Supportato dalla concessione NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Wyoming. Tutte le procedure, comprese le registrazioni elettrofisiologiche, sono effettuate a temperatura ambiente, circa 23 ° C. Tutti i metodi descritti qui sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15).
1. preparazione in Vivo
<ol><li>Anestetizzare il girino.<ol>
<li>Posizionare il girino in un piccolo piatto di Petri contenente soluzione di Steinberg con 0.01% MS-222 per circa 5 min. Nota: MS-222 aka "tricaina" è un comune pesci e anfibi anestetico. I girini sono allevati nella soluzione di Steinberg in mM: 0,067 KCl, 0.034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.</li>
		<li>Garantire che il girino è profondamente anestetizzato (non-responsivi e non più nuoto) prima di procedere al passaggio 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissare il girino anestetizzato a un blocco di silicone sommerso al piano del piatto di dissezione/registrazione.<ol>
<li>Utilizzare una pipetta monouso per spostare il girino anestetizzato in un piatto di dissezione/registrazione contenente soluzione di registrazione esterna (115mm di NaCl, KCl, spessore 2 mM 3 mM di CaCl2, 3mm di MgCl2, 5mm di HEPES, 1 mM di glucosio; regolare il pH a 7,25 utilizzando 10 N di NaOH, osmolarità 255 mOsm).<ol>
<li>Per ridurre al minimo spontanea del muscolo twitches, aggiungere il bloccante del recettore dell'acetilcolina, tubocurarina (100 µM) alla soluzione esterna. (In genere, ciò avviene mediante una pipetta di 200 µ l per aggiungere 100 µ l di uno stock di tubocurarina 10 mM a 10 mL di soluzione esterna).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzando spilli entomologici, sicuro il girino, lato dorsale fino, a un blocco sommerso di elastomero di silicone (ad esempio Sylgard 184, Vedi Tabella materiali per dettagli), che è stato incollato al pavimento piatto per dissezione. Nota: Il posizionamento dei perni è critico: metterli su entrambi i lati del cervello, sufficientemente caudale per evitare impalare gli assoni afferenti di RGC quel progetto dall'occhio ed entrare nel cervello solo anteriore il tectum ottica (Figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filetto del cervello lungo la linea mediana.<ol>
<li>Per una visione chiara del cervello, togliere la pelle che ricopre il cervello facendo un'incisione superficiale lungo il midline usando un ago sterile 25-G.</li>
		<li>Sfilettare il cervello sullo stesso asse del midline inserendo l'ago nel tubo neurale e tirando delicatamente verso l'alto (dorsalmente) tale che la porzione dorsale del tubo è tagliata in modo pulito (mozzata), lasciando intatta la piastra di pavimento (Figura 1B). Nota: È importante che la piastra di pavimento del tubo neurale rimasto intatto perché l'input sensoriali afferenti immettere il tectum tramite la piastra di pavimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la membrana trasparente ventricolare che copre i neuroni tectal.<ol>
<li>Spostare il piatto di registrazione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia e utilizzare la punta di una pipetta di vetro rotto per rimuovere la membrana ventricolare che ricopre i corpi cellulari di neuroni tectal. Rompere la punta leggermente trascinandolo attraverso un tergicristallo delicato compito.</li>
		<li>Avvitare la pipetta Dispensare titolare e abbassarla verso il tectum ottica tramite il micromanipolatore.</li>
		<li>Usare la pipetta rotta per sbucciare la membrana ventricolare lontano il tectum. Nota: Non è necessario rimuovere la membrana dal tectum intero; una piccola finestra sarà sufficiente e fornire l'accesso a un sacco di neuroni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ottenere l'intera cellula registrazioni di patch clamp. Nota: L'approccio da questo punto in avanti è simile a svolgere le registrazioni a cellula intera patch clamp da fette di cervello del topo come descritto in Segev, et al. 16 (Figura 1C).</li>
	<li>Registrare le risposte di neuroni tectal a un flash di tutto il campo di luce proiettati sulla retina.<ol>
<li>Per proiettare un lampo di tutto il campo di luce sulla retina, posto adiacente all'occhio del girino una fibra ottica. A altra estremità della fibra ottica è un LED in linea con un resistore variabile che permette per la luminanza leggera essere controllato. Attivare il LED di uscita digitale dell'amplificatore. In questo modo, tutto il campo flash di diversa intensità della luce può essere registrata (Figura 4A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. whole Brain preparazione
<ol><li>Eseguire i passaggi da 1.1 a 1.3. Nota: Non esiste alcuna necessità di tubocurarina nella soluzione esterna per questa preparazione.</li>
	<li>Isolare il cervello.<ol>
<li>Usare un ago da 25 G per interrompere hindbrain (Figura 2A).</li>
		<li>Per isolare l'intero cervello da girino, eseguire delicatamente l'ago sotto il cervello, in direzione caudale--rostrale di recidere tutti i laterale e ventrale del tessuto connettivo e fibre nervose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissare il cervello a un blocco di elastomero di silicone.<ol>
<li>Una volta completamente liberato, fissare il cervello a un blocco di elastomero di silicone inserendo un pin attraverso uno dei bulbi olfattivi e un altro attraverso il hindbrain (Figura 2B). Questa è la configurazione ottima per la registrazione da neuroni tectal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spostare il piatto contenente la preparazione appuntato intero cervello dall'ambito dissezione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia. Togliere la membrana ventricolare usando una pipetta di vetro rotto come descritto al punto 1.4.</li>
	<li>Posizionare un elettrodo stimolante bipolare il chiasm ottico (dove i tratti dell'assone da ogni occhio Croce al mesencefalo) per attivare direttamente gli assoni RGC.<ol>
<li>Posizionare l'elettrodo stimolante bipolare rostrale e quasi adiacente al, ventricolo medio grande. Il chiasma ottico si trova immediatamente rostral al ventricolo medio grande (Figura 2B).<ol>
<li>Abbassare delicatamente l'elettrodo stimolante giù sul chiasma tale che una piccola ammaccatura è formata nel tessuto. L'elettrodo bipolare è guidato da uno stimolatore di impulso che permette la forza di stimolazione per essere controllato con precisione.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la registrazione di morsetto di patch intera cellula (Figura 2C) come descritto da Segev, et al. 16
</li>
</ol>3. orizzontale cervello fetta preparazione
<ol><li>Eseguire i passaggi 2.1 a 2.3.</li>
	<li>Utilizzare una lama di rasoio per asportare il quarto più laterale (che in vivo corrisponde alla quarta più dorsale) di un lato di un ottica tectum. Questo taglio è fatto parallelo al piano rostrale caudale come mostrato in Figura 3A.</li>
	<li>Re-pin il cervello al lato dell'elastomero siliconico con le fette lato rivolto verso l'alto (in modo che il somata e neuropil sono direttamente accessibili per la registrazione) e la superficie ventricolare del cervello dalla parte opposta del blocco di elastomero di silicone (Figura 3 B) (in modo che un elettrodo bipolare può essere posizionato su chiasm ottico).</li>
	<li>Eseguire l'intera cellula patch morsetto o registrazione potenziali archiviato locale (Figura 3C) come descritto da Segev, et al. 16
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Order+in+Human+Neurological+Disorder+Using+a+Tadpole.">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li><li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit.">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole.">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit.">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li><li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity.">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351 (2015).</li><li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo.">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li><li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cline+H.T.+of+a+central+glutamatergic+synapse.">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li><li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism.">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li><li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development.">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum.">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horizontal+brain+slice+preparation:+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum.">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).</li><li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure.">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li><li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles.">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li><li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+to+see:+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function.">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles.">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Tutti i metodi descritti in questo lavoro sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15). Dalla fase 42, i girini sono sufficientemente grandi e sufficientemente sviluppati affinché i perni degli insetti possono essere posizionati su entrambi i lati del cervello per le registrazioni in vivo e di eseguire la dissezione del cervello intero. Nelle fasi precedenti, quando i girini sono essenzialmente bidimensionali (cioè, piatto), gli approcci descritti qui non sono ottimali.
A causa della facilità in cui i neuroni tectal possono essere consultati e registrati nella configurazione di cellule intere, questo circuito di modello è stato un focolaio di scoperte fondamentali sulla forma di circuiti neurali come durante il funzionamento - e funzione mentre formando19. Qui abbiamo descritto come acquisire registrazioni di morsetto a cellula intera patch da neuroni tectal, compreso il modo di eseguire il girino in vivo e preparazioni di tutto il cervello, la registrazione differenti configurazioni ed esempi dei diversi tipi di dati. Di seguito è riportato una discussione dei punti di forza e i limiti di ogni preparazione, seguita da suggerimenti per realizzare registrazioni di alta qualità tutta la cella.
Girini di Xenopus iniziano a visualizzare i comportamenti di evitamento visual da stage 47/48, circa 7-8 giorni post-fertilizzazione3,13. Questo significa che anche in queste fasi relativamente precoce di sviluppo, il circuito di retinotectal è funzionante e in grado di elaborare gli stimoli visivi. Questioni fondamentali per lo sviluppo e plasticità del circuito retinotectal sono state affrontate direttamente utilizzando la preparazione in vivo per registrare le risposte di neuroni tectal agli stimoli visivi proiettati sulla retina. In vivo le registrazioni nel girino sono relativamente semplice rispetto alla configurazione di registrazione equivalente nei mammiferi dovuto la relativa semplicità del sistema nervoso e mancanza di un teschio. Poiché i somas singoli neuroni tectal possono essere visualizzati in vivo, tenuta su un dato neurone e raggiungimento di configurazione registrazione a cellula intera patch clamp è essenzialmente equivalente allo svolgimento di morsetto di patch a cellula intera registrazione in fetta del roditore preparazioni. Girini in genere sopravvivono per diverse ore su rig (che può essere facilmente valutata monitorando il battito del cuore). Una limitazione intrinseca della preparazione girino in vivo è che solo i neuroni tectal che risiedono nello strato profondo somatico dell'ottica tectum, lo strato che è immediatamente adiacente al ventricolo medio grande, sono accessibili per la registrazione (Figura 1 ). Questo significa che i neuroni tectal residenti negli strati esterni somatici del tectum sono state in gran parte inesplorati in vivo.
Il vantaggio sperimentale del preparato intero cervello è che si isola il cervello dai recettori sensoriali periferici negli occhi e nella pelle, eliminando tutte le attività sensoriali-driven spurie. Mentre non è più in grado di essere guidato da stimoli visivi, gli ingressi di axonal RGC destinati il tectum sono ancora presenti nel preparato tutto il cervello e possono essere attivati direttamente in modo altamente controllato tramite un elettrodo stimolante bipolare (FHC) immesso sul il chiasma ottico dove i due insiemi di tratti dell'assone RGC entrassero nel cervello. Il primo uso riferito della preparazione intero cervello fu nel 1996, in un importante studio di Wu et al. 8, in cui gli assoni RGC sono stati attivati utilizzando un elettrodo stimolante bipolare tale che gli autori potevano quantificare la forza dei singoli assoni RGC sui neuroni postsinaptici tectal e facendo così fatto scoperte fondamentali circa la progressione di maturazione della sinapsi. Come con la preparazione in vivo , la preparazione di tutto il cervello consente l'accesso a solo quei neuroni che risiedono nello strato profondo, adiacente alla membrana ventricolare.
Anche se l'ottica tectum è composto di circa nove corpo cellulare strati17, tutti gli studi di elettrofisiologia precedenti hanno messo a fuoco sui neuroni tectal strato profondo perché il tradizionale intero cervello e preparati in vivo (descritti sopra) consentono l'accesso solo ai neuroni di strato profondo. Per poter accedere a neuroni tectal attraverso tutti gli strati somatici, dal più profondo al più superficiale così come l'intero neuropil cui assoni RGC formano connessioni sinaptiche con dendriti del neurone tectal, abbiamo sviluppato una preparazione modificate intero cervello, indicata come "il preparazione di fetta di cervello orizzontale"(Figura 3,14). Come con la preparazione di tutto il cervello, la preparazione di fetta di cervello orizzontale mantiene gli assoni RGC all'interno del cervello e possono essere controllati mettendo un elettrodo stimolante bipolare il chiasm ottico.
Nel complesso, i preparativi sono progettati per ottimizzare la visualizzazione di e l'accesso a somata tectal neurone per eseguire registrazioni con cellula intera patch clamp. Accesso diretto al soma è essenziale per registrazioni di qualità a cellula intera patch clamp: accesso all'interno del neurone richiede la formazione di un molto forte (> 1 × 109 Ω) tenuta tra la pipetta e membrana plasmatica del neurone, che richiede diretto contatto della punta della pipetta su tale membrana. Quindi, sufficiente asportazione della membrana ventricolare è la chiave per la registrazione di successo. Inoltre, chiave per successo registrazioni RGC-evocato è il corretto posizionamento dell'elettrodo stimolante bipolare sul chiasma. Essenzialmente tutti i neuroni tectal ricevano input sinaptico diretto da assoni RGC. Se nessuna risposta RGC-evocato è osservata, allora questo è probabilmente a causa di errato posizionamento dell'elettrodo bipolare, tale che non è il chiasm ottico e non a contatto con i nervi ottici. Questo può essere risolto semplicemente ri-posizionamento dell'elettrodo stimolante. Mancata osservanza RGC-ha evocato le risposte dopo ri-posizionamento dell'elettrodo bipolare potrebbe significare che la proiezione di assone RGC è stato accidentalmente reciso durante la dissezione. In questo caso, è necessario ricominciare da capo con una nuova preparazione. Infine, l'inosservanza di una risposta evocata RGC potrebbe essere a causa di registrazione da una cella che non è un neurone tectal comune. Per esempio, glia in genere non visualizzano la risposta monosinaptica RGC-evocati normale visualizzata dai neuroni tectal e nemmeno i neuroni mesencephalic grandi che sono stati trovati, anche se a numeri molto bassi, che risiedono nell' ottica tectum20. La probabilità di registrare da una di queste cellule non-tectal è molto bassa a causa del gran numero di neuroni tectal. Naturalmente, registrazioni di qualità richiedono anche i neuroni tectal per essere sano. Caratteristiche di un neurone tectal sano sono un compatto soma rotondo o ovale che è di colore chiaro e senza imperfezioni. Una volta raggiunta la configurazione di registrazione di tutta la cella, la salute del neurone possa essere ulteriormente valutata a livello elettrofisiologico misurando fondamentali proprietà elettriche come potenziale di membrana, resistenza di ingresso e capacità di riposo . Il potenziale di membrana di riposo dei neuroni tectal sani tra fasi inerenti allo sviluppo 42 e 49 è circa -45 mV, con una media resistenza d'ingresso di circa 1 GΩ e una capacità di 10-12 pF3,4,5. Una piccola frazione dei neuroni sarà inevitabilmente danneggiata a causa della rimozione della membrana ventricolare. Il somata dei neuroni danneggiati o insalubri appaiono granuloso, gonfio, o avvizziti. Figura 2Cè riportato un esempio di un neurone del malsano. Se la maggioranza dei neuroni appare malsana, questo potrebbe essere una riflessione che c'è qualcosa di sbagliato con la soluzione di registrazione esterna, quindi si raccomanda di soluzione fresca di registrazione esterna. Oltre a comparire sano, i neuroni migliori per la registrazione sono associati tipicamente con un gran numero di altri neuroni, al contrario di essere isolati. Inoltre, scegliere celle che sono facilmente accessibili. Ad esempio, non spingere il tessuto troppo difficile da accedere a una cella perché questo potrebbe danneggiare il tessuto o spostare il tessuto e quindi spostare l'elettrodo stimolante fuori luogo. Infine, le registrazioni dovrebbero essere limitate nel terzo medio del tectum (Figura 2B) per evitare differenze di potenziale dovuto la pendenza inerente allo sviluppo che esiste attraverso il rostro-caudale asse4,8, a meno che, naturalmente, l'obiettivo dell'esperimento è la suddetta pendenza inerente allo sviluppo. Il tectum corretta è la zona rostrale della zona proliferativa e caudale all'estremità caudale del ventricolo medio grande.
Il morsetto di patch a cellula intera registrazione tecnica non è priva di limiti. In generale, questo stile di registrazione comporta la registrazione di un neurone in un momento. Questo è in contrasto con gli approcci che coinvolgono la formazione immagine di una nuova generazione indicatori di calcio GCaMP6, che consentono l'attività di grandi popolazioni di neuroni per essere imaged simultaneamente in una fetta preparazione e in vivo.
Un altro svantaggio inerente le registrazioni a cellula intera tensione morsetto è l'errore di morsetto di spazio (l'incapacità di controllare la tensione molto più in là, oltre il soma), che limita il controllo temporale della tensione4. Nel complesso, questi problemi di morsetto di tensione sono minimi quando si registra da neuroni tectal tuttavia, a causa della loro dimensione relativamente piccola, modesta arborizations dentritici e correnti relativamente piccole e lente rispetto ai neuroni dei mammiferi. Queste caratteristiche dei neuroni tectal li rendono particolarmente favorevoli per il morsetto di tensione registrazione, misurazione di molti parametri e la costruzione di profili per singoli neuroni5,6.
Orientamenti futuri includono l'ottimizzazione di una in vivo del cervello orizzontale fetta preparazione per caratterizzare la funzione dei neuroni di strato esterno nell'elaborazione degli stimoli visivi.

Il circuito di retinotectal è il componente principale del sistema visivo anfibio. Si compone di RGCs nell'occhio, che proiettano i loro assoni al tectum ottica dove formano connessioni sinaptiche con neuroni postsinaptici tectal. Il circuito di retinotectal girino Xenopus è un popolare modello di sviluppo per studiare la funzione e la formazione di circuiti neurali. Ci sono molti attributi del circuito retinotectal di questo girino che lo rendono un potente modello sperimentale1,2,3. Un attributo importante e il focus di questo articolo, è la capacità di effettuare tutta la cella patch morsetto registrazioni da neuroni tectal, in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello. Con un impianto di perforazione di elettrofisiologia equipaggiato con un amplificatore che supporta la modalità di registrazione a morsetto di tensione e corrente, le registrazioni a cellula intera patch clamp permettono di elettrofisiologia di un neurone a caratterizzarsi ad alta risoluzione. Di conseguenza, tutta la cella patch clamp le registrazioni da neuroni tectal attraverso le fasi chiave della formazione del circuito di retinotectal hanno fornito una comprensione completa e dettagliata dello sviluppo e plasticità di intrinseca4,5 , 6 , 7 e proprietà sinaptiche8,9,10,11 . Combinando le registrazioni a cellula intera patch clamp tectal del neurone, la capacità di esprimere geni o morpholinos di interesse in questi neuroni12e un metodo per valutare il comportamento visivo guidato tramite un stabilito elusione visual test13 promuove la identificazione dei collegamenti tra molecole, circuito funzione e comportamento.
È importante notare che il tipo di alta risoluzione di dati acquisiti da registrazioni di cellula intera patch clamp non sono possibili utilizzando i più recenti approcci di imaging come l'indicatore di calcio genetica GCaMP6, perché anche se utilizzando indicatori di calcio permette l'imaging di calcio dinamiche attraverso le grandi popolazioni di neuroni simultaneamente, non c'è nessun diretto o modo ovvio che i parametri elettrici specifici possono essere ottenuti misurando la fluorescenza di delta nel somata e non c'è alcun modo per tensione morsetto il neurone per misurare rapporti corrente-tensione. Chiaramente questi due approcci distinti, registrazioni elettrofisiologiche e imaging del calcio, possiedono punti di forza non sovrapposte e generare diversi tipi di dati. Pertanto, l'approccio migliore dipende la questione sperimentale specifica affrontata.
Qui, descriviamo il nostro metodo per l'acquisizione di registrazioni di morsetto a cellula intera patch da neuroni del tectum ottica girino utilizzando una preparazione in vivo , preparazione di tutto il cervello, e una più recente modificato preparazione di tutto il cervello che è stato sviluppato nel nostro laboratorio14 . Nella sezione risultati rappresentante, dimostriamo i vantaggi sperimentali di ogni preparazione e le tipologie di dati che possono essere ottenuti. I limiti e i punti di forza di preparazioni differenti, così come suggerimenti per la risoluzione dei problemi, sono inclusi nella sezione discussione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1011">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Stemi Stereo 508</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;">495009-0006-000&#160;</td>
			<td style="width:299px;">Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS-222 &#34;Tricane&#34;</td>
			<td>Finquel</td>
			<td>ARF5G</td>
			<td>Amphibian general anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Used to prepare Stienberg&#39;s solution and external solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Used to prepare Stienberg&#39;s solution and external solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td>Used to prepare Stienberg&#39;s solution and external solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)&#8226;4H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237124-500G</td>
			<td>Used to prepare Stienberg&#39;s solution&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Used to prepare Steinberg&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td>Used to prepare external recording solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td>Used to prepare external recording solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose Anhydrous</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6066-04</td>
			<td>Used to prepare external recording solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubocurarine hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2379</td>
			<td>Nicotinic acetylcholine receptor antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>0.1mm diameter stainless steel pins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>761028</td>
			<td>Preweighed monomer and curing agent kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS4052</td>
			<td>Small petri dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td>Syringe needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1mL Slip Tip Tuberculin Syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Disposable, sterile syringes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Pulled to desired specifications using pipette pulling machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Fabricates micropipettes for electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes Kimtech wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td>Delicate task lint-free wipers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-CV-7B</td>
			<td>Current clamp and voltage clamp headstage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285/T</td>
			<td>Control for headstage on electrophysiology rig</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-Coupled LED (Green)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M530F2</td>
			<td>Fiber optic cable paired with green LED</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cluster Bipolar Electrode (25&#181;m diameter)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30207</td>
			<td>Bipolar stimulating electrode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISO-Flex Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I. (Israel)&#160;</td>
			<td>Contact manufacturer</td>
			<td>Flexible stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2500-0157</td>
			<td>Amplifier for voltage- and current-clamp recording&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digidata 1322A digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>2500-135</td>
			<td>Data acquisition system for electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axio Examiner.A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>491404-0001-000&#160;</td>
			<td>Microscope for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-g Lab Table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-533</td>
			<td>Air table for electrophysiology microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit</td>
			<td>Dell</td>
			<td>D06D001</td>
			<td>Computer running electrophysiology software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c2400 CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>70826-5</td>
			<td>Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7 O&#39;Clock Super Platinum Stainless Razorblades</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>CMM01049</td>
			<td>Platinum-coated stainless razor blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>Disposable Polyethylene transfer pipets</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparations and protocols for whole cell patch clamp recording of xenopus laevis tectal neurons

Il circuito di retinotectal girino di Xenopus , comprende le cellule retiniche del ganglio (RGCs) nell'occhio che formano le sinapsi direttamente sui neuroni nel tectum ottica, è un modello popolare di studiare circuiti neurali come auto-assemblarsi. La capacità di svolgere tutta la cella le registrazioni del morsetto di patch da neuroni tectal e per registrare le risposte evocate RGC, entrambi in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello, ha generato un grande corpo dei dati ad alta risoluzione circa i meccanismi di fondo normale e anormale, circuito formazione e funzione. Qui descriviamo come eseguire la preparazione in vivo , la preparazione originale di tutto il cervello, e più recentemente sviluppato preparazione di fetta di cervello orizzontale per ottenere le registrazioni a cellula intera patch clamp da neuroni tectal. Ogni preparazione ha vantaggi unici sperimentali. La preparazione in vivo permette di registrare la risposta diretta dei neuroni tectal agli stimoli visivi proiettato sull'occhio. Permette la preparazione di tutto il cervello per gli assoni RGC deve essere attivata in modo altamente controllato, e la preparazione di fetta di cervello orizzontale permette la registrazione da attraverso tutti gli strati del tectum.

Per registrare le risposte evocate luce un lampo di tutto il campo di luce viene proiettato la retina, mentre la risposta risultante viene registrata da singoli neuroni tectal (Figura 4A). Questo particolare protocollo è progettato per misurare sia la risposta del neurone alla luce accensione ("On" risposta) e quindi spegnendo 15 s più tardi per misurare la "risposta fuori." Neuroni tectal esibiscono tipicamente robusto e disattivare le risposte (modalità morsetto mostrato qui registrate in tensione, con il neurone fissata a - 60mV per misurare corrente sinaptica (Figura 4B)). La quantità di unità sinaptica ricevuti da qualsiasi un neurone può essere quantificata mediante la registrazione di eventi spontanei sinaptici (Figura 4C). Rapporti corrente-tensione (curve I-V) possono essere generati dal neurone stesso facendo un passo il neurone ai potenziali sempre più depolarizzati e registrazione del risultante tensione-attivato Na+ e correnti di K+ , indicati come "misto a corrente registrazioni"(Figura 4D, E). Esso è stato affermato che per questi neuroni anfibio, picco Na+ e K+ correnti possono essere quantificate tramite registrazioni corrente miste perché le cime non sovrapporsi temporaneamente uno con l'altro4,7.
Diretta attivazione degli assoni RGC al chiasma bypassa tutti i calcolo a Monte e l'elaborazione degli stimoli visivi che si svolgono nell'occhio e consente di studiare la trasmissione sinaptica tra presinaptici RGC assoni e neuroni postsinaptici tectal nel suo forma più pura e ridotta. Risposte tectal neurone all'attivazione di RGC vengono generate da RGCs stimolata dalla luce o direttamente utilizzando un elettrodo stimolante bipolare che consiste di due componenti: una componente monosinaptica (l'input sinaptico diretto da RGCs attivato) e un polisinaptici componente (la rete locale ricorrente attività alimentazione indietro sul neurone in fase di registrazione). Nel caso di risposte evocate luce, i componenti monosinaptici e polisinaptici si sovrappongono uno con l'altro da una certa quantità di undeterminable. Questa sovrapposizione temporale limita ciò che può essere concluso sulla trasmissione sinaptica tra la retina e ottica tectum. Usando una preparazione di tutto il cervello e l'attivazione del tratto di assone RGC direttamente tramite un elettrodo posizionato il chiasm ottico (Figura 5A), tuttavia, produce una mono - e polisinaptici componente che sono essenzialmente non sovrapposte nel tempo. La forza stimolante dell'elettrodo bipolare può essere regolata. Come la forza stimolante è aumentata, c'è un maggior numero di assoni RGC attivato (Figura 5B). Un protocollo di stimolazione minima determina la forza sinaptica di un singolo assone RGC su un singolo neurone tectal; un protocollo di stimolazione massima riflette il totale, o input sinaptico di massima da tutti gli assoni RGC combinato (Figura 5C). Il rapporto corretto di input sinaptico eccitatorio di inibitoria (E: ho rapporto) ricevuti da un singolo neurone tectal è critico per la funzione visiva normale18. Figura 5 D Mostra un esempio delle RGC-evocato eccitatorie ed inibitorie corrente tracce registrate da un singolo neurone tectal. La probabilità che il rilascio del trasmettitore da terminali assone presinaptico RGC è misurata da registrazioni di impulsi appaiati. Per questo, il neurone postsinaptico tectal è registrato in modalità tensione morsetto per misurare correnti sinaptiche, mentre gli assoni RGC vengono attivati successivamente, separati da un intervallo di tempo di 50 ms (Figura 5E).
A cellula intera patch morsetto registrazioni possono essere effettuate dai neuroni tectal che risiedono in qualsiasi livello somatico. Simile alla preparazione di tutto il cervello, gli assoni RGC possono essere attivati inserendo un elettrodo bipolare registrazione sul chiasma (Figura 6A). Tutte le registrazioni effettuate nella preparazione di tutto il cervello possono essere eseguite anche utilizzando questa preparazione di fetta di cervello orizzontale. Figura 6 B Mostra una traccia di esempio di una risposta evocata RGC registrata da un neurone nello strato superficiale. Questa preparazione permette anche per il modello spaziale di RGC input sinaptico sui dendriti tectal di essere misurato. Per questo, campo RGC-evocata potenziali sono registrati ogni 10 µm lungo l'asse mediale-laterale (cioè, l'asse distale-prossimale) del neuropil (Figura 6C). Questo genera un profilo ad alta risoluzione del modello di input RGC funzionale. I potenziali di campo possono quindi essere trasformati in attuale densità di origine calcolando le derivate spaziali secondo14 e le densità di origine corrente a sua volta possono essere trasformate in una trama di immagine. La trama di immagine nella Figura 6C Mostra che l'input RGC più forte obiettivi la zona più distale del neuropil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig1.jpg"> Figura 1. In vivo procedure di preparazione. (A) girino inchiodato su un pezzo di elastomero di silicone. Perni sono indicati dalle frecce bianche. Si noti il posizionamento più caudale di pin per evitare impalare i tratti ottici. La linea tratteggiata bianca indica la linea mediana. (B) Zoomed-in vista dell'intero cervello dopo il taglio lungo la linea mediana dorsale e rimuovendo la pelle di sovrapposizione. (C) registrazione toppa-morsetto della intero-cellula in vivo. (L: laterale. M: mediale. R: rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale. OB: bulbo olfattivo. OT: Ottica Tectum. HB: Hindbrain). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig2.jpg"> Figura 2 . Procedure di preparazione del cervello intero. (A) dopo che il cervello è filettato lungo la linea mediana, il hindbrain viene interrotta. (B) l'intero cervello è dissecato fuori e appuntato l'elastomero di silicone. L'asterisco bianco indica il pin nel bulbo olfattivo sinistro. Il riquadro rosso indica il terzo medio del tectum, cioè, l'area di destinazione per la registrazione. (C) registrazione morsetto patch a cellula intera che usando tutto il cervello preparazione. L'asterisco nero indica l'area della membrana ventricolare ONU-raschiata dove le cellule non possono essere letta per la registrazione. Dove la membrana è stato rimosso con successo, il somata appaiono più chiari e definiti. La freccia indica un neurone malsano. (PZ: zona proliferativa. LMV: Grande ventricolo mediale. OB: bulbo olfattivo. OT: Ottica Tectum. HB: Hindbrain. L: laterale. M: mediale. R: rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig3.jpg"> Figura 3 . Le procedure di preparazione di fetta orizzontale cervello. (A), la porzione più laterale di un lato del tectum ottica sarà tagliato (indicato dalla linea tratteggiata) dopo la preparazione di tutto il cervello. Preparazione di fetta di cervello orizzontale (B) dopo essere stato inchiodato al lato dell'elastomero siliconico. Doppie linee bianche rappresentano un elettrodo stimolante posizionato il chiasm ottico. (C), visualizzazione ingrandita del soma strati e neuropil usando un cervello orizzontale fetta preparazione. Curva tratteggiata indica il limite tra strati di soma e neuropil. Questa figura è stata modificata da Nicolò Abbate, et al. 14 (l: laterale. M: mediale. R: rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale. OB: bulbo olfattivo. OC: Chiasm ottico. OT: Ottica Tectum. HB: Hindbrain). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig4.jpg"> Figura 4 . Registrazioni da una preparazione in vivo . Schema (A) che mostra la configurazione tipica di una registrazione in vivo . (B) luce evocato risposte compresi luce su e luce spenta le risposte. Inserto tracce sono visualizzazione ingrandita su-fuori-risposta e, rispettivamente. (C) spontanea eccitatorie correnti postsinaptiche registrata. (D) Na+ e correnti di K+ in risposta alla tensione morsetto passi da -60 mV a 30 mt da un singolo neurone. (E) IV piazzole generati da tracce in (D). Tutte le registrazioni sono state fatte con il neurone disputato -60 mV tranne in (D) per generare IV-Piazzole; i neuroni sono entrati ai potenziali sempre più più depolarizzati, in incrementi di 10 mV, per attivare le correnti tensione-dipendente. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig5.jpg"> Figura 5 . Registrazioni da una preparazione di tutto il cervello. Schema (A) che mostra la configurazione tipica di registrazione intero cervello compreso un elettrodo stimolante immessi sul chiasma (linee verde e rossa rappresentano gli assoni RGC). (B) Overlaying traccia delle risposte ai cambiamenti della forza di stimolazione RGC RGC. (C) massimo stimolo risposta (a sinistra) e stimolazione minima risposta (a destra). (D) An RGC-evocata risposta eccitatoria e inibitoria su un singolo neurone. (E) Paired impulsi facilitazione della risposta di un singolo neurone RGC-evocati. (OB: bulbo olfattivo. OC: Chiasm ottico. OT: Ottica Tectum). Tutte le registrazioni sono state fatte con il neurone disputato -60 mV tranne in (D) per misurare l'input eccitatori ed inibitori: l'input eccitatorio è registrato tenendo il neurone presso il potenziale di inversione di acido γ-amminobutirrico (GABA)-mediata cloruro correnti (-45 mv); l'input inibitorio tenendo il neurone presso il potenziale di inversione di acido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA)-mediata correnti (+ 5 mv). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig6.jpg"> Figura 6 . Registrazioni da un cervello orizzontale fetta preparazione. Schema (A) Mostra la configurazione di una preparazione di fetta di cervello orizzontale. Si noti che anche se l'elettrodo stimolante rimane al chiasm ottico, la pipetta di registrazione è ora posizionato accesso cellule attraverso tutti gli strati tectal esposti dalla preparazione fetta orizzontale del cervello. (B) una risposta RGC da un neurone che risiedono nello strato superficiale del tectum. (C) registrato potenziali di campo attraverso neuropil e le densità di origine corrente convertito (CSDs) indicate da immagine trama mappe di calore. (OC: chiasma ottico. OT: Ottica Tectum. HB: Hindbrain). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57465/57465fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

preparations-protocols-for-whole-cell-patch-clamp-recording-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

9.3K Views.  University of Wyoming. In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.