probabilità aperta di canali di ioni del potassio ATP-sensibili che portano alla depolarizzazione della cellula beta. Depolarizzazione apre i canali ionici voltaggio-dipendenti del calcio e aumenta il calcio intracellulare. A sua volta, calcio innesca l'esocitosi di insulina, che viene rilasciato nella circolazione e abbassa i livelli di glucosio promuovendo l'utilizzazione del glucosio5,6,7.
Diverse strategie sono state applicate per studiare la funzione delle cellule beta, tra cui monitoraggio del potenziale di membrana8, visualizzazione diretta di insulina-vescicole esocitosi9e la quantificazione di intracellulare di Ca2 + afflusso come proxy per glucosio-reattività10. Fra loro, la formazione immagine del intracellulare di Ca2 + offre il vantaggio di upscaling l'analisi a più celle individuali all'interno stesso dell'isolotto11,12, consentendo per un confronto diretto della glucosio-responsività tra beta-cellule individuali. Concentrazione intracellulare di Ca2 + possa essere monitorata utilizzando coloranti fluorescenti sensibili al calcio13 o geneticamente codificato calcio indicatori (GECIs)14. Considerando che il calcio-indicatore coloranti mancanza cellula-tipo specificità, GECIs può essere espressa in uno specifico tipo cellulare di promotori specifici. Inoltre, la nuova generazione di GECIs, come GCaMP6, fornisce il migliore rapporto segnale-rumore insieme più veloce dinamica temporale15. Qui descriviamo l'utilità della nuovo-generazione di GECIs, in particolare GCaMP6s, visualizzare calcio in cellule beta a cella singola risoluzione. Applichiamo questo metodo fino all'isolotto di zebrafish primario come il nostro modello di scelta. Durante lo sviluppo embrionale, beta-cellule nell'isolotto primaria provengono da dorsale e ventrale del pancreas boccioli16. L'isolotto primario si trova in una posizione anatomica stereotipata all'interno del pancreas di zebrafish, consentendo la facile identificazione e isolamento. Beta-cellule nell'isolotto primaria sono necessari per la regolazione del glucosio, come loro ablazione genetica conduce a iperglicemia17,18. Inoltre, queste cellule beta diventano glucosio-reattiva durante i primi zebrafish sviluppo19. Questo protocollo può essere applicato anche per gli isolotti secondari, che si formano durante le fasi di post-embrionale di imaging. Il protocollo permette di immagine beta-cellule ex vivo, alle successive fasi di sviluppo e sotto le concentrazioni di glucosio definiti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:276px;">Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">By request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">495015-0001-000</td>
			<td style="width:291px;">SteREO Discovery.V8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">423013-9010-000</td>
			<td style="width:291px;">Illuminator HXP 120 V</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Red Filter Cube</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">000000-1114-462&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Filter set 45 HQ TexasRed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">LSM 780</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine fibrinogen</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt solution)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm diameter glass-bottom dishes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">E10521&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11445-12</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">R, version 3.2.4</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">RStudio</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">plotcelltrace.R</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">A custom script provided with the manuscript</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

Beta-cellule pancreatiche rispondono all'aumento delle concentrazioni di glucosio nel sangue che secerne l'ormone insulina. La disfunzione delle cellule beta porta a iperglicemia e conseguenze gravi, pericolo di vita. Comprendere come le beta-cellule operano in condizioni fisiologiche e quali fattori genetici ed ambientali potrebbero causare loro disfunzione potrebbe portare a migliori opzioni di trattamento per i pazienti diabetici. La capacità di misurare i livelli del calcio in cellule beta serve come un importante indicatore della funzione beta-cellulare, come l'afflusso di calcio ioni Trigger rilascio di insulina. Qui descriviamo un protocollo per il monitoraggio l'afflusso di calcio glucosio-stimolata in zebrafish beta-cellule utilizzando GCaMP6s, un sensore codificato geneticamente di calcio. Il metodo consente di monitorare le dinamiche del calcio intracellulare con risoluzione di singole cellule in isolotti ex vivo montato. La glucosio-risposta delle cellule beta entro l'isolotto stesso possa essere catturata contemporaneamente sotto le concentrazioni di glucosio differenti, che suggerisce la presenza di eterogeneità funzionale tra zebrafish beta-cellule. Inoltre, la tecnica fornisce alta risoluzione temporale e spaziale, che rivela la natura oscillatoria dell'afflusso del calcio su stimolo del glucosio. Il nostro approccio apre le porte per utilizzare zebrafish come modello per studiare il contributo di fattori genetici ed ambientali alla funzione beta-cellulare e disfunzione.

Utilizzando il protocollo sopra descritto, sono state analizzate le risposte del glucosio delle cellule beta in un isolotto da un 45 giorni post-fertilizzazione (dpf) zebrafish. Per questo, l'isolotto primario è stato sezionato da un animale eutanasizzato e montato nello stampo fibrinogeno-trombina in un piatto fondo di vetro. L'isolotto è stato immerso in HBSS contenente glucosio di 5 mM. La concentrazione di glucosio è stata aumentata in modo graduale per 10 mM e 20 mM. Le risposte delle beta-cellule per l'aumento delle concentrazioni di glucosio sono state registrate. Infine, le cellule beta erano depolarizzate utilizzando 30 mM KCl (Figura 1). La depolarizzazione utilizzando KCl induce voce calcio in beta-cellule sane.
Utilizzando un software di analisi dati e FIJI, l'intensità di fluorescenza GCaMP6s delle beta-cellule individuali viene estratta e normalizzato (Figura 2). Come si vede dalla traccia di intensità di fluorescenza, beta-cellule individuali Visualizza oscillazioni a fluorescenza GCaMP6s su stimolo del glucosio, che si ferma su stimolo di KCl. La tecnica fornisce una risoluzione cellulare della glucosio-reattività di beta-cellula e una finestra nella loro funzionalità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figura 1: Ex vivo live-imaging di afflusso del calcio utilizzando GCaMP6s in zebrafish beta-cellule. Un isolotto primario da Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) era montato in stampo di fibrinogeno-trombina e incubate con glucosio 5 mM (basale). Le cellule beta sono state etichettate con un pennarello rosso nucleare, mentre la fluorescenza di GCaMP6s è presente nel canale verde. L'isolotto è stato stimolato con una rampa di glucosio costituito da incubazione sequenza con 10 e 20 mM D-glucosio e depolarizzate tramite l'aggiunta di 30 mM che KCl. sagittarie contrassegno singole beta-cellule cui attività è stata analizzata. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figura 2: normalizzato GCaMP6s fluorescenza intensità-traccia per singole cellule beta. Normalizzato. GCaMP6s fluorescenza intensità-traccia per la beta-cellule contrassegnato con le frecce nella Figura 1. L'asse x indica il tempo in secondi. Nella parte superiore, bar raffigurano la concentrazione di glucosio e KCl nel medium HBSS. L'asse y indica l'intensità di fluorescenza normalizzata durante la serie temporale. Per questo, intensità della linea di base (F0) è calcolata come intensità media durante l'incubazione in glucosio di 5 mM. Questo viene sottratto da tutti i dati di serie temporali (F - F0). La previsione di intensità-over viene normalizzata dall'intensità massima visualizzato dalla cella (F - F0) / (Fmax- F0). La traccia normalizzata Mostra una risposta oscillatoria delle beta-cellule a glucosio, che si stabilizza quando le cellule sono depolarizzate con 30 mM KCl. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Funzionalità beta-cellula è importante per l'omeostasi del glucosio nel sangue, che viene valutato a cella singola risoluzione utilizzando un reporter codificato geneticamente per afflusso del calcio.

Analisi della funzione Beta-cellulare usando la formazione immagine del calcio cella singola risoluzione in Zebrafish isolotti

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  TU Dresden. Funzionalità beta-cellula è importante per l'omeostasi del glucosio nel sangue, che viene valutato a cella singola risoluzione utilizzando un reporter codificato geneticamente per afflusso del calcio.

Video: Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

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Ricerca

Biologia

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

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High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

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Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

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CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...