Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del programma di ricerca di Monsanto mais Diabrotica conoscenza, assegnare un numero AG/1005 (a MDL e YC) e fondi di Start-up per MDL dal NCSU. FC è stata sostenuta da sovvenzioni da parte mais Diabrotica Knowledge Research Program di Monsanto (AG/1005) e la National Science Foundation, concedere numero MCB-1244772 (MDL). Gli autori non dichiarano interessi concorrenti. FC e MDL ideato e progettato gli esperimenti; FC, PW e SP effettuati gli esperimenti; FC e MDL ha analizzato i risultati; e FC, NG e MDL ha scritto il manoscritto. Ringraziamo Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski per loro assistenza di esperti in selezione WCR. Ringraziamo anche il dottor Wade French (USDA-ARS, laboratorio di ricerca agricola Centrale Nord, Brookings, SD) per le spedizioni di uova di stabilire colonie di laboratorio e fornendo protocolli di allevamento.

1. a livello di Colonia allevamento del WCR adulti
<ol><li>Ottenere una quantità sufficiente di adulti WCR (500-1.000) da un laboratorio affidabile azienda o ricerca (Vedi Tabella materiali per un esempio) e posto in una gabbia di3 cm 30. Nota: È consigliabile l'uso di un ceppo non-diapausing.</li>
	<li>Preparare la dieta artificiale WCR, seguendo il protocollo del produttore e versare uno strato dello spessore di cm 1 in un contenitore di 38 oz (Vedi Tabella materiali). Dopo la miscelazione, è possibile memorizzare inutilizzato dieta a 4 ° C fino a 2 mesi.</li>
	<li>Mettere una capsula Petri (100 x 15 mm) con adulti dieta (10-15 g) in una gabbia di3 cm 30. Aggiungere più dieta quando il cibo è scarso o asciutto.</li>
	<li>Mettere in un pallone (300 mL) con acqua, coperto con un batuffolo di cotone, che viene utilizzato per tenere in posizione un rotolo di cotone (6 "x 3/8"), per servire come una fonte d'acqua. Cambiare l'acqua quando sta per esaurirsi.</li>
	<li>Mantenere WCR a 26 ° C con 60% di umidità ed un 14:10 luce ciclo in un insetto allevamento incubatrice.</li>
</ol>2. gruppi di raccolta e di allineamento
<ol><li>Prenotare una camera di raccolta di uovo utilizzando 1% agar in acqua in una sterile 100 x 15 mm2 piastra di Petri. Conservare a 4 ° C dopo l'agar solidifica.</li>
	<li>Per raccogliere le uova appena deposte, posizionare un singolo strato di carta da filtro, seguita da 4 strati di garza (ogni taglio al formato) sulla superficie dell'agar (Figura 1A). Nota: Garza può essere riutilizzata, dopo essere stato lavato in candeggina e sterilizzato nell'autoclave, ma non è necessario eseguire questa operazione per il primo utilizzo. Carta da filtro non dovrebbero essere riutilizzato e non ha bisogno di essere sterilizzato.</li>
	<li>Luogo piastra di raccolta uova in gabbia WCR più tardi nel corso della giornata come possibile (fine della giornata lavorativa) e coprire con una tenda di carta stagnola. Lasciare durante la notte. Nota: Avere le luci da 10 a deposizione delle uova 12 A.M. (14 h) ritardi, facilitando così la raccolta delle uova più giovane per il microinjection senza richiedere personale di laboratorio a luogo camera di raccolta in gabbia a tarda notte.</li>
	<li>Rimuovere la vaschetta di raccolta uova circa 8 o 9</li>
	<li>Usare pinze per raccogliere 1 strato di garza in un momento e il luogo in un becher (500 mL) di acqua. Lavare le uova al largo di garza di mescolando delicatamente (Figura 1B e 1C).</li>
	<li>Utilizzare una pipetta per trasferire le uova in un altro Becher (500 mL) di acqua. Ripetere 2-3 volte per pulire le uova.</li>
	<li>Utilizzare la pipetta per trasferire uova su carta da filtro (Figura 1), riducendo al minimo la quantità di riporto di acqua.</li>
	<li>A listarelle nero carta da filtro largo come un vetrino e nastro saldamente alla diapositiva per assicurarsi che la carta appoggiato in piano (Figura 2A). Nota: Nero carta da filtro aiuta a migliorare la visibilità sotto il microscopio, riducendo la quantità di luce riflessa.</li>
	<li>Applicare la colla non tossico (per un esempio, vedere Tabella materiali ) per la carta da filtro in linee sottili (Figura 2B). Mantenere le linee di colla più sottile rispetto al diametro di un uovo per evitare che le uova rivestite in colla.</li>
	<li>Utilizzare un pennello fine per spostare delicatamente WCR uova uno per uno da loro carta da filtro per la linea di colla. Tenta di deporre le uova sulla colla prima si asciuga e mantenere distanza di almeno un uovo tra ogni uovo.</li>
	<li>Massimizzare l'efficienza di iniezione inserendo più righe di uova nella diapositiva di una carta da filtro (Figura 3).</li>
	<li>Dopo tutte le uova sono disposte su carta da filtro, attendere fino a quando tutta la colla asciuga prima microiniezione. Nota: Per la trasformazione di germline e per editing genomico CRISPR/Cas9-mediata, iniettare tutti gli embrioni di mezzogiorno (12) affinché l'embrione più antica è vecchio non più di 19 h. Tuttavia, per RNAi, non c'è nessuna limitazione di tempo perché, a WCR, dsRNA può spostarsi tra le celle. Infatti, per RNAi, embrioni di invecchiamento potrebbero comportare meglio tassi di sopravvivenza.</li>
</ol>3. preparazione del plasmide DNAs e aghi per iniezione
<ol><li>Preparare il DNA del plasmide supercoiled alta qualità utilizzando un'endotossina-libero commerciale kit (Vedi Tabella materiali per un esempio).</li>
	<li>Per preparare la soluzione per iniezione, controllare la concentrazione di ogni plasmide e quindi combinare plasmide helper (concentrazione finale di 250 ng / µ l), donatore plasmide (concentrazione finale di 750 ng / µ l) e buffer di rosso fenolo (concentrazione finale di 20%). Vortice la soluzione brevemente e centrifugare per 3 min a velocità massima per far precipitare le particelle che potrebbero intasare l'ago.</li>
	<li>Tirare aghi di vetro borosilicato (O.D. 1 mm, D.I. 0,58 mm, lunghezza 10 cm) utilizzando un estrattore di Flaming/marrone tipo micropipetta. Per deposito, fissare aghi tirati il nastro adesivo su due lati in una capsula di Petri o altro contenitore chiaro. Nota: Per il sistema di estrattore micropipetta, le impostazioni utilizzate erano: calore = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Recupero informazioni l'ago per iniezione utilizzando un micro-caricatore suggerimento (Vedi Tabella materiali) per dispensare 0,5 - 1,0 µ l giù all'interno dell'ago, vicino l'estremità appuntita. Rimuovere le bolle dalla punta dell'ago, qualora si verificassero.</li>
	<li>Il porta-aghi, inserire l'ago per iniezione.</li>
	<li>Aprire la punta dell'ago rompendo delicatamente con un bel paio di pinze, o delicatamente toccando/trascinando la punta sul vetrino coprioggetto o vetro. Nota: L'obiettivo è di avere l'apertura più piccola che ancora permette il mix di iniezione a venire fuori (aperture più piccole richiedono generalmente più alta pressione di iniezione). Aghi smussati non richiedono questo passaggio, poiché essi sono già aperti.</li>
</ol>4. microinjection e cura post-iniezione
<ol><li>Usando un pennello fine, accuratamente bagnare la superficie di 1-3 uova con acqua sterile, inserire l'ago e iniettare la soluzione. Iniettare ogni uovo prima che la superficie si asciughi. Cercare l'aspetto una piccola quantità di colore rosso all'interno di uova durante l'iniezione per indicare il successo microiniezione. Schiacciare o rimuovere eventuali uova che guarda danneggiato, vuoto, o in caso contrario non può essere iniettata. Nota: Anche se la pressione di iniezione variabile in base alla dimensione di foro di spillo, 10-13 psi è un buon punto di partenza.</li>
	<li>Dopo tutte le uova sono iniettate, rimuovere la carta da filtro dal vetrino.</li>
	<li>Posizionare il filtro di carta sulla superficie di un piatto di 1% agar (descritto sopra).</li>
	<li>Usare paraffina plastica pellicola per sigillare il piatto e messo in un insetto di 26 ° C allevamento incubatore per 12 giorni. Nota: Il film di paraffina aiuta a prevenire la contaminazione incrociata di muffa tra piatti. Tuttavia, qualsiasi altro trattamento per prevenire la crescita batterica e muffa potrebbe ridurre la sopravvivenza degli embrioni iniettati.</li>
</ol>5. coltura e da cova di embrioni
<ol><li>Avviare il controllo di embrioni 12 giorni dopo l'iniezione per le larve appena schiuse e continuare ogni giorno per le prossime 2 settimane.</li>
	<li>Trasferire le larve, usando un pennello fine, a una casella di allevamento con cereale germogliato e suolo. Nota: Muffa potrebbe crescere nel piatto di agar, ma le larve si schiudono ancora nella maggior parte dei casi. Cercare larve attentamente all'interno dello stampo per catturarli tutti. Alcune larve potrebbero spostare il coperchio del piatto e potrebbero rimanere bloccati nella condensazione.</li>
	<li>Posteriore larve a 26 ° C, seguendo standard WCR allevamento metodi25.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Anche se microinjection di WCR con RNAds ai fini della RNAi è stato segnalato9, questo è il primo protocollo per stabilire le migliori pratiche per microinjecting precellular embrioni WCR, un processo critico per lo svolgimento di germline trasformazione e/o CRISPR/Cas9 genoma di editing in questa specie. Successo microiniezione di embrioni WCR è dipendente da molti fattori, come l'efficienza di trasformazione. Discussi di seguito alcune delle questioni principali stanno influenzando il risultato dell'utilizzo di questo protocollo per trasformazione di germline in questo coleottero.
Ottenere embrioni precellular Come accennato in precedenza, DNA non attraversa le membrane cellulari che il dsRNA modo possibile. Ciò significa che è di importanza critica che DNA, mRNA, e/o proteine essere iniettato prima cellularization si verifica. Poiché il tempo di iniezione è fondamentale, era importante determinare una finestra probabile per il microinjection successo basato su quanto tempo ci vuole il nondiapausing WCR ceppo30 per completare l'embriogenesi. Questo è stato calcolato basato su studi dettagliati della tempistica della fase blastoderm sinciziale in un altro scarabeo, tribolio Tribolium. In Tribolium, cellularization si verifica ~ 8 h post Deposita uovo a 30 ° C31. Dato che ci vogliono giorni ~3.5 per Tribolium per l'embriogenesi completa a 30 ° C, cellularization avviene un decimo del modo nel processo. Poiché gli embrioni WCR prendono quasi 2 settimane per sviluppare, cellularization non può verificarsi fino a quando il secondo uovo post giorno laici. Di conseguenza, è stato presupposto che la finestra per il microinjection successo è almeno 24 h di lunga, che è utile, poiché WCR richiedono uova durante la notte per fornire una quantità sufficiente di uova per il microinjection. Mentre questo metodo è stato usato per transgenesi successo27, è ipotizzabile che i risultati potrebbero essere migliorati iniettando più giovani embrioni, purché la manipolazione di embrioni molto presto non causare loro un danno.
Concentrazione e la qualità del DNA Non è sorprendente che la concentrazione di DNA svolge un ruolo fondamentale nella trasformazione di successo. Si è a lungo pensato che mantenendo la concentrazione finale del plasmide DNA inferiore a 1 mg/mL è stato necessario per evitare la potenziale tossicità al embrioni iniettati32. Anche se ora non è chiaro se i problemi di tossicità del passato erano dovuto il DNA stesso o invece erano il risultato di contaminanti derivanti dal processo di purificazione del plasmide, questa regola è stata fermamente rispettate per due decenni. Tuttavia, abbiamo recentemente scoperto che superiore a 1 mg/mL limite era non solo possibile, ma anche che in questo modo può ottenere maggiore velocità di trasformazione, che porta alla speculazione che l'assenza di tossicità dell'uovo può essere dovuto gli avanzamenti in kit di purificazione del plasmide, con conseguente meno contaminanti. Dato il tempo necessario per posteriore WCR, qualsiasi aumento nei tassi di trasformazione è utile, anche se il risultato è leggermente più alti tassi di mortalità.
Addolcimento superficie dell'uovo prima di microiniezione A differenza di Tribolium, la superficie più esterno (corion) di un embrione WCR deve essere ammorbidita prima microiniezione. Questo è un passo fondamentale anche quando si utilizzano aghi di quarzo. Idealmente, acqua dovrebbe essere applicato a un singolo embrione immediatamente prima dell'iniezione, ma può essere applicato a gruppi di 2 o 3 embrioni alla volta se microiniezione può essere realizzato prima di chorions reharden. Senza questo passaggio, aghi generalmente riuscirà a penetrare il corion, causando quindi il tentativo di iniezione a fallire e potenzialmente danneggiare la punta dell'ago. Inoltre, se l'ago dovesse penetrare con successo un corion asciutto, la soluzione per iniezione in genere perdite indietro fuori a causa della pressione all'interno dell'embrione sono superiori a pressione ambiente. È, tuttavia, facile distinguere asciutto da embrioni (ammorbiditi) bagnati. In particolare, quando è asciutto, gli embrioni hanno un distinto rigida, forma rotonda, mentre l'aggiunta di acqua li induce a perdere il loro aspetto sferico. Rammollimento non solo permette l'ago penetrare senza fatica il corion, ma riduce anche la pressione all'interno dell'embrione abbastanza che la soluzione di iniezione non fuoriuscire.
Umidità e muffa Embrioni iniettati si svolgono in un ambiente caldo, umido durante l'embriogenesi. Queste condizioni non solo offrono l'ambiente ideale per lo sviluppo WCR, ma anche promuovono lo sviluppo della muffa. Durante questo periodo di due settimane, la muffa si sviluppa frequentemente sui piatti agar alloggiamento gli embrioni WCR. Purtroppo, gli embrioni richiedono elevata umidità e tentativi di ridurlo provocato tassi molto più bassi di tratteggio. È interessante notare che, la presenza di muffa generalmente ebbe poco impatto sulla schiusa, con la maggior parte degli embrioni da cova senza problemi. Inoltre, trattamenti antifungini sono dannosi per gli embrioni WCR, quindi il modo migliore per ridurre la crescita di muffa sembra essere quella di evitare la contaminazione; pulizia strumenti, contenitori e sistema di microiniezione prima dell'uso e cercando di mantenere il tempo trascorso microinjecting al minimo, dal momento che le spore della muffa sono prevalenti in molti ambienti di laboratorio.
Conclusioni Questo protocollo è destinato a permettere ai ricercatori più impiegare tecnologie transgeniche nella loro ricerca WCR e speriamo che sarà di aiuto nello sviluppo di tecnologie basate su transgenetica aggiuntive per l'utilizzo in questo insetto. Sofisticati basati su transgenetica esperimenti condotti in Tribolium potrebbero potenzialmente essere adattati per WCR, tra cui mutagenesi33 e basati su CRISPR genoma34di editing. Poiché queste tecniche richiedono la microiniezione degli embrioni precellular, questo protocollo sarà utile non solo per studi di genomica funzionale basato su trasposoni e/o CRISPR/Cas9-mediata del genoma modifica ma anche per strategie di lotta basata su genetica 35 , 36.

Diabrotica del mais (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, è un parassita importante di mais1. È interessante notare, WCR sembra superare controllo misure più rapidamente di artropodi di interesse agrario più poiché essi non solo adattarsi fisiologicamente ma anche comportamentale2,3,4,5, 6. nell'ultimo decennio, interferenza del RNA (RNAi), un potente strumento di genomico funzionale, è stato studiato come un metodo di controllo potenziale per WCR7,8ed è stato utilizzato anche come mezzo per studiare il gene funzione9. Tuttavia, mentre RNAi è effettuato frequentemente dal microinjection di RNA double-stranded (dsRNA) in altre specie, basati su iniezione RNAi è raro in WCR. In realtà, ci sono soltanto alcuni rapporti di RNAi tramite microiniezioni di dsRNA in WCR9. Il motivo è che WCR possono raggiungere livelli elevati di gene atterramento tramite ingestione di dsRNA7,10, permettendo anche lo studio degli effetti embrionali di alimentazione dsRNA di madre11. Mentre questo metodo rende WCR un ottimo soggetto per analisi genomica funzionale tramite RNAi, ha rallentato progressi nello sviluppo di metodologie per il microinjection embrionale in questa specie.
Nonostante la potenza del RNAi, ci sono alcuni svantaggi. Ad esempio, non tutti i geni rispondono ugualmente a RNAi. Questa variabilità può rendere l'interpretazione dei risultati di un'analisi di genomica funzionale più difficile. Inoltre, RNAi è transitoria e non genera mutazioni ereditabili. D'altra parte, la trasformazione di germline, un altro strumento di genomico funzionale, può generare mutazioni ereditabili tramite inserimento di un elemento trasponibile contrassegnato nella genoma12,13. Questo rende la trasformazione di germline un ottimo strumento per la creazione di ceppi mutanti per uso a lungo termine studi genetici. Trasformazione può essere utilizzata anche per salvare una mutazione formulando una copia funzionale del gene per un genoma mutante14. Inoltre, la trasformazione di germline è la pietra angolare di un'ampia varietà di tecniche di genetica molecolare. Oltre a buttare giù e/o salvataggio di funzione del gene, germline trasformazione può essere utilizzata per enhancer intrappolamento15, gene dell'intrappolamento16, espressione ectopica basata su Gal417e genoma mutagenesi18.
Più recentemente, sono stati sviluppati strumenti che consentono la modifica del genoma sofisticato. Questi strumenti includono trascrizione Activator-Like effettrici nucleasi (TALEN) e il sistema CRISPR/Cas9-nucleasi19,20. Il vantaggio di questi nuovi strumenti è che essi offrono ai ricercatori la capacità di indurre una rottura del DNA double-stranded in quasi qualsiasi posizione all'interno di quasi qualsiasi genoma. Una volta indotta, queste rotture possono essere riparate attraverso entrambe le estremità non-omologo entrare, che possono introdurre le eliminazioni o inserimenti nel gene mirato, o riparazione di omologia-diretto, che in presenza di un costrutto ingegnerizzato, può catalizzare la sostituzione dell'intero geni o regioni genetiche21,22. Tuttavia, questi metodi richiedono la microiniezione di DNA, RNA e/o della proteina negli embrioni molto giovani.
Cosa importante, a differenza di RNAds utilizzato per RNAi, acidi nucleici e proteine utilizzate per germline trasformazione ed editing genomico non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Di conseguenza, microiniezione di plasmide DNAs, mRNA, e/o proteine deve avvenire durante la fase di blastoderm sinciziale (cioè prima che l'embrione dell'insetto cellularizes). Questo rende la tempistica delle iniezioni un fattore critico. Ad esempio, nella Drosophila melanogaster, embrioni necessario essere iniettata entro due ore dopo uovo laici12. Di conseguenza, lo sviluppo di un protocollo di successo embrionali microiniezione per WCR deve tener conto le migliori condizioni per la posa di uovo femminile, così come il metodo migliore per la raccolta di una quantità sufficiente di embrioni precellular.
Un tentativo di portare una vasta gamma di strumenti di genetica molecolare su biologia WCR richiede lo sviluppo di metodologie di raccolta ed microinjecting precellular embrioni WCR. Qui forniamo istruzioni dettagliate, insieme a suggerimenti e trucchi, per aiutare gli altri a utilizzare tecniche basate sulla trasformazione nella ricerca WCR. Oltre a estendere tecnologie transgeniche a WCR per uso negli studi di genomici funzionali, queste tecniche consentono anche potente nuove strategie di controllo dei parassiti come gene unità23,24 per essere testato in questo economicamente importante dei parassiti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1155">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Qualitative Filter Paper (Black)</td>
			<td style="width:189px;">Ahlstrom</td>
			<td style="width:287px;">8613-0900</td>
			<td style="width:339px;">For egg microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 oz Containers&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Anny&#39;s Plastic Tableware</td>
			<td>ASET101</td>
			<td>Egg container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td style="width:189px;">Apex</td>
			<td style="width:287px;">66-103</td>
			<td>Substrate for WCR egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight Forceps&#160;</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td style="width:287px;">4748</td>
			<td>Handling larvae and pupae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clorox Regular-Bleach1</td>
			<td style="width:189px;">Clorox</td>
			<td style="width:287px;">44600-30770</td>
			<td>Wash corn and dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trucker&#39;s Favorite Yellow</td>
			<td>Coor Farm Supply</td>
			<td>502</td>
			<td>Corn for feeding WCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microinjection System (Homemade)</td>
			<td style="width:189px;">NA</td>
			<td style="width:287px;">Parts &#38; instructions available upon request</td>
			<td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Elmer&#39;s Non-toxic Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td style="width:287px;">E304</td>
			<td>Glue eggs on filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">epTIPS Microloader Tips</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:287px;">C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:189px;">Falcon</td>
			<td>25383-103</td>
			<td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand&#160;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S47576C</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sparkleen</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plain Microscope Slides</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">12-549-3</td>
			<td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td>
			<td style="width:189px;">Frontier Agricultural Sciences&#160;</td>
			<td>F9766B</td>
			<td>WCR adult artificial diet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton Balls, Large</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Close the flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137035</td>
			<td>Collect and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>M165 FC&#160;</td>
			<td>WCR screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>DSR</td>
			<td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGFP filter</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>GFP2</td>
			<td>Excitation filter: 440&#8211;520 nm, emission filter: 510 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BugDorm</td>
			<td>MegaView Science</td>
			<td>DP1000_5P</td>
			<td>Cage for adult colony</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Miniature Paint Brush</td>
			<td style="width:189px;">MyArtscape</td>
			<td>MAS-102-MINI</td>
			<td>Liner 2/0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:189px;">Narishige</td>
			<td style="width:287px;">MN-151</td>
			<td>Micromanipulator and needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Microscope XY Stage</td>
			<td style="width:189px;">Olympus</td>
			<td style="width:287px;">265515</td>
			<td style="width:339px;">Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grade 90 Cheesecloth</td>
			<td style="width:189px;">Online Fabric Store</td>
			<td>CHEE90</td>
			<td>For egg-lay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic paraffin film&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Percival Incubator</td>
			<td style="width:189px;">Percival&#160;</td>
			<td style="width:287px;">I41VLH3C8</td>
			<td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>4980-300-PK</td>
			<td>Water container for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Griffin Low Form Beakers</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>1000-600-PK</td>
			<td>For egg wash</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Cotton Rolls</td>
			<td>Richmond Dental Cotton Co.</td>
			<td>605-3599</td>
			<td>Use in water supply for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (35x10mm)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430588-500EA</td>
			<td>For diet plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:287px;">143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Topsoil</td>
			<td>The Scotts Company</td>
			<td style="width:287px;">71130758</td>
			<td>Soil for cron growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td>
			<td>United States Plastic Corporation</td>
			<td>48342</td>
			<td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (100x15m)</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td style="width:287px;">89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128E506</td>
			<td>WCR single pair mating chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">38 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128NC888</td>
			<td>Larvae rearing box/38 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128HRD16</td>
			<td>Larvae rearing box/16 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microinjection Scope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:287px;">WILD-M8</td>
			<td style="width:339px;">Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Adult Western Corn Rootworms</td>
			<td style="width:189px;">North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td>
			<td style="width:287px;">Non-diapase strain</td>
			<td>Request from Dr. Bryan Wade French&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td style="width:189px;">Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

La diabrotica del mais (WCR) è un parassita importante di mais ed è ben noto per la sua capacità di adattarsi rapidamente alle strategie di lotta. Anche se l'interferenza del RNA (RNAi) ha dimostrato di essere un potente strumento per lo studio della biologia WCR, ha i suoi limiti. In particolare, il RNAi sé è transitoria (cioè non provocare a lungo termine eredità mendeliana del fenotipo associato), e richiede la conoscenza della sequenza del DNA del gene target. Quest'ultimo può essere limitante se il fenotipo di interesse è controllato da geni scarsamente conservati, o anche romanzo, perché sarebbe difficile identificare gli obiettivi utili, se non impossibile. Di conseguenza, il numero di strumenti nella casella degli strumenti genomico di WCR dovrebbe essere ampliato dallo sviluppo di metodi che potrebbero essere utilizzati per creare ceppi mutanti stabile e attivare sondaggi indipendente dalla sequenza del genoma del WCR. Nel presente documento, dettagliamo i metodi utilizzati per raccogliere e microinject precellular embrioni WCR con acidi nucleici. Mentre i protocolli descritti nel presente documento sono finalizzati alla creazione di transgenici WCR, editing CRISPR/Cas9-genomico potrebbe essere eseguita anche utilizzando gli stessi protocolli, con l'unica differenza è la composizione della soluzione iniettata gli embrioni.

Una considerazione importante durante lo sviluppo di questo protocollo è stato il palcoscenico dello sviluppo embrionale al momento della microiniezione. In particolare, trasformazione di germline richiede microiniezione di DNAs prima del cellularization embrionale. Questo è perché DNAs non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Tentativi di visualizzare le fasi dello sviluppo embrionale WCR usando una macchia nucleare erano infruttuosi, perché dechorionation di embrioni WCR essenzialmente tutte le membrane protettive responsabile dell'integrità dell'embrione si dissolve. Tuttavia, questa linea di indagine è stata soppiantata da un'altra difficoltà – l'acquisizione di una quantità sufficiente di embrioni in modo tempestivo. Nel campo, WCR femmine depongono le uova nel terreno, così non dovrebbe essere nessuna sorpresa che in laboratorio, le femmine depongono solo uova al buio. Questo rende difficile breve raccolte durante il giorno (2-4 h). Per ovviare a questo problema, un singolo Deposita uovo durante la notte è stata eseguita ed è stato trovato per produrre grandi quantità di embrioni. Anche se il processo di raccolta (Figura 1) e che stabilisce gli embrioni (Figura 2) per il microinjection è un po' laborioso, se fatto in fretta questo protocollo consente a microiniezione di embrioni che sono compresi tra 2-19 h vecchio al momento dell'iniezione e non più vecchi di 24 ore se le iniezioni vengono eseguite nel corso della giornata. Confronto dei tempi di sviluppo tra WCR e altre specie di suggerisce che gli embrioni WCR dovrebbero ancora essere precellular alle 24 h post uovo laici (vedi discussione).
I primi tentativi di trasformazione di germline del WCR coinvolto co-iniezione (Figura 3) del supporto (fonte transposase) e donatore (trasposoni) plasmidi negli embrioni precellular. L'indicatore di trasformazione per il plasmide donatore era un gene della proteina fluorescente verde (EGFP) guidato da un promotore costitutivamente attivo da tribolio Tribolium (alfa-tubulina promotore26). Tassi di sopravvivenza embrionale erano basse (tabella 1), ma 26 G0 adulti sono stati recuperati. Per determinare se l'elemento di donatore inserito in tutte le cellule di germe, G1 embrioni sono stati schermati per l'espressione di EGFP. Anche se fluorescente progenie sono stati infatti identificati (Figura 4), gli embrioni WCR con la sorgente di luce intensa di screening ha dimostrato di essere letale27. Il prossimo round di germline trasformazione utilizzato un nuovo plasmide del donatore, uno che possiede un gene proteina fluorescente rosso (DsRed) guidato da un promotore costitutivamente attivo da Drosophila melanogaster (heat shock proteins 70 promotore28 ). Mentre i tassi di sopravvivenza erano che molto migliorata (tabella 1), gli adulti sopravvissuti prodotto solo una singola larva DsRed-positiva (Figura 5). Tuttavia, questi esperimenti erano particolarmente ben informativi per quanto riguarda due. In primo luogo, si è scoperto che microiniezione ha causato ritardi nello sviluppo, risultante in un tempo estesa a tratteggio. Piuttosto che tutti gli embrioni da cova entro 2 settimane, embrioni iniettati covato tra 12 e 26 giorni post microiniezione, richiedendo così un lungo periodo di monitoraggio per garantire tutti i hatchlings sono stati raccolti. In secondo luogo, si è notato che le larve appena schiuse erano abbastanza attive. Hanno strisciato sul coperchio dove avrebbero ottenere bloccati e a volte fuggiti dal piatto di agar. Questi problemi sono stati superati Petri con un film di paraffina di tenuta ed esaminando coperchi e agar con attenzione per i neonati.
La versione finale di questo protocollo di iniezione è stata testata da microinjecting embrioni WCR con buffer da solo, o con supporto e occhio-promotor (3xP329) contrassegnato plasmidi di DNA del donatore. Come un ulteriore controllo, un'altra serie di embrioni sono stati gestiti in modo identico, ma non sono stati microiniettati. Quattro set di embrioni sono stati iniettati con una soluzione iniettabile. Un totale di 485 embrioni sono stati iniettati con buffer e di quelli, 148 covato (tasso di tratteggio = 30,5%, tabella 1). Di 1.450 embrioni iniettati con il plasmide DNAs, 289 covato (tasso = 26,8%). È interessante notare che, di 470 embrioni che hanno subito le stesse condizioni di uovo-manipolazione, ma senza microiniezione, solo 250 covato (tasso = 53,2%). Che il tasso di sopravvivenza degli embrioni uninjected è superiore ai tassi di sopravvivenza per embrioni iniettati 20% deve essere previsto a causa di inevitabili danni dovuti a microiniezione. Tuttavia, è visto poca differenza tra buffer iniezione e iniezione di DNA, che suggerisce la quantità di DNA che viene aggiunto è accettabile per WCR (vedi discussione). Questi risultati mostrano anche che i tassi di sopravvivenza migliorata negli sforzi precedenti. Stabilimento di successo di linee transgeniche utilizzando questo metodo è stato segnalato altrove27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig1.jpg"> Figura 1: raccolta uova. A) camera di raccolta di uova. B) Zoomed-in vista di una sezione di una camera di uovo dopo 24 h uovo laici. Si noti che le frecce indicano la posizione di un paio di uova. C) lavaggio delle uova fuori una garza. D) il trasferimento finale delle uova WCR. Nota, parentesi indica la regione con embrioni WCR densamente imballati (cioè acqua minimo). <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig2.jpg"> Figura 2: preparazione di una diapositiva di iniezione. A) nero filtro carta strettamente legato a un vetrino da microscopio standard. B) Zoomed-in vista di una sezione di un'iniezione diapositiva durante il processo di preparazione. Nota, freccia #1 indica la posizione di una fila di uova, #2 parziale linea di colla e #3 il pin utilizzato per distribuire la colla. <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig3.jpg"> Figura 3: iniettando embrioni. Una diapositiva di iniezione con otto righe di uova. Dato l'angolo dell'ago per iniezione, le righe successive di embrioni possono essere iniettate semplicemente muovendo il palco. Nota il colorante rosso nell'ago per iniezione aiuta notevolmente la visualizzazione dell'iniezione. <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig4.jpg"> Figura 4: Embrione di1 G transgenici. Embrioni da un adulto WCR che era co-iniettate con piggyBac-base di plasmidi helper e donatore come un embrione precoce. L'embrione verde brillante è positivo per l'espressione della proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) mentre gli altri non sono. Espressione di EGFP è guidato dal tribolio Tribolium alfa-tubulina promotore26. <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig5.jpg"> Figura 5: Larva di transgenici G1 . 3 °-instar larve cui padre è stato co-iniettato con piggyBac-base di plasmidi helper e donatore come un embrione precoce. La larva d'ardore rossa sulla sinistra è positiva per l'espressione DsRed, mentre la larva sulla destra non è. DsRed espressione è guidato dalla scossa di Drosophila melanogaster calore 70 promotore28. <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Esperimento</td>
			<td>Trattamento</td>
			<td>Uova</td>
			<td>Covato</td>
			<td>Tasso di tratteggio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exp. #1</td>
			<td>ΑtubEGFP-donatore</td>
			<td>910</td>
			<td>57</td>
			<td>6,3%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exp. #2</td>
			<td>hsp70DsRed-donatore</td>
			<td>1580</td>
			<td>211</td>
			<td>13,4%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Exp. #3</td>
			<td>3xP3EGFP-donatore</td>
			<td>1450</td>
			<td>389</td>
			<td>26,8%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer</td>
			<td>485</td>
			<td>148</td>
			<td>30,5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>No-iniezione</td>
			<td>470</td>
			<td>250</td>
			<td>53,2%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: dati di Microinjection. A partire da tre esperimenti di microiniezione sugli embrioni WCR, mostrando il numero totale di uova iniettato, il numero totale delle larve che correttamente covate e il tasso di tratteggio si schiudono.

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Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

7.3K Views.  North Carolina State University. Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.

Video: Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Ricerca

Bioingegneria

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Microiniezione Wound Assay e<em&gt; In vivo</em&gt; Localizzazione di Epidermal Wound risposta Giornalisti a<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

Produzione di geneticamente criceti dorati siriani di pronuclei iniezione del complesso CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Sequenziamento di lettura ultra-lungo per analisi di DNA Genomic intero

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system has facilitated advanced genetic modification of Saccharomyces cerevisiae, a model organism and workhorse in industrial biotechnology. CRISPR-associated protein 12a (Cas12a), an RNA-guided endonuclease with features distinguishable from Cas9 is applied in this work, further extending the molecular toolbox for genome editing purposes. A benefit of the CRISPR/Cas12a system is that it can be used in multiplex genome editing with multiple guide RNAs expressed from a single transcriptional unit (single CRISPR RNA (crRNA) array). We present a protocol for multiplex integration of multiple heterologous genes into independent loci of the S. cerevisiae genome using the CRISPR/Cas12a system with multiple crRNAs expressed from a single crRNA array construct. The proposed method exploits the ability of S. cerevisiae to perform in vivo recombination of DNA fragments to assemble the single crRNA array into a plasmid that can be used for transformant selection, as well as the assembly of donor DNA sequences that integrate into the genome at intended positions. Cas12a is pre-expressed constitutively, facilitating cleavage of the S.&#160;cerevisiae genome at the intended positions upon expression of the single crRNA array. The protocol includes the design and construction of a single crRNA array and donor DNA expression cassettes, and exploits an integration approach making use of unique 50-bp DNA connectors sequences and separate integration flank DNA sequences, which simplifies experimental design through standardization and modularization and extends the range of applications. Finally, we demonstrate a straightforward technique for creating yeast pixel art with an acoustic liquid handler using differently colored carotenoid producing yeast strains that were constructed.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

The CRISPR/Cas12a system in combination with a single crRNA array enables efficient multiplex editing of the S.&#160;cerevisiae genome at multiple loci simultaneously. This is demonstrated by constructing carotenoid producing yeast strains which are subsequently used to create yeast pixel art.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing di Saccharomyces cerevisiae e la creazione di Yeast Pixel Art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various factors affect the relaxation rates, such as buffer composition, solution pH, temperature, and magnetic field. In this last regard, the spin-lattice relaxation time can be measured at clinical field strengths, but at lower fields, where these compounds are dispensed from the polarizer and transported to the MRI, the relaxation is even faster and difficult to measure. To have a better understanding of the amount of magnetization lost during transport, we used fast field-cycling relaxometry, with magnetic resonance detection of 13C nuclei at ~0.75 T, to measure the nuclear magnetic resonance dispersion of the spin-lattice relaxation time of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Dissolution dynamic nuclear polarization was used to produce hyperpolarized samples of pyruvate at a concentration of 80 mmol/L and physiological pH (~7.8). These solutions were rapidly transferred to a fast field-cycling relaxometer so that relaxation of the sample magnetization could be measured as a function of time using a calibrated small flip angle (3&#176;-5&#176;). To map the T1 dispersion of the C-1 of pyruvate, we recorded data for different relaxation fields ranging between 0.237 mT and 0.705 T. With this information, we determined an empirical equation to estimate the spin-lattice relaxation of the hyperpolarized substrate within the mentioned range of magnetic fields. These results can be used to predict the amount of magnetization lost during transport and to improve experimental designs to minimize signal loss.

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

We present a protocol to measure the magnetic field dependence of the spin-lattice relaxation time of 13C-enriched compounds, hyperpolarized by means of dynamic nuclear polarization, using fast field-cycled relaxometry. Specifically, we have demonstrated this with [1-13C]pyruvate, but the protocol could be extended to other hyperpolarized substrates.

Misurazione della dipendenza da campo magnetico di rilassamento Spin-Lattice di iperpolarizzato [1-13C]pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Microiniezione di Corn Planthopper, Peregrinus maidis, embrioni per l'editing del genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the cell&#39;s survival requirements. Alternatively, carrying out DBTL cycles in cell-free environments can accelerate this process and alleviate concerns with host compatibility. A promising approach to cell-free metabolic engineering (CFME) leverages metabolically active crude cell extracts as platforms for biomanufacturing and for rapidly discovering and prototyping modified proteins and pathways. Realizing these capabilities and optimizing CFME performance requires methods to characterize the metabolome of lysate-based cell-free platforms. That is, analytical tools are necessary for monitoring improvements in targeted metabolite conversions and in elucidating alterations to metabolite flux when manipulating lysate metabolism. Here, metabolite analyses using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with either optical or mass spectrometric detection were applied to characterize metabolite production and flux in E. coli S30 lysates. Specifically, this report describes the preparation of samples from CFME lysates for HPLC analyses using refractive index detection (RID) to quantify the generation of central metabolic intermediates and by-products in the conversion of low-cost substrates (i.e., glucose) to various high-value products. The analysis of metabolite conversion in CFME reactions fed with 13C-labeled glucose through reversed-phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (MS/MS), a powerful tool for characterizing specific metabolite yields and lysate metabolic flux from starting materials, is also presented. Altogether, applying these analytical methods to CFME lysate metabolism enables the advancement of these systems as alternative platforms for executing faster or novel metabolic engineering tasks.

The protocols describe high-performance liquid chromatography methods coupled to refractive index or mass spectrometric detection for studying metabolic reactions in complex lysate-based cell-free systems.

Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...