Name: spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Ringraziamo Paul O'Brien, Marizel Mina e Isabella Freedman per gli esperimenti sugli animali, Jacquie Gonzalez e Danielle Weiner dal NIH/NIAID per aiuto con irradiazione gamma dei tessuti di coniglio prima del laser capture microdissection e Jansy Sarathy per manoscritto pensieri e consigli. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti da Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1174780) e strumentazione di NIH ha condiviso concedere 1S10OD018072. Ringraziamo Eliseo A. Eugenin per fornire accesso al microscopio Leica LMD 6500 e condivisione di competenze e consulenza. L'acquisto e il supporto continuo di, il 6500 LMD è stato finanziato dal grant The National Institute of Mental Health, MH096625, Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo, NS105584, PHRI finanziamenti (per E.A.E) e contributi di GSK (a E.A.E).

Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, con l'approvazione del istituzionale Animal Care e uso Comitato dei NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. animali esperimenti e tessuto collezione
Questa sezione del protocollo descrive procedure animale e raccolta di campioni in condizioni di biosicurezza di livello 3 (BSL3). Protocolli dettagliati della tubercolosi del micobatterio aerosol infezione procedura gestione della droga e protocolli nei conigli sono stati descritti precedentemente11,12.
<ol><li>Infettare i conigli bianchi della Nuova Zelanda (maschi e femminile a 4-5 mesi di età) con M. tuberculosis HN878 utilizza un sistema di aerosol solo naso, come descritto in precedenza11.</li>
	<li>Amministrare le droghe selezionate (Etambutolo nell'esempio presentato qui) tramite l'itinerario preferito ed eutanasia degli animali a 2, 6 e 24 h dopo la somministrazione. In primo luogo, anestetizzare il coniglio mediante iniezione intramuscolare di ketamina a 35mg/kg e xilazina a 5 mg/kg. Attendere dieci minuti e confermare il corretto amputate pizzicando la coda e toccando delicatamente l'occhio. Se non c'è nessuna reazione, eutanasia di somministrazione endovenosa di pentobarbital e fenitoina (Vedi Tabella materiali) a 1 mL/4,5 kg in soluzione salina sterile mL 2. Nota: Questi punti temporali sono ottimali a coprire il profilo farmacocinetico di etambutolo e possono richiedere la regolazione/ottimizzazione per altri farmaci di studio.</li>
	<li>Utilizzando pinze, forbici o bisturi, rimuovere i polmoni dalla cavità toracica, resecare le biopsie del polmone che contiene grandi granulomi necrotici incorporati nel tessuto polmonare uninvolved (come descritto in precedenza3) circostante. Necrotici granulomi appaiono beige in colore e in genere sporgono leggermente dal polmone circostante di colore rosso/rosa. Per facilitare la facile cryosectioning, garantire che le biopsie sono non più grande di 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Mediante pinze, inserire la biopsia su un vassoio cryomold pre-etichettata con la superficie di taglio desiderata a diretto contatto con la base del vassoio. Dopo il congelamento, ciò fornirà una superficie piana da cui cryosections sarà tagliato.</li>
	<li>Congelare la biopsia in vapore di azoto liquido. Riempire un contenitore di polistirolo ad una profondità di 2 pollici con azoto liquido e una cremagliera del tubo di filo metallico. Il rack deve sporgere sopra la superficie dell'azoto liquido che fornisce una superficie piana su cui vengono posizionati i vassoi di tessuto. Riposizionare il coperchio sul contenitore di polistirolo e lasciare tessuti per 10 minuti per congelare completamente.</li>
	<li>Rimuovere i vassoi di tessuto, rapidamente avvolgere nella pellicola di alluminio e posizionare nel individualmente etichettati come guarnizione e sacchetti di plastica richiudibili. Trasferimento a-80 ° C congelatore per lo stoccaggio. Nota: Passaggi 1.1-1.6 vengono eseguiti in condizioni BSL3 (comprese tutte le lavoro animale e gestione di infetti di organi e tessuti). Gamma irradiare le biopsie del polmone alle 3 megarad per attivare gestione di fuori del contenimento BSL3. Microdissezione laser sul tessuto non sterilizzato devono essere eseguiti entro il BLS3 impianto se approvato protocolli di sicurezza sono a posto. Tuttavia, la parte restante del presente protocollo viene descritta l'elaborazione a valle in una struttura di BSL-2.</li>
</ol>2. tessuto di sezionamento
<ol><li>Impostare la temperatura di taglio desiderata del criostato. Trasferire la biopsia del polmone di gamma-irradiati da-80 ° C stoccaggio per criostato e lasciare per 30 minuti per equilibrare la temperatura del tessuto. Nota: -20-22 ° C è ottimale per le biopsie lesione di TB.</li>
	<li>Con una pinzetta, fissare la biopsia al mandrino criostato utilizzando una piccola quantità di adesivo di taglio ottimale temperatura (OCT) per aderire alla base del tessuto al mandrino. Orientare il tessuto in modo che la superficie piana (che era in contatto con la base della cryomold) è la superficie esposta per il taglio. Garantire che l'OCT non contaminare la superficie del tessuto, come questo potrebbe interferire con l'analisi di spettrometria di massa successiva.</li>
	<li>Tre sezioni di tessuto a 25 µm spessore di tagliare e montare sul PET membrana diapositive. Delicatamente toccare la membrana alla sezione di tessuto e rimuovere. Se si applica troppa pressione, la sottile membrana può strappare.<ol>
<li>Evitare movimenti eccessivi del microfono delle diapositive prima del montaggio come questo si tradurrà nella membrana PET diventando carica e scarsa aderenza delle sezioni del tessuto. Assicurarsi che la diapositiva di membrana viene mantenuta a temperatura ambiente per consentire disgelo-montaggio e successo aderenza del tessuto alla membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il vetrino dal criostato e lasciare asciugare all'aria per 3 minuti. Se non viene eseguita immediatamente LCM-LC/MS/MS, sigillare il vetrino in un piccolo sacchetto sigillabile ermetico e trasferire in memoria di-80 ° C fino a quando richiesto per la dissezione.</li>
	<li>Tagliare una sezione adiacente al 10-12 µm e disgelo-montaggio su un vetrino standard per colorazione ematossilina ed eosina (H & E) e riferimento. Sezioni aggiuntive possono essere tagliate in questo momento per altre macchie di istochimica desiderato (ad esempio Ziehl-Niellsen per la visualizzazione del Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>Rimuovere il sacchetto sigillato contenente la diapositiva da-80 ° C stoccaggio e permettono di raggiungere la temperatura ambiente per 5 minuti. Nota: Se la diapositiva fredda è esposto immediatamente nell'atmosfera del laboratorio, il tessuto sarà diventato rivestito con condensazione, e potrebbe essere compromessa l'integrità territoriale della droga.</li>
	<li>Accendere il microscopio e il laser (laser richiede 5-10 minuti di riscaldamento prima che possa iniziare il taglio). Caricare provette PCR piatto-cap 0,20 mL nel supporto.</li>
	<li>Rimuovere il vetrino dal sacchetto e prendere un'immagine ottica della sezione di tessuto sulla diapositiva PET utilizzando uno scanner piano.</li>
	<li>Porre il vetrino nel portavetrini (lato tessuto rivolto verso il basso) e assegnare tubi di raccolta differenziata a regioni specifiche granuloma di interesse utilizzando il software di microscopio. In genere, questi saranno 'uninvolved polmone,' 'cellular granuloma,' e 'caseum' (centro necrotico), ma può variare a seconda della patologia specifica di biopsia e del granuloma.</li>
	<li>Concentrarsi sul tessuto utilizzando la 5x obiettivo del microscopio. Questo ingrandimento dovrebbe fornire una buona panoramica del tessuto contenente entrambe le aree granuloma cellulare e necrotico. Nel software selezionare il tubo designato 'caseum' per spostarlo nella posizione sotto il tessuto.</li>
	<li>Inserire i parametri desiderati dissezione. Le impostazioni tipiche per una sezione di polmone spesse 25 µm sono laser Potenza 30, velocità 15 e aperture 35 (unità arbitrarie). Tuttavia, questi sarà diverso a seconda del microscopio utilizzato e potenziale diminuzione del potere a causa dell'età del laser.</li>
	<li>Selezionare lo strumento di disegno libero e, utilizzando un mouse o touchscreen penna, delineare la regione desiderata per la dissezione. L'area della superficie della regione verrà visualizzato nel software. Mantenere le regioni selezionate sotto 500.000 µm2 (0,5 mm2) per facilitare la dissezione più facile. Ripetere la dissezione fino a 3 milioni µm2 (3 mm2) sono stati raccolti in totale nel cappuccio del tubo.<ol>
<li>In occasione della regione dissecata potrebbe rimangono bloccata alla membrana circostante (per esempio a causa di attrazione statica) e non cadere nel tappo di raccolta. Rimuovere queste regioni della superficie cumulativo totale selezionando e rimuovere manualmente all'interno del software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare il tappo per 'lesione cellulare' e raccogliere 3 milioni µm2 del tessuto utilizzando lo stesso processo come descritto al punto 3.7.</li>
	<li>Selezionare il tappo per 'uninvolved polmone' e raccogliere 3 milioni µm2 del tessuto utilizzando lo stesso processo come descritto al punto 3.7. Nota che il tessuto polmonare uninvolved contiene molti bronchioli e gli spazi alveolari. Prestare particolare attenzione a escluderle dalle regioni definite del tessuto per la dissezione.</li>
	<li>Rimuovere il supporto di tappo e attentamente sganciare, sigillare ed etichettare ogni provetta. Proteggere i tessuti dissecati dalle circostanti dispersioni di aria (ad esempio, da interruzione di flusso di aria da una porta di apertura). Analizzare i tessuti dissecati immediatamente, o conservare a-80 ° C e scongelare prima di elaborazione e analisi LCMS.</li>
</ol>4. estrazione e analisi LCMS
<ol><li>Preparare la soluzione di estrazione di 1:1. acetonitrile/metanolo contenente standard interno d-10 di etambutolo. Quando si seleziona uno standard interno, uso una forma stabile con etichetta della droga dell'analita (ad esempio deuterio-etichetta EMB utilizzato in questa dimostrazione) con spostamento sufficiente massa per evitare isotopo cross talk tra l'analita droga e standard (di solito un minimo di 4 Dalton) . Nota: Creazione di omogenato di ogni tipo di tessuto rispettivi standard è difficile perché c'è un controllo molto limitato tessuto con cui creare omogeneato standard. In alternativa a rendere standard da un campione a spillo omogeneato, standard può essere creato aggiungendo tessuto vuoto e composto in esame insieme ed estrazione. Un volume di controllo tessuto in un omogeneato che corrisponde al volume dell'obiettivo delle sezioni di tessuto del campione di studio si combina direttamente con una quantità della sostanza in esame che sarà presente ad una concentrazione determinata.</li>
	<li>Calcolare il volume di tessuto mirato basato sulla superficie e spessore della sezione di tessuto e determinare il fattore di diluizione necessario per l'omogeneizzato utilizzando il volume dell'omogeneato che verrà aggiunti al standard e campioni QC. I calcoli sono illustrati sotto per un'area di destinazione dissecato2 (3 mm2) µm 3 milioni con un 25 µm spessore e 2 µ l di omogenato. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>Assumendo una densità di tessuto di 1 g/mL, preparare il brodo di omogenato di 50 mg di tessuto di controllo di pesatura e l'aggiunta di tampone PBS per diluire (utilizzando il fattore di diluizione di 26,67 omogeneato calcolato al punto 4.2, il diluente è 1,283 mL). Omogeneizzare mediante perlina battendo il tessuto polmonare e tampone PBS per 5 minuti a 1750 giri su un omogeneizzatore del tallone. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Diluire la concentrazione del farmaco scorte di 1 mg/mL in acetonitrile/acqua di 1:1 per creare la curva standard chiodare soluzioni. Determinare chiodare concentrazioni standard basate sul volume di spike e il volume del tessuto dell'obiettivo. L'esempio illustrato è per un 100 ng/mL standard utilizzando un 10 µ l di spike. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Rimuovere le provette contenenti i tessuti microdissected da-80 ° C stoccaggio e permettono di raggiungere la temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di soluzione di acetonitrile/acqua 1:1 e 2 µ l di tampone PBS le provette contenenti tessuto microdissected.</li>
	<li>Per curva standard ed i tubi di controllo qualità, aggiungere 10 µ l di soluzione a 2 µ l di controllo omogeneato del polmone di chiodare.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di estrazione in ogni provetta.</li>
	<li>Vortexare ciascuna provetta per 5 minuti, trattare con ultrasuoni per 5 minuti e centrifugare a 5000 RPM per 5 minuti per formare una pallina di pellicola e tessuto in ogni provetta.</li>
	<li>Trasferire 50 µ l del surnatante ad una piastra a 96 pozzetti profondi pozzetti e diluire con un ulteriore 50 µ l di acqua deionizzata in ogni pozzetto.</li>
	<li>Eseguire l'analisi LC/MS/MS utilizzando i parametri dello strumento ottimizzato per etambutolo ed etambutolo-d10 standard interno (come precedentemente descritto in dettaglio12).</li>
	<li>Utilizzare un fattore di diluizione per correggere la quantità esatta di tessuto dissecato per ciascun campione. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. metodo convalida
<ol><li>Creare un omogeneato nel tessuto polmonare controllo combinando 1 parte del polmone, 2 parti di PBS e perline d'acciaio 3-4. Battere il tessuto polmonare e tampone PBS per 5 minuti a 1750 giri utilizzando un omogeneizzatore del tallone.</li>
	<li>Spike omogeneato aggiungendo 10 µ l di 1 mg/mL di brodo di etambutolo DMSO nel 990 µ l omogeneato per creare una concentrazione finale di 10.000 ng/mL (10 mg/mL) e vortex per 1 minuto.</li>
	<li>Creare un blocco congelato omogeneato versando l'omogeneizzato in un cryomold e rapidamente congelamento il ghiaccio secco per 5 minuti.</li>
	<li>Preparare 25 µm spessore sezioni dal blocco omogeneato come descritto ai punti 2.1-2.5.</li>
	<li>Sezionare l'area di tessuto di destinazione come specificato nei passaggi 3.2-3.10.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l 1:1 acetonitrile/acqua e 2 µ l di tampone PBS le provette contenenti tessuto microdissected.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di estrazione in ogni provetta. Procedura il 4,9-4.12, per creare una curva standard e determinare la concentrazione di farmaco nel blocco di omogenato di tessuto.</li>
	<li>Calcolare l'efficienza di estrazione utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Risolto nello spazio di quantificazione delle droghe all'interno delle lesioni di TB polmonare è necessaria per determinare se esposizione al farmaco raggiunge concentrazioni sterilizzante a popolazioni batteriche risiedono gli scompartimenti differenti della lesione. Il metodo di LCM-LC/MS qui descritto consente la quantificazione assoluta delle droghe anti-TB all'interno tutti i compartimenti di lesione, tra cui il caseum ricchi di batteri, utilizzando sezioni di tessuto di solo 1-3 in totale. Omogeneizzazione dei tessuti tradizionali e approcci di LC/MS per la quantificazione del farmaco nel tessuto spesso mancano la specificità spazio per risolvere scomparti lesione specifica e anche quando è possibile, c'è un significativo potenziale di croce contaminare cellular e aree di lesione necrotica durante il processo di estrazione manuale.
L'approccio di LCM-LC/MS ha parecchi vantaggi chiave per tecnologie di imaging basati sulla spettrometria di massa. Primari fra questi sono le funzionalità completamente quantitative del metodo e la sensibilità supplementare dell'analisi LC/MS a causa di risoluzione di droga da interferire/soppressione endogena specie tramite separazione cromatografica. Tuttavia, MALDI-MSI fornisce che ulteriori informazioni territoriali per quanto riguarda la distribuzione del farmaco. Come LCM-LC/MS/MS e MALDI-MSI richiedono la stessa procedura di preparazione del campione per generare sezioni di tessuto congelato, le due tecniche possono essere eseguite in parallelo sulla biopsia del tessuto stesso fornendo quantificazione completa al fianco di immagini altamente dettagliate di droga distribuzione. Nella Figura 3è riportato un esempio del requisito di più alta sensibilità analitica. Solo molto bassi livelli di segnale EMB sono stati rilevati nella regione centrale granuloma necrotico dell'immagine MALDI MS (mostrato in Figura 3B), suggerendo caseum penetrazione del farmaco è scarsa. Tuttavia, a causa del limite superiore di rilevazione di LCM-LC/MS la droga è stata chiaramente dimostrata per raggiungere concentrazioni di sterilizzazione all'interno di quel vano e la concentrazione di farmaco presente era principalmente inosservabile da MALDI (Figura 3A).
Protocolli di colorazione dei tessuti sono in genere utilizzati prima del LCM per applicazioni della proteomica per consentire la facile identificazione di aree di tessuto e le popolazioni delle cellule che si trova all'interno. Routine di istochimica macchie come H & E non sono compatibili con quantificazione di droga, come il solvente di molte fasi di lavaggio coinvolti sarebbe delocalizzare la droga dalla sezione del tessuto. Sezioni di taglio adiacenti possono essere macchiate con H & E e utilizzate come una guida per microdissection. Tuttavia, questo non è solitamente necessario, come i vani di lesione possono essere risolto otticamente al microscopio standard LCM campo chiaro (Figura 2).
Ottimizzazione delle operazioni di sezionamento e microdissection è cruciale per la quantificazione di successo lesione. Durante lo sviluppo del metodo, abbiamo valutato due materiali differenti della membrana, polietilene tereftalato (PET) e polietilene naftalato (penna), come substrato per le sezioni di tessuto per microdissezione di montaggio. Membrane di penna ha sofferto da cariche statiche maggiore rispetto alle membrane PET e circa il 30% di tutte le aree di tessuto dissecato sono stati persi a causa della statica attrazione tra la regione di tessuto dissecato e la membrana. Per questo motivo, le membrane PET sono stati scelti per le dissezioni future dovuto l'attrazione statica significativamente ridotta osservata (solo 5% delle regioni dissecate dalle membrane di PET sono stati persi durante il processo di LCM).
La stabilità dei farmaci all'interno di sezioni di tessuto è una considerazione importante quando si progetta uno studio LCM-LC/MS. Durante il processo di dissezione e di sezionamento, le sezioni di tessuto sono esposti a temperatura di laboratorio e luce per un periodo di almeno 1 ora. Altri problemi da considerare includono l'efficienza di estrazione della droga dalle sezioni di tessuto, come non c'è nessun passaggio di omogeneizzazione coinvolto (estrazione viene eseguita solo dal vortice di miscelazione e sonicazione). Nella nostra esperienza, l'estrazione non soffre la mancanza di omogeneizzazione del tessuto dovuto il solvente di estrazione alto rapporto tessuto utilizzato e la sottigliezza delle sezioni di tessuto dissecato. Le nostre osservazioni sono in accordo con un metodo LCM-LC/MS online precedentemente descritto sviluppato per quantificare propranololo in sezioni di tessuto microdissected del cervello e del fegato, dove è stata osservata completa estrazione del farmaco dal tessuto da 20 µm e dello spessore di 40 µm sezioni10. Abbiamo validato l'efficienza di estrazione della droga e la stabilità di droga durante il processo di LCM confrontando direttamente le concentrazioni nel tessuto polmonare (dal coniglio stesso e del lobo del polmone) analizzati da LCM-LC/MS con concentrazioni determinate mediante tessuti standard omogeneizzazione e LC/MS (un esempio è mostrato nella tabella 1). Questo confronto permette di determinare se qualsiasi cambiamento del segnale si verifica tra le due metodologie.
La densità delle regioni di tessuto dissecato è anche una considerazione importante quando quantificare i livelli della droga basata sulla superficie del tessuto o il volume. Questo è di particolare interesse per le biopsie del polmone e lesioni, in cui le aree di tessuto polmonare uninvolved hanno una densità complessiva inferiore a quella caseum e cellulare (meno tessuto che copre la stessa superficie relativa) dovuto alla presenza di multiple bronchioli aperte e spazi alveolari. Gli effetti di questa differenza di densità possono essere attenuati disegnando accuratamente intorno gli spazi aperti per evitare la loro inclusione all'interno dell'area di superficie cumulativa del tessuto raccolto (come mostrato nella Figura 2).
Un'ulteriore limitazione è che il metodo di LCM-LC/MS presentato solo quantifica la concentrazione di farmaco totale all'interno del tessuto isolato (in comune con tutti i tessuto omogeneizzazione, estrazione con solvente e approcci di quantificazione di LC/MS) e non risolve concentrazioni di farmaco legato alle proteine dalle frazioni non associate. Microdialisi sono un approccio alternativo per la quantificazione del farmaco non legato all'interno del tessuto e permette la quantificazione accurata delle concentrazioni di farmaco libero raggiungendo extracellulare popolazioni di batteri13. Tuttavia, la tecnica sarebbe meglio essere applicata come un approccio complementare, quanto manca la specificità spazio di LCM-LC/MS e quantifica solo livelli di farmaco solubile nel liquido extracellulare del tessuto, non il contenuto intracellulare.
Abbiamo combinato, per la prima volta, LCM e LC/MS spazialmente quantificare gli antibiotici al luogo dell'infezione di tubercolosi. La metodologia è tremendamente potente dal momento che può essere applicato a qualsiasi piccola molecola farmaco usato in qualsiasi stato di malattia. Infatti, abbiamo recentemente abbiamo quantificato un candidato farmaco antimicotico in un modello murino di candidosi addominale14. Droga differenziale suddivisione in compartimenti di tumore eterogeneo (tra cui core necrotici) è una preoccupazione primaria nel trattamento del cancro e un'area critica della ricerca nel cancro droga scoperta15. LCM-LC/MS è ideale per avvicinarsi a queste domande. Inoltre, LCM-LC/MS può essere utilizzata per la scoperta del biomarcatore quantificare metabolica, lipidomica e proteomica cambiamenti che si verificano nel tessuto regioni e popolazioni di cellule durante la patogenesi della malattia.

La capacità di risolvere spazialmente e di quantificare i livelli della droga è un requisito essenziale per determinare se i farmaci antitubercolari raggiungono sottopopolazioni batteriche all'interno delle lesioni polmonari a sterilizzare le concentrazioni1. Di particolare importanza è determinante la penetrazione del farmaco nel nucleo necrotico della lesione (chiamato caseum), che in genere contiene il più alto numero di bacilli e può essere scarsamente accessibile ai farmaci a causa dell'assenza di vascolarizzazione.
Metodi tradizionali per valutare la penetrazione della lesione, che coinvolgono omogeneizzazione delle lesioni polmonari asportate seguita da estrazione con solvente e analisi di spettrometria di massa (LC/MS) cromatografia liquida, sono altamente sensibili e selettivi per i farmaci di interesse. Tuttavia, questi metodi offrono scarsa informazione spaziale, limitato alla dimensione del tessuto omogeneizzato originale. Approcci di imaging basati sulla spettrometria di massa, ad esempio matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)2,3, desorbimento electrospray ionizzazione (DESI)4 o estrazione liquido-aumentata della superficie5, 6 offrono funzionalità di imaging altamente spazialmente risolto, ma diretta quantificazione può essere estremamente difficile o impossibile a causa di effetti di soppressione di ioni eterogenee e diverse efficienze di estrazione dell'analita dalla cella vari o7tipi di tessuto. Inoltre, approcci di imaging tessuto MS più diretti sono intrinsecamente meno sensibili di LC/MS a causa della mancanza di separazione cromatografica delle specie endogene in competizione per la ionizzazione e l'efficienza di estrazione con solvente più bassa del farmaco dal tessuto.
Microdissezione laser (LCM) combinato con analisi LC/MS è stato ordinariamente applicato per isolare e caratterizzare regioni di tessuto distinti per studi di proteomica8,9 e recentemente utilizzato per la quantificazione di droga in dosato tessuto animale10. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato l'applicazione LCM combinato con analisi LC/MS (LCM-LC/MS) per quantificare le droghe anti-TB nei raggruppamenti distinti granuloma. In lavorazione con il laser capture microdissection, un laser UV è focalizzato attraverso l'obiettivo del microscopio sulla sezione del tessuto, che taglia e che consenta di isolare l'area di tessuto desiderato seguendo un percorso definito dall'utente. Per gravità assistita LCM (la tecnica usata per questa ricerca), la sezione di tessuto è montata su un vetrino di membrana sottile polimero (PET o PEN) e il tessuto viene catturato in un cappuccio del tubo di raccolta situato sotto la diapositiva. I farmaci vengono estratti dal tessuto asportato e quantificati tramite approcci standard LC/MS. La quantità di tessuto devono essere raccolti in definitiva è determinata dalla concentrazione prevista della droga presente nel tessuto e la sensibilità del metodo LC/MS. Per la maggior parte delle analisi delle droghe dosato a livelli terapeutici e analizzati usando uno spettrometro di massa di routine triplo quadrupolo, 3 milioni µm2 (3 mm2) del tessuto superficie è sufficiente.
Questo protocollo descrive la potente combinazione di analisi spaziale e quantificazione completo offerto da LCM-LC/MS, fornendo concentrazioni nella droga assoluta all'interno di tutti i comparti dei granulomi di TB. La tecnica può essere applicata anche per determinare le concentrazioni di farmaco in molti diversi tessuti malati, fornendo informazioni di scoperta e sviluppo della droga vitale.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White rabbits</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL flat-cap PCR tubes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Steel frames, PET-membrane</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Deep well plate 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &amp;mu;m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Zipper&amp;rdquo; Seal Sample Bags</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860 is the current model</td></tr><tr><td>Laser Microdissection System 6500</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica LMD 6 is the current model</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

La tubercolosi è ancora delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Miglioramenti a terapie farmacologiche esistenti e lo sviluppo di approcci terapeutici sono urgentemente necessari. La capacità di dosata TB farmaci per raggiungere e sterilizzare i batteri all'interno di aree necrotiche scarsamente vascolarizzato (caseum) di granulomi polmonari è cruciale per un riuscito intervento terapeutico. I regimi terapeutici efficaci devono pertanto contenere farmaci con proprietà di penetrazione caseum favorevole. Attuali metodi di LC/MS per quantificare i livelli di farmaco nei tessuti biologici hanno limitato la capacità di risoluzione spaziale, rende difficile determinare con precisione le concentrazioni nella droga assoluta all'interno di piccoli compartimenti come quelle che si trovano all'interno granulomi necrotici. Qui presentiamo un protocollo che unisce la microdissezione laser (LCM) delle regioni di tessuto patologico distinti con quantificazione di LC/MS. Questa tecnica fornisce quantificazione assoluta di farmaci all'interno del granuloma caseum, che circonda la lesione cellulare e tessuto polmonare uninvolved e, pertanto, con precisione determina se le concentrazioni battericide sono stati raggiunti. Oltre alla ricerca di tubercolosi, la tecnica ha molte applicazioni potenziali per risolta spazialmente quantificazione delle droghe in tessuti malati.

Una panoramica dell'approccio LCM-LC/MS è illustrata nella Figura 1. Dopo la sterilizzazione il tessuto di irradiazione gamma, tutti i passaggi successivi (dal tessuto sezionamento in poi) si svolgono di fuori di condizioni BSL3. La figura 2 Mostra la lesione dalle sezioni di biopsia prima e dopo l'isolamento del tessuto di LCM. Aree necrotiche e cellulari delle lesioni TB possono essere facilmente identificate ed isolate mediante ispezione visiva delle immagini ottiche da solo (senza l'obbligo di fare riferimento alle sezioni di tessuto adiacente istologicamente macchiato). Il processo di dissezione produce un taglio netto con il minimo disturbo al tessuto circostante, e 3 milioni di dissezione µm2 (3 mm2) di ogni regione di interesse dalle lesioni richiede circa 1 ora in totale.
L'efficienza di estrazione e la stabilità del metodo LCM-LC/MS è stata valutata utilizzando omogeneato del polmone Ethambutol EMB-spillo (tabella 1). Estrazione completa della droga è stato osservato, e senza problemi di stabilità del farmaco sono stati rilevati attraverso il processo di estrazione e di dissezione. Il protocollo di estrazione e quantificazione di LCM-LC/MS è stato ulteriormente convalidato confrontando a metodi di quantificazione stabiliti LC/MS applicate ai tessuti stessi. A causa dell'eterogeneità intrinseca delle lesioni necrotiche di TB polmonare e la scarsa specificità spazio offerti da omogeneizzazione del tessuto standard, abbiamo validato il metodo LCM-LC/MS confrontando direttamente le concentrazioni di farmaco nel polmone uninvolved analizzati da entrambi tecniche analitiche (a causa della sua omogeneità del tessuto relativamente alta). La tabella 2 Mostra le concentrazioni di farmaco nel polmone uninvolved da biopsie prelevati da tre conigli Ethambutol-dosati come valutato da: 1) omogeneizzazione 25 µm sezioni di tessuto spesso e ad analizzare standard LC/MS e analisi 2) LCM-LC/MS del polmone uninvolved aree prelevate da una sezione di tessuto spesso adiacente 25 µm. I dati mostrano che due approcci producono dati di quantificazione coerente, dimostrando l'idoneità per la sistematica quantificazione spaziale.
Abbiamo applicato LCM-LC/MS per spazialmente-quantificare molti farmaci antitubercolari esistenti e romanzo all'interno delle lesioni polmonari. Figura 3A Mostra i dati di esempio da conigli infettati MTB dosato allo steady-state con etambutolo. LCM-LC/MS abilitato completo quantificazione del farmaco risolto entro caseum, lesione cellulare e aree di tessuto polmonare uninvolved. EMB è stata osservata per penetrare bene nella lesione e raggiungere concentrazioni di sterilizzazione all'interno il caseum necrotico. L'immagine corrispondente di MALDI-MS di distribuzione EMB acquisito da una sezione di tessuto adiacente è mostrata nella Figura 3B. Le immagini di MALDI-MS qualitative correla bene con i dati quantitativi di LCM-LC/MS con concentrazioni più basse di droga rilevate nel caseum necrotico in confronto il cellulare rim. LCM-LC/MS dati è stati convalidati dal confronto diretto a omogenati analizzati da standard LC/MS.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57402/57402fig1.jpg"> Figura 1 : Schematica del processo di LCM-LC/MS. Le biopsie del polmone di coniglio contenente lesione necrotica con circostante uninvolved del polmone sono raccolti e congelate. Cryosections sono tagliati sulle sottili membrane di PET e aree di lesione cellulare e caseosa uninvolved del polmone, sono sezionati e isolati per la quantificazione di LC/MS. adattato da Zimmerman et al. 12 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57402/57402fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57402/57402fig2.jpg"> Figura 2 : Lesione (A, B) e uninvolved polmone (C, D) come essi appaiono quando viene visualizzata utilizzando il microscopio prima (A, C) e dopo (B, D) microdissection. Aree di lesione caseosa appaiono più scure e 'incrinato' nella scansione immagine ottica (un, contorno verde). Lesione cellulare è di colore più chiaro e più solida nella struttura (A, contorno rosso). Uninvolved polmonare deve essere campionati almeno 5 mm di distanza dal confine di lesione e appare rosso/rosa a colori (C, ciano outline). Scala bar (nero, blu e viola) = 400 µm. nota che solo le aree di polmone uninvolved tinta unita devono essere selezionate per evitare di includere gli spazi alveolari e bronchioli della superficie totale del tessuto raccolto (come mostrato a D). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57402/57402fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57402/57402fig3.jpg"> Figura 3 : Esempio LCM-LC/MS dataset da biopsie lesione prelevati da due conigli trattati con 100 mg/kg EMB per 7 giorni. (A) favorevole penetrazione del farmaco in tutti i compartimenti del polmone e la lesione è stata osservata. Le concentrazioni di farmaco quantificate da LCM-LC/MS (barre forate) /MS erano in forte sintonia con quelli quantificati dalle lesioni dissecate omogeneizzate da standard LC/MS (solido bar, media ± deviazione standard, n = 3-8). Sono indicate le concentrazioni minime richieste per uccidere il 99% dei bacilli replicanti extracellulari (MBC99) e il 99% dei bacilli intracellulari nei macrofagi (iMBC99). Pannello superiore (B) : immagine di MALDI-MS mostrano la distribuzione di EMB dello ione [M + H]+ (m/z 205.193) all'interno di una sezione di tessuto adiacente. Si noti che l'immagine di MALDI-MS suggerisce scarsa penetrazione di EMB Il caseum a causa delle concentrazioni di farmaco presente essendo sotto il limite inferiore di rilevabilità (LOD) della tecnica. Tuttavia, la specificità spaziali e superior LOD di LCM-LC/MS mostrano che la droga sta raggiungendo concentrazioni di sterilizzazione all'interno tutti i compartimenti di lesione compreso il caseum. Pannello inferiore: ematossilina ed eosina macchiato tessuto sezione direttamente adiacente alla sezione usata per MALDI MSI. Cellular (C) e granulomi necrotici (NG) erano presenti nel tessuto. Il nucleo di caseum è delineato in bianco. Adattato da Zimmerman et al. 12 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57402/57402fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Area dissecata (µm2)</td>
			<td>Misurato conc. EMB (ng/g) (n = 3)</td>
			<td>Recupero di EMB (%) (n = 3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 milioni</td>
			<td>10633 (±404)</td>
			<td>106 (± 4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 milioni</td>
			<td>10057 (±1132)</td>
			<td>101 (± 11)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 milioni</td>
			<td>10563 (±1128)</td>
			<td>105 ± (11)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Efficienza di estrazione del metodo per quantificare EMB nel polmone di LC-LC/MS. Recupero completo di EMB è stato osservato nei tessuti EMB spillo polmone omogeneato sezionato per tutti i volumi di tessuto valutati.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID di coniglio</td>
			<td>LC/MS EMB (ng/g)</td>
			<td>LCM-LC/MS EMB (ng/g)</td>
			<td>Differenza (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>899</td>
			<td>2910</td>
			<td>3320</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>904</td>
			<td>2010</td>
			<td>1870</td>
			<td>-7</td>
		</tr>
<tr>
<td>911</td>
			<td>2150</td>
			<td>2370</td>
			<td>9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Confronto di EMB quantificazione in biopsie del polmone uninvolved da 3 conigli dosati di LC/MS e LCM-LC/MS. Concentrazioni di farmaco equivalente sono state rilevate da metodi e nessuna perdita di segnale a causa di degrado o estrazione durante il processo di LCM-LC/MS è stata osservata.

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Qui, descriviamo un protocollo utilizzando laser capture microdissection accoppiato con analisi LC/MS spazialmente-quantificare distribuzioni di droga all'interno dei granulomi della tubercolosi polmonare. L'approccio ha ampia applicabilità a quantificare le concentrazioni di farmaco all'interno di tessuti ad alto dettaglio spaziale.

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Nanyang Technological University

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

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9.0K Views.  Rutgers, The State University of New Jersey. Qui, descriviamo un protocollo utilizzando laser capture microdissection accoppiato con analisi LC/MS spazialmente-quantificare distribuzioni di droga all'interno dei granulomi della tubercolosi polmonare. L'approccio ha ampia applicabilità a quantificare le concentrazioni di farmaco all'interno di tessuti ad alto dettaglio spaziale.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Una spettroscopia Raman integrata e una piattaforma di spettrometria di massa per studiare l'assorbimento di farmaci a singola cellula, il metabolismo e gli effetti

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Biochimica

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analisi di 18FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. Human-infective trypanosomatid parasites include Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease; Trypanosoma brucei, the&#160;causative agent of sleeping sickness; and Leishmania species, causative agents of leishmaniasis. Jointly, they affect 20 million people across the globe. These parasites show specific tropism: heart, esophagus, colon for T. cruzi, adipose tissue, pancreas, skin, circulatory system and central nervous system for T. brucei, skin for dermotropic Leishmania strains, and liver, spleen, and bone marrow for viscerotropic Leishmania strains. A spatial perspective is therefore essential to understand trypanosomatid disease pathogenesis. Chemical cartography generates 3D visualizations of small molecule abundance generated via liquid chromatography-mass spectrometry, in comparison to microbiological and immunological parameters. This protocol demonstrates how chemical cartography can be applied to study pathogenic processes during trypanosomatid infection, beginning from systematic tissue sampling and metabolite extraction, followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, and concluding with the generation of 3D maps of metabolite distribution. This method can be used for multiple research questions, such as nutrient requirements for tissue colonization by T. cruzi, T. brucei, or Leishmania, immunometabolism at sites of infection, and the relationship between local tissue metabolic perturbation and clinical disease symptoms, leading to comprehensive insight into trypanosomatid disease pathogenesis.

This protocol describes the steps to generate a 3D model of metabolite distribution during trypanosomatid infection, including sample collection, metabolite extraction, an overview of liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, 3D model generation, and finally, data visualization.

Approcci cartografici chimici per studiare l'infezione da tripanosomatidi

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Pannello LC-MS/MS convalidato per quantificare 11 farmaci TB resistenti ai farmaci in piccoli campioni di capelli

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Medicina

Accelerazione della determinazione della tubercolosi con il metodo Micro-CFU

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

Autore in primo piano: Ottimizzazione della determinazione delle CFU per una valutazione efficiente dell'efficacia del vaccino contro la tubercolosi e dell'analisi della presentazione dell'antigene 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Preparazione del campione di

Una spettroscopia Raman integrata e una piattaforma di spettrometria di massa per studiare l'assorbimento di farmaci a singola cellula, il metabolismo e gli effetti

Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su

Un

Analisi di ¹⁸FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

Approcci cartografici chimici per studiare l'infezione da tripanosomatidi

Pannello LC-MS/MS convalidato per quantificare 11 farmaci TB resistenti ai farmaci in piccoli campioni di capelli

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi