Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del programma di ricerca di Monsanto mais Diabrotica conoscenza, assegnare un numero AG/1005 (a MDL e YC) e fondi di Start-up per MDL dal NCSU. FC è stata sostenuta da sovvenzioni da parte mais Diabrotica Knowledge Research Program di Monsanto (AG/1005) e la National Science Foundation, concedere numero MCB-1244772 (MDL). Gli autori non dichiarano interessi concorrenti. FC e MDL ideato e progettato gli esperimenti; FC, PW e SP effettuati gli esperimenti; FC e MDL ha analizzato i risultati; e FC, NG e MDL ha scritto il manoscritto. Ringraziamo Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski per loro assistenza di esperti in selezione WCR. Ringraziamo anche il dottor Wade French (USDA-ARS, laboratorio di ricerca agricola Centrale Nord, Brookings, SD) per le spedizioni di uova di stabilire colonie di laboratorio e fornendo protocolli di allevamento.

1. a livello di Colonia allevamento del WCR adulti
<ol><li>Ottenere una quantità sufficiente di adulti WCR (500-1.000) da un laboratorio affidabile azienda o ricerca (Vedi Tabella materiali per un esempio) e posto in una gabbia di3 cm 30. Nota: È consigliabile l'uso di un ceppo non-diapausing.</li>
	<li>Preparare la dieta artificiale WCR, seguendo il protocollo del produttore e versare uno strato dello spessore di cm 1 in un contenitore di 38 oz (Vedi Tabella materiali). Dopo la miscelazione, è possibile memorizzare inutilizzato dieta a 4 ° C fino a 2 mesi.</li>
	<li>Mettere una capsula Petri (100 x 15 mm) con adulti dieta (10-15 g) in una gabbia di3 cm 30. Aggiungere più dieta quando il cibo è scarso o asciutto.</li>
	<li>Mettere in un pallone (300 mL) con acqua, coperto con un batuffolo di cotone, che viene utilizzato per tenere in posizione un rotolo di cotone (6 "x 3/8"), per servire come una fonte d'acqua. Cambiare l'acqua quando sta per esaurirsi.</li>
	<li>Mantenere WCR a 26 ° C con 60% di umidità ed un 14:10 luce ciclo in un insetto allevamento incubatrice.</li>
</ol>2. gruppi di raccolta e di allineamento
<ol><li>Prenotare una camera di raccolta di uovo utilizzando 1% agar in acqua in una sterile 100 x 15 mm2 piastra di Petri. Conservare a 4 ° C dopo l'agar solidifica.</li>
	<li>Per raccogliere le uova appena deposte, posizionare un singolo strato di carta da filtro, seguita da 4 strati di garza (ogni taglio al formato) sulla superficie dell'agar (Figura 1A). Nota: Garza può essere riutilizzata, dopo essere stato lavato in candeggina e sterilizzato nell'autoclave, ma non è necessario eseguire questa operazione per il primo utilizzo. Carta da filtro non dovrebbero essere riutilizzato e non ha bisogno di essere sterilizzato.</li>
	<li>Luogo piastra di raccolta uova in gabbia WCR più tardi nel corso della giornata come possibile (fine della giornata lavorativa) e coprire con una tenda di carta stagnola. Lasciare durante la notte. Nota: Avere le luci da 10 a deposizione delle uova 12 A.M. (14 h) ritardi, facilitando così la raccolta delle uova più giovane per il microinjection senza richiedere personale di laboratorio a luogo camera di raccolta in gabbia a tarda notte.</li>
	<li>Rimuovere la vaschetta di raccolta uova circa 8 o 9</li>
	<li>Usare pinze per raccogliere 1 strato di garza in un momento e il luogo in un becher (500 mL) di acqua. Lavare le uova al largo di garza di mescolando delicatamente (Figura 1B e 1C).</li>
	<li>Utilizzare una pipetta per trasferire le uova in un altro Becher (500 mL) di acqua. Ripetere 2-3 volte per pulire le uova.</li>
	<li>Utilizzare la pipetta per trasferire uova su carta da filtro (Figura 1), riducendo al minimo la quantità di riporto di acqua.</li>
	<li>A listarelle nero carta da filtro largo come un vetrino e nastro saldamente alla diapositiva per assicurarsi che la carta appoggiato in piano (Figura 2A). Nota: Nero carta da filtro aiuta a migliorare la visibilità sotto il microscopio, riducendo la quantità di luce riflessa.</li>
	<li>Applicare la colla non tossico (per un esempio, vedere Tabella materiali ) per la carta da filtro in linee sottili (Figura 2B). Mantenere le linee di colla più sottile rispetto al diametro di un uovo per evitare che le uova rivestite in colla.</li>
	<li>Utilizzare un pennello fine per spostare delicatamente WCR uova uno per uno da loro carta da filtro per la linea di colla. Tenta di deporre le uova sulla colla prima si asciuga e mantenere distanza di almeno un uovo tra ogni uovo.</li>
	<li>Massimizzare l'efficienza di iniezione inserendo più righe di uova nella diapositiva di una carta da filtro (Figura 3).</li>
	<li>Dopo tutte le uova sono disposte su carta da filtro, attendere fino a quando tutta la colla asciuga prima microiniezione. Nota: Per la trasformazione di germline e per editing genomico CRISPR/Cas9-mediata, iniettare tutti gli embrioni di mezzogiorno (12) affinché l'embrione più antica è vecchio non più di 19 h. Tuttavia, per RNAi, non c'è nessuna limitazione di tempo perché, a WCR, dsRNA può spostarsi tra le celle. Infatti, per RNAi, embrioni di invecchiamento potrebbero comportare meglio tassi di sopravvivenza.</li>
</ol>3. preparazione del plasmide DNAs e aghi per iniezione
<ol><li>Preparare il DNA del plasmide supercoiled alta qualità utilizzando un'endotossina-libero commerciale kit (Vedi Tabella materiali per un esempio).</li>
	<li>Per preparare la soluzione per iniezione, controllare la concentrazione di ogni plasmide e quindi combinare plasmide helper (concentrazione finale di 250 ng / µ l), donatore plasmide (concentrazione finale di 750 ng / µ l) e buffer di rosso fenolo (concentrazione finale di 20%). Vortice la soluzione brevemente e centrifugare per 3 min a velocità massima per far precipitare le particelle che potrebbero intasare l'ago.</li>
	<li>Tirare aghi di vetro borosilicato (O.D. 1 mm, D.I. 0,58 mm, lunghezza 10 cm) utilizzando un estrattore di Flaming/marrone tipo micropipetta. Per deposito, fissare aghi tirati il nastro adesivo su due lati in una capsula di Petri o altro contenitore chiaro. Nota: Per il sistema di estrattore micropipetta, le impostazioni utilizzate erano: calore = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Recupero informazioni l'ago per iniezione utilizzando un micro-caricatore suggerimento (Vedi Tabella materiali) per dispensare 0,5 - 1,0 µ l giù all'interno dell'ago, vicino l'estremità appuntita. Rimuovere le bolle dalla punta dell'ago, qualora si verificassero.</li>
	<li>Il porta-aghi, inserire l'ago per iniezione.</li>
	<li>Aprire la punta dell'ago rompendo delicatamente con un bel paio di pinze, o delicatamente toccando/trascinando la punta sul vetrino coprioggetto o vetro. Nota: L'obiettivo è di avere l'apertura più piccola che ancora permette il mix di iniezione a venire fuori (aperture più piccole richiedono generalmente più alta pressione di iniezione). Aghi smussati non richiedono questo passaggio, poiché essi sono già aperti.</li>
</ol>4. microinjection e cura post-iniezione
<ol><li>Usando un pennello fine, accuratamente bagnare la superficie di 1-3 uova con acqua sterile, inserire l'ago e iniettare la soluzione. Iniettare ogni uovo prima che la superficie si asciughi. Cercare l'aspetto una piccola quantità di colore rosso all'interno di uova durante l'iniezione per indicare il successo microiniezione. Schiacciare o rimuovere eventuali uova che guarda danneggiato, vuoto, o in caso contrario non può essere iniettata. Nota: Anche se la pressione di iniezione variabile in base alla dimensione di foro di spillo, 10-13 psi è un buon punto di partenza.</li>
	<li>Dopo tutte le uova sono iniettate, rimuovere la carta da filtro dal vetrino.</li>
	<li>Posizionare il filtro di carta sulla superficie di un piatto di 1% agar (descritto sopra).</li>
	<li>Usare paraffina plastica pellicola per sigillare il piatto e messo in un insetto di 26 ° C allevamento incubatore per 12 giorni. Nota: Il film di paraffina aiuta a prevenire la contaminazione incrociata di muffa tra piatti. Tuttavia, qualsiasi altro trattamento per prevenire la crescita batterica e muffa potrebbe ridurre la sopravvivenza degli embrioni iniettati.</li>
</ol>5. coltura e da cova di embrioni
<ol><li>Avviare il controllo di embrioni 12 giorni dopo l'iniezione per le larve appena schiuse e continuare ogni giorno per le prossime 2 settimane.</li>
	<li>Trasferire le larve, usando un pennello fine, a una casella di allevamento con cereale germogliato e suolo. Nota: Muffa potrebbe crescere nel piatto di agar, ma le larve si schiudono ancora nella maggior parte dei casi. Cercare larve attentamente all'interno dello stampo per catturarli tutti. Alcune larve potrebbero spostare il coperchio del piatto e potrebbero rimanere bloccati nella condensazione.</li>
	<li>Posteriore larve a 26 ° C, seguendo standard WCR allevamento metodi25.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Anche se microinjection di WCR con RNAds ai fini della RNAi è stato segnalato9, questo è il primo protocollo per stabilire le migliori pratiche per microinjecting precellular embrioni WCR, un processo critico per lo svolgimento di germline trasformazione e/o CRISPR/Cas9 genoma di editing in questa specie. Successo microiniezione di embrioni WCR è dipendente da molti fattori, come l'efficienza di trasformazione. Discussi di seguito alcune delle questioni principali stanno influenzando il risultato dell'utilizzo di questo protocollo per trasformazione di germline in questo coleottero.
Ottenere embrioni precellular Come accennato in precedenza, DNA non attraversa le membrane cellulari che il dsRNA modo possibile. Ciò significa che è di importanza critica che DNA, mRNA, e/o proteine essere iniettato prima cellularization si verifica. Poiché il tempo di iniezione è fondamentale, era importante determinare una finestra probabile per il microinjection successo basato su quanto tempo ci vuole il nondiapausing WCR ceppo30 per completare l'embriogenesi. Questo è stato calcolato basato su studi dettagliati della tempistica della fase blastoderm sinciziale in un altro scarabeo, tribolio Tribolium. In Tribolium, cellularization si verifica ~ 8 h post Deposita uovo a 30 ° C31. Dato che ci vogliono giorni ~3.5 per Tribolium per l'embriogenesi completa a 30 ° C, cellularization avviene un decimo del modo nel processo. Poiché gli embrioni WCR prendono quasi 2 settimane per sviluppare, cellularization non può verificarsi fino a quando il secondo uovo post giorno laici. Di conseguenza, è stato presupposto che la finestra per il microinjection successo è almeno 24 h di lunga, che è utile, poiché WCR richiedono uova durante la notte per fornire una quantità sufficiente di uova per il microinjection. Mentre questo metodo è stato usato per transgenesi successo27, è ipotizzabile che i risultati potrebbero essere migliorati iniettando più giovani embrioni, purché la manipolazione di embrioni molto presto non causare loro un danno.
Concentrazione e la qualità del DNA Non è sorprendente che la concentrazione di DNA svolge un ruolo fondamentale nella trasformazione di successo. Si è a lungo pensato che mantenendo la concentrazione finale del plasmide DNA inferiore a 1 mg/mL è stato necessario per evitare la potenziale tossicità al embrioni iniettati32. Anche se ora non è chiaro se i problemi di tossicità del passato erano dovuto il DNA stesso o invece erano il risultato di contaminanti derivanti dal processo di purificazione del plasmide, questa regola è stata fermamente rispettate per due decenni. Tuttavia, abbiamo recentemente scoperto che superiore a 1 mg/mL limite era non solo possibile, ma anche che in questo modo può ottenere maggiore velocità di trasformazione, che porta alla speculazione che l'assenza di tossicità dell'uovo può essere dovuto gli avanzamenti in kit di purificazione del plasmide, con conseguente meno contaminanti. Dato il tempo necessario per posteriore WCR, qualsiasi aumento nei tassi di trasformazione è utile, anche se il risultato è leggermente più alti tassi di mortalità.
Addolcimento superficie dell'uovo prima di microiniezione A differenza di Tribolium, la superficie più esterno (corion) di un embrione WCR deve essere ammorbidita prima microiniezione. Questo è un passo fondamentale anche quando si utilizzano aghi di quarzo. Idealmente, acqua dovrebbe essere applicato a un singolo embrione immediatamente prima dell'iniezione, ma può essere applicato a gruppi di 2 o 3 embrioni alla volta se microiniezione può essere realizzato prima di chorions reharden. Senza questo passaggio, aghi generalmente riuscirà a penetrare il corion, causando quindi il tentativo di iniezione a fallire e potenzialmente danneggiare la punta dell'ago. Inoltre, se l'ago dovesse penetrare con successo un corion asciutto, la soluzione per iniezione in genere perdite indietro fuori a causa della pressione all'interno dell'embrione sono superiori a pressione ambiente. È, tuttavia, facile distinguere asciutto da embrioni (ammorbiditi) bagnati. In particolare, quando è asciutto, gli embrioni hanno un distinto rigida, forma rotonda, mentre l'aggiunta di acqua li induce a perdere il loro aspetto sferico. Rammollimento non solo permette l'ago penetrare senza fatica il corion, ma riduce anche la pressione all'interno dell'embrione abbastanza che la soluzione di iniezione non fuoriuscire.
Umidità e muffa Embrioni iniettati si svolgono in un ambiente caldo, umido durante l'embriogenesi. Queste condizioni non solo offrono l'ambiente ideale per lo sviluppo WCR, ma anche promuovono lo sviluppo della muffa. Durante questo periodo di due settimane, la muffa si sviluppa frequentemente sui piatti agar alloggiamento gli embrioni WCR. Purtroppo, gli embrioni richiedono elevata umidità e tentativi di ridurlo provocato tassi molto più bassi di tratteggio. È interessante notare che, la presenza di muffa generalmente ebbe poco impatto sulla schiusa, con la maggior parte degli embrioni da cova senza problemi. Inoltre, trattamenti antifungini sono dannosi per gli embrioni WCR, quindi il modo migliore per ridurre la crescita di muffa sembra essere quella di evitare la contaminazione; pulizia strumenti, contenitori e sistema di microiniezione prima dell'uso e cercando di mantenere il tempo trascorso microinjecting al minimo, dal momento che le spore della muffa sono prevalenti in molti ambienti di laboratorio.
Conclusioni Questo protocollo è destinato a permettere ai ricercatori più impiegare tecnologie transgeniche nella loro ricerca WCR e speriamo che sarà di aiuto nello sviluppo di tecnologie basate su transgenetica aggiuntive per l'utilizzo in questo insetto. Sofisticati basati su transgenetica esperimenti condotti in Tribolium potrebbero potenzialmente essere adattati per WCR, tra cui mutagenesi33 e basati su CRISPR genoma34di editing. Poiché queste tecniche richiedono la microiniezione degli embrioni precellular, questo protocollo sarà utile non solo per studi di genomica funzionale basato su trasposoni e/o CRISPR/Cas9-mediata del genoma modifica ma anche per strategie di lotta basata su genetica 35 , 36.

Diabrotica del mais (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, è un parassita importante di mais1. È interessante notare, WCR sembra superare controllo misure più rapidamente di artropodi di interesse agrario più poiché essi non solo adattarsi fisiologicamente ma anche comportamentale2,3,4,5, 6. nell'ultimo decennio, interferenza del RNA (RNAi), un potente strumento di genomico funzionale, è stato studiato come un metodo di controllo potenziale per WCR7,8ed è stato utilizzato anche come mezzo per studiare il gene funzione9. Tuttavia, mentre RNAi è effettuato frequentemente dal microinjection di RNA double-stranded (dsRNA) in altre specie, basati su iniezione RNAi è raro in WCR. In realtà, ci sono soltanto alcuni rapporti di RNAi tramite microiniezioni di dsRNA in WCR9. Il motivo è che WCR possono raggiungere livelli elevati di gene atterramento tramite ingestione di dsRNA7,10, permettendo anche lo studio degli effetti embrionali di alimentazione dsRNA di madre11. Mentre questo metodo rende WCR un ottimo soggetto per analisi genomica funzionale tramite RNAi, ha rallentato progressi nello sviluppo di metodologie per il microinjection embrionale in questa specie.
Nonostante la potenza del RNAi, ci sono alcuni svantaggi. Ad esempio, non tutti i geni rispondono ugualmente a RNAi. Questa variabilità può rendere l'interpretazione dei risultati di un'analisi di genomica funzionale più difficile. Inoltre, RNAi è transitoria e non genera mutazioni ereditabili. D'altra parte, la trasformazione di germline, un altro strumento di genomico funzionale, può generare mutazioni ereditabili tramite inserimento di un elemento trasponibile contrassegnato nella genoma12,13. Questo rende la trasformazione di germline un ottimo strumento per la creazione di ceppi mutanti per uso a lungo termine studi genetici. Trasformazione può essere utilizzata anche per salvare una mutazione formulando una copia funzionale del gene per un genoma mutante14. Inoltre, la trasformazione di germline è la pietra angolare di un'ampia varietà di tecniche di genetica molecolare. Oltre a buttare giù e/o salvataggio di funzione del gene, germline trasformazione può essere utilizzata per enhancer intrappolamento15, gene dell'intrappolamento16, espressione ectopica basata su Gal417e genoma mutagenesi18.
Più recentemente, sono stati sviluppati strumenti che consentono la modifica del genoma sofisticato. Questi strumenti includono trascrizione Activator-Like effettrici nucleasi (TALEN) e il sistema CRISPR/Cas9-nucleasi19,20. Il vantaggio di questi nuovi strumenti è che essi offrono ai ricercatori la capacità di indurre una rottura del DNA double-stranded in quasi qualsiasi posizione all'interno di quasi qualsiasi genoma. Una volta indotta, queste rotture possono essere riparate attraverso entrambe le estremità non-omologo entrare, che possono introdurre le eliminazioni o inserimenti nel gene mirato, o riparazione di omologia-diretto, che in presenza di un costrutto ingegnerizzato, può catalizzare la sostituzione dell'intero geni o regioni genetiche21,22. Tuttavia, questi metodi richiedono la microiniezione di DNA, RNA e/o della proteina negli embrioni molto giovani.
Cosa importante, a differenza di RNAds utilizzato per RNAi, acidi nucleici e proteine utilizzate per germline trasformazione ed editing genomico non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Di conseguenza, microiniezione di plasmide DNAs, mRNA, e/o proteine deve avvenire durante la fase di blastoderm sinciziale (cioè prima che l'embrione dell'insetto cellularizes). Questo rende la tempistica delle iniezioni un fattore critico. Ad esempio, nella Drosophila melanogaster, embrioni necessario essere iniettata entro due ore dopo uovo laici12. Di conseguenza, lo sviluppo di un protocollo di successo embrionali microiniezione per WCR deve tener conto le migliori condizioni per la posa di uovo femminile, così come il metodo migliore per la raccolta di una quantità sufficiente di embrioni precellular.
Un tentativo di portare una vasta gamma di strumenti di genetica molecolare su biologia WCR richiede lo sviluppo di metodologie di raccolta ed microinjecting precellular embrioni WCR. Qui forniamo istruzioni dettagliate, insieme a suggerimenti e trucchi, per aiutare gli altri a utilizzare tecniche basate sulla trasformazione nella ricerca WCR. Oltre a estendere tecnologie transgeniche a WCR per uso negli studi di genomici funzionali, queste tecniche consentono anche potente nuove strategie di controllo dei parassiti come gene unità23,24 per essere testato in questo economicamente importante dei parassiti.

<table><tbody><tr><td>Qualitative Filter Paper (Black)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>For egg microinjection</td></tr><tr><td>1 oz Containers&amp;nbsp;</td><td>Anny&#039;s Plastic Tableware</td><td>ASET101</td><td>Egg container</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Substrate for WCR egg-laying dish</td></tr><tr><td>Featherweight Forceps&amp;nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Handling larvae and pupae&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Wash corn and dishes</td></tr><tr><td>Trucker&#039;s Favorite Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Corn for feeding WCR</td></tr><tr><td>Microinjection System (Homemade)</td><td>NA</td><td>Parts &amp;amp; instructions available upon request</td><td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer&#039;s Non-toxic Glue</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Glue eggs on filter paper</td></tr><tr><td>epTIPS Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Backfilling needle loading tips</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Wash dishes</td></tr><tr><td>Plain Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td></tr><tr><td>Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td><td>Frontier Agricultural Sciences&amp;nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR adult artificial diet</td></tr><tr><td>Cotton Balls, Large</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Close the flask</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Collect and transfer eggs</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&amp;nbsp;</td><td>WCR screening</td></tr><tr><td>DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP filter</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Excitation filter: 440&amp;ndash;520 nm, emission filter: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Cage for adult colony</td></tr><tr><td>Miniature Paint Brush</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Micromanipulator and needle holder</td></tr><tr><td>Microscope XY Stage</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td></tr><tr><td>Grade 90 Cheesecloth</td><td>Online Fabric Store</td><td>CHEE90</td><td>For egg-lay</td></tr><tr><td>Plastic paraffin film&amp;nbsp;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td></tr><tr><td>Percival Incubator</td><td>Percival&amp;nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td></tr><tr><td>Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Water container for adult colony&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Griffin Low Form Beakers</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>For egg wash</td></tr><tr><td>Braided Cotton Rolls</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Use in water supply for adult colony&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>For diet plates</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Microinjection buffer</td></tr><tr><td>Laser-based Micropipiette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Topsoil</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Soil for cron growing</td></tr><tr><td>Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR single pair mating chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>38 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Larvae rearing box/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Larvae rearing box/16 oz</td></tr><tr><td>Microinjection Scope&amp;nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Microinjection needles</td></tr><tr><td>Adult Western Corn Rootworms</td><td>North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td><td>Non-diapase strain</td><td>Request from Dr. Bryan Wade French&#039;s lab</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td></tr></tbody></table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

La diabrotica del mais (WCR) è un parassita importante di mais ed è ben noto per la sua capacità di adattarsi rapidamente alle strategie di lotta. Anche se l'interferenza del RNA (RNAi) ha dimostrato di essere un potente strumento per lo studio della biologia WCR, ha i suoi limiti. In particolare, il RNAi sé è transitoria (cioè non provocare a lungo termine eredità mendeliana del fenotipo associato), e richiede la conoscenza della sequenza del DNA del gene target. Quest'ultimo può essere limitante se il fenotipo di interesse è controllato da geni scarsamente conservati, o anche romanzo, perché sarebbe difficile identificare gli obiettivi utili, se non impossibile. Di conseguenza, il numero di strumenti nella casella degli strumenti genomico di WCR dovrebbe essere ampliato dallo sviluppo di metodi che potrebbero essere utilizzati per creare ceppi mutanti stabile e attivare sondaggi indipendente dalla sequenza del genoma del WCR. Nel presente documento, dettagliamo i metodi utilizzati per raccogliere e microinject precellular embrioni WCR con acidi nucleici. Mentre i protocolli descritti nel presente documento sono finalizzati alla creazione di transgenici WCR, editing CRISPR/Cas9-genomico potrebbe essere eseguita anche utilizzando gli stessi protocolli, con l'unica differenza è la composizione della soluzione iniettata gli embrioni.

Una considerazione importante durante lo sviluppo di questo protocollo è stato il palcoscenico dello sviluppo embrionale al momento della microiniezione. In particolare, trasformazione di germline richiede microiniezione di DNAs prima del cellularization embrionale. Questo è perché DNAs non può facilmente attraversare le membrane cellulari. Tentativi di visualizzare le fasi dello sviluppo embrionale WCR usando una macchia nucleare erano infruttuosi, perché dechorionation di embrioni WCR essenzialmente tutte le membrane protettive responsabile dell'integrità dell'embrione si dissolve. Tuttavia, questa linea di indagine è stata soppiantata da un'altra difficoltà – l'acquisizione di una quantità sufficiente di embrioni in modo tempestivo. Nel campo, WCR femmine depongono le uova nel terreno, così non dovrebbe essere nessuna sorpresa che in laboratorio, le femmine depongono solo uova al buio. Questo rende difficile breve raccolte durante il giorno (2-4 h). Per ovviare a questo problema, un singolo Deposita uovo durante la notte è stata eseguita ed è stato trovato per produrre grandi quantità di embrioni. Anche se il processo di raccolta (Figura 1) e che stabilisce gli embrioni (Figura 2) per il microinjection è un po' laborioso, se fatto in fretta questo protocollo consente a microiniezione di embrioni che sono compresi tra 2-19 h vecchio al momento dell'iniezione e non più vecchi di 24 ore se le iniezioni vengono eseguite nel corso della giornata. Confronto dei tempi di sviluppo tra WCR e altre specie di suggerisce che gli embrioni WCR dovrebbero ancora essere precellular alle 24 h post uovo laici (vedi discussione).
I primi tentativi di trasformazione di germline del WCR coinvolto co-iniezione (Figura 3) del supporto (fonte transposase) e donatore (trasposoni) plasmidi negli embrioni precellular. L'indicatore di trasformazione per il plasmide donatore era un gene della proteina fluorescente verde (EGFP) guidato da un promotore costitutivamente attivo da tribolio Tribolium (alfa-tubulina promotore26). Tassi di sopravvivenza embrionale erano basse (tabella 1), ma 26 G0 adulti sono stati recuperati. Per determinare se l'elemento di donatore inserito in tutte le cellule di germe, G1 embrioni sono stati schermati per l'espressione di EGFP. Anche se fluorescente progenie sono stati infatti identificati (Figura 4), gli embrioni WCR con la sorgente di luce intensa di screening ha dimostrato di essere letale27. Il prossimo round di germline trasformazione utilizzato un nuovo plasmide del donatore, uno che possiede un gene proteina fluorescente rosso (DsRed) guidato da un promotore costitutivamente attivo da Drosophila melanogaster (heat shock proteins 70 promotore28 ). Mentre i tassi di sopravvivenza erano che molto migliorata (tabella 1), gli adulti sopravvissuti prodotto solo una singola larva DsRed-positiva (Figura 5). Tuttavia, questi esperimenti erano particolarmente ben informativi per quanto riguarda due. In primo luogo, si è scoperto che microiniezione ha causato ritardi nello sviluppo, risultante in un tempo estesa a tratteggio. Piuttosto che tutti gli embrioni da cova entro 2 settimane, embrioni iniettati covato tra 12 e 26 giorni post microiniezione, richiedendo così un lungo periodo di monitoraggio per garantire tutti i hatchlings sono stati raccolti. In secondo luogo, si è notato che le larve appena schiuse erano abbastanza attive. Hanno strisciato sul coperchio dove avrebbero ottenere bloccati e a volte fuggiti dal piatto di agar. Questi problemi sono stati superati Petri con un film di paraffina di tenuta ed esaminando coperchi e agar con attenzione per i neonati.
La versione finale di questo protocollo di iniezione è stata testata da microinjecting embrioni WCR con buffer da solo, o con supporto e occhio-promotor (3xP329) contrassegnato plasmidi di DNA del donatore. Come un ulteriore controllo, un'altra serie di embrioni sono stati gestiti in modo identico, ma non sono stati microiniettati. Quattro set di embrioni sono stati iniettati con una soluzione iniettabile. Un totale di 485 embrioni sono stati iniettati con buffer e di quelli, 148 covato (tasso di tratteggio = 30,5%, tabella 1). Di 1.450 embrioni iniettati con il plasmide DNAs, 289 covato (tasso = 26,8%). È interessante notare che, di 470 embrioni che hanno subito le stesse condizioni di uovo-manipolazione, ma senza microiniezione, solo 250 covato (tasso = 53,2%). Che il tasso di sopravvivenza degli embrioni uninjected è superiore ai tassi di sopravvivenza per embrioni iniettati 20% deve essere previsto a causa di inevitabili danni dovuti a microiniezione. Tuttavia, è visto poca differenza tra buffer iniezione e iniezione di DNA, che suggerisce la quantità di DNA che viene aggiunto è accettabile per WCR (vedi discussione). Questi risultati mostrano anche che i tassi di sopravvivenza migliorata negli sforzi precedenti. Stabilimento di successo di linee transgeniche utilizzando questo metodo è stato segnalato altrove27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig1.jpg"> Figura 1: raccolta uova. A) camera di raccolta di uova. B) Zoomed-in vista di una sezione di una camera di uovo dopo 24 h uovo laici. Si noti che le frecce indicano la posizione di un paio di uova. C) lavaggio delle uova fuori una garza. D) il trasferimento finale delle uova WCR. Nota, parentesi indica la regione con embrioni WCR densamente imballati (cioè acqua minimo). <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig2.jpg"> Figura 2: preparazione di una diapositiva di iniezione. A) nero filtro carta strettamente legato a un vetrino da microscopio standard. B) Zoomed-in vista di una sezione di un'iniezione diapositiva durante il processo di preparazione. Nota, freccia #1 indica la posizione di una fila di uova, #2 parziale linea di colla e #3 il pin utilizzato per distribuire la colla. <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig3.jpg"> Figura 3: iniettando embrioni. Una diapositiva di iniezione con otto righe di uova. Dato l'angolo dell'ago per iniezione, le righe successive di embrioni possono essere iniettate semplicemente muovendo il palco. Nota il colorante rosso nell'ago per iniezione aiuta notevolmente la visualizzazione dell'iniezione. <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig4.jpg"> Figura 4: Embrione di1 G transgenici. Embrioni da un adulto WCR che era co-iniettate con piggyBac-base di plasmidi helper e donatore come un embrione precoce. L'embrione verde brillante è positivo per l'espressione della proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) mentre gli altri non sono. Espressione di EGFP è guidato dal tribolio Tribolium alfa-tubulina promotore26. <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57497/57497fig5.jpg"> Figura 5: Larva di transgenici G1 . 3 °-instar larve cui padre è stato co-iniettato con piggyBac-base di plasmidi helper e donatore come un embrione precoce. La larva d'ardore rossa sulla sinistra è positiva per l'espressione DsRed, mentre la larva sulla destra non è. DsRed espressione è guidato dalla scossa di Drosophila melanogaster calore 70 promotore28. <a href="/files/ftp_upload/57497/57497fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Esperimento</td>
			<td>Trattamento</td>
			<td>Uova</td>
			<td>Covato</td>
			<td>Tasso di tratteggio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exp. #1</td>
			<td>ΑtubEGFP-donatore</td>
			<td>910</td>
			<td>57</td>
			<td>6,3%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exp. #2</td>
			<td>hsp70DsRed-donatore</td>
			<td>1580</td>
			<td>211</td>
			<td>13,4%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Exp. #3</td>
			<td>3xP3EGFP-donatore</td>
			<td>1450</td>
			<td>389</td>
			<td>26,8%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer</td>
			<td>485</td>
			<td>148</td>
			<td>30,5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>No-iniezione</td>
			<td>470</td>
			<td>250</td>
			<td>53,2%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: dati di Microinjection. A partire da tre esperimenti di microiniezione sugli embrioni WCR, mostrando il numero totale di uova iniettato, il numero totale delle larve che correttamente covate e il tasso di tratteggio si schiudono.

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Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

7.3K Views.  North Carolina State University. Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.

Video: Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Ricerca

Genetica

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

phiC31 Transgenesi embrionale mediata dall'integrasi in Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autore in primo piano: Ottimizzazione della microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Comportamento

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat