Gli autori vorrei ringraziare Nathan Johnson per la sua assistenza nel preparare le figure. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma Pan-omics che è finanziato da l'US Department of Energy Office di biologico e la ricerca ambientale (Genomic Science Program), il microbiomi in transizione (menta) laboratorio diretto lo sviluppo della ricerca Iniziativa presso il Pacific Northwest National Laboratory, come pure la nazionale istituti di salute nazionali Institute di Environmental Health Sciences (R01 ES022190) e NIH (P42 ES027704). KEBJ vorrei ringraziare R21 HD084788 sostegno finanziario sviluppare e validare nuovi multi-omic tecniche di estrazione. Quest'opera è stata eseguita nel W. R. Wiley ambientale molecolare Scienze laboratorio (EMSL), un impianto di utente scientifico nazionale DOE al laboratorio nazionale di nord-ovest Pacifico (PNNL). PNNL è un laboratorio nazionale multi-programma operato da Battelle per il DOE sotto contratto DE-AC06-76RL01830.

Nota: Terreni molto bagnati possono essere liofilizzati prima dell'estrazione senza pregiudicare l'efficacia dell'estrazione. Terreno bagnato può anche essere usato, ma dovrebbe essere considerato quando si aggiungono i reagenti specifici rapporti.
Nota: Si consiglia di utilizzare 20 g di peso secco del terreno per estrazione, che deve essere diviso tra due provette da 50 mL (massimo di suolo 10g per tubo da 50 mL). Le estrazioni possono essere scalate in su o in giù dipende dal campione disponibile.
Nota: I campioni di terreno asciutto possono essere setacciati attraverso uno schermo di 3 mm al fine di omogeneizzare e rimuovere rocce e piccole radici. Campioni di suolo bagnato, non del setaccio come il campione si blocca nella schermata.
1. terra lisi delle cellule e l'estrazione di metaboliti, proteine e lipidi (Timing ~ 1 d)
<ol><li>Al campione di suolo di 20 g, pesare 10 g in due tubi separati 50 mL che sono metanolo/cloroformio compatibile. Essere molto attenti con i tubi scelti, come cloroformio percolare la maggior parte delle plastiche, contaminando i campioni. Utilizzare il vetro ogni volta che possibili o plastica tubi realizzati in polipropilene o politetrafluoroetilene (PTFE). Nota: Mantenere il terreno sul ghiaccio e come fresco come possibile durante le fasi iniziali di pesatura e omogeneizzazione.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di cloroformio-lavato in acciaio inox e granati perline ad ogni provetta. Il ghiaccio, aggiungere 4 mL di freddo ultrapura acqua (Vedi Tabella materiali per impianto di depurazione) in ogni provetta (uno campione split tra i due tubi) e trasferire i campioni in un secchio di ghiaccio in una cappa aspirante.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sierologica di vetro di 25 mL, rapidamente aggiungere 20 mL di ghiaccio 2:1 cloroformio: metanolo (v/v). Attenzione: Cloroformio: metanolo ha effetti potenziali sulla salute acuti: pelle irritazione, possibili ustioni chimiche e irritazione alle vie respiratorie. Può interessare i reni, fegato e cuore. Indossare guanti, indumenti e occhiali di protezione adatti e lavorare sempre in una cappa aspirante.</li>
	<li>Serrare i coperchi e vortice nella soluzione. 2:1 choloroform:methanol aiuta a rompere la parete cellulare dei procarioti ed inattiva anche attività enzimatiche.</li>
	<li>Se possibile, fissare i tubi da 50 mL tubo vortex allegati e orizzontalmente vortexare per 10 min a 4 ° C all'interno di un frigorifero. Quindi, inserire i campioni all'interno di un congelatore-80 ° C per circa 15 min per raffreddare completamente.</li>
	<li>Utilizzando un sonicatore sonda all'interno di una cappa aspirante, Sonicare ogni campione con una sonda di 6 mm (1/4") a ampiezza 60% per 30 s ogni sul ghiaccio. Attenzione: Si consiglia di utilizzare un suono di cedimento, custodia e cuffie di protezione mentre sonicating. Alta tensione è presente il cavo di alimentazione e ad alta frequenza di alimentazione. Evitare di toccare la parte inferiore o i lati della nave del campione con una sonda attiva; si può rompere o fondere la plastica.</li>
	<li>Posizionare i campioni nel congelatore-80 ° C per circa 15 min, come sonicating può generare un sacco di calore.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.5-1.7. Nota: Assicurarsi che i campioni di rimanere freddi durante tutta la procedura di lisi.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 4.000 x g per 5 min, 4 ° C. A questo punto, il campione sarà divisi nello strato superiore del metabolita, l'intercalare di proteina e il più basso strato lipidico (e pallina restante di detriti). Vedere la Figura 1.</li>
	<li>I campioni su ghiaccio nel secchiello del ghiaccio e, all'interno di una cappa aspirante e utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 10 mL, rimuovere i livelli di metabolita superiore dalle due provette da 50 mL in flaconcino di vetro di grandi dimensioni una. Nota: Evitare di aspirare qualsiasi del livello di proteina nella pipetta; lasciare un piccolo strato di metabolita se necessario.</li>
	<li>Inclinare leggermente il tubo da 50 mL per rilasciare l'intercalare di proteina, in modo che è fluttuazione libera al momento lo strato lipidico inferiore. Con una spatola di laboratorio testa piatta di acciaio inossidabile pulito accuratamente scoop entrambi degli intercalari proteina e metterli insieme in una nuova provetta da 50 mL.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sierologica di vetro 25ml, rimuovere gli strati più bassi del lipido in un flaconcino di vetro di grandi dimensioni. Nota: Cercate di evitare gli aspiranti particelle di suolo; Tuttavia, alcuni suolo detriti e particelle aspiravano lungo con i lipidi verranno rimosso in un secondo momento.</li>
	<li>Posto membrane traspiranti sopra la parte superiore del metabolita e lipidica flaconi in vetro e asciugare in un concentratore a vuoto fino a secchezza (lipidi ~ 4-5 h, metaboliti durante la notte).</li>
	<li>La provetta del campione di proteina e i rimanenti tubi pellet di detriti, aggiungere 20 mL di metanolo ghiacciato a ciascuno e vortex. Questo viene fatto per i pellet di detriti per lavare via cloroformio prima di tentare di solubilizzare eventuali possibili proteine restanti fuori i detriti prima di buttarla.</li>
	<li>Centrifugare i detriti pellet e le proteine dello strato intermedio a 4.000 x g per 5 min, 4 ° C, poi decantare il metanolo in un contenitore di rifiuti pericolosi all'interno di una cappa aspirante.</li>
	<li>Congelare le palline di proteine e detriti in azoto liquido e asciugare in un liofilizzatori (con una temperatura del collettore in grado di-105 ° C a causa di metanolo con un molto basso punto di congelamento di-98 ° C) per ~ 2 ore. Nota: Non asciugare troppo i pellet, quanto saranno più difficili da sciogliere.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di buffer di solubilizzazione della proteina (4% SDS, 100mM DTT (DL-dithiothreitol) in tampone tris 50mM, pH 8.0; si veda Supplementari reagente set-up) al tubo dello strato intermedio della proteina e 20 mL a ciascuno dei pellet detriti. Attenzione: SDS causa tossicità acuta ed è infiammabile. È una pelle, occhi e irritante delle vie respiratorie. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.</li>
	<li>Nella cappa fumi, sonda ultrasuoni i campioni ad ampiezza di 20% per 30 s per portarli in soluzione. Vortex per 2 min.</li>
	<li>Inserire l'esempio dello strato intermedio di proteina in un rotatore del tubo di laboratorio a 300 giri/min, 50 ° C, per 30 minuti per solubilizzare le proteine.</li>
	<li>Orizzontalmente vortice i campioni di detriti per altri 10 min a lisare eventuali restanti cellule intatte, quindi ruotare con i campioni dello strato intermedio della proteina per il restante 20 min.</li>
	<li>Tutti i campioni a 4.500 x g per 10 min, temperatura ambiente (TA), centrifugare e raccogliere il surnatante da ciascuna provetta per campione in due provette da 50 mL.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di solubilizzazione del buffer al pellet di proteine dello strato intermedio, quindi sottoporre ad ultrasuoni e vortice in soluzione e centrifugare di nuovo come prima.</li>
	<li>Combinare ugualmente i surnatanti nelle due provette da 50 mL e centrifugare a 8.000 x g per 10 min, 4 ° C, in un rotore ad angolo fisso. Nota: Una centrifugazione finale è necessaria rimuovere sostanze umiche contaminazione eccessiva.</li>
	<li>Decantare i surnatanti in due provette da 50 mL in modo che c'è 30 mL in ciascuna. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 10 mL, aggiungere 7,5 mL di TCA (acido tricloroacetico) ad ogni provetta. Vortice in soluzione. Questo rende 20% TCA in ciascun campione di 30 mL (regolare di conseguenza), Attenzione: TCA è caustica, tossica e maggio causare ustioni della pelle. Indossare guanti e occhiali di sicurezza.</li>
	<li>Posizionare i campioni in un congelatore a-20 ° C per 2 h per una notte. Nota: Proteine precipitano in genere entro 1 h ma possono essere lasciato durante la notte (fino a 18 h). Nota: Non lasciare che l'estrazione del TCA andare più di 18 h a causa di possibile idrolisi acida della proteina. Se il campione è congelato, scongelare su ghiaccio; non lasciare che il campione scaldare passato disgelo.</li>
	<li>Per pellet la proteina precipitata, centrifugare il campione a 4.500 x g per 10 min, 4 ° C e decantare il supernatante in rifiuti.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di acetone ghiacciata 100% per ogni pallina di proteina, vortice e si combinano come pellet in una provetta.</li>
	<li>Centrifugare la provetta contenente il pellet combinato (usando una bilancia) e quindi decantare il supernatante in rifiuti. Attenzione: Acetone può causare delle vie respiratorie e irritazione cutanea e oculare ed è un liquido e vapori infiammabili. Indossare un camice da laboratorio e occhiali di protezione guanti, lavoro in una cappa aspirante.</li>
	<li>Lavare la pallina due volte con 1,5 mL di acetone e infine trasferimento in una provetta da 2 mL per la centrifuga finale a 10.000 x g per 5 min.</li>
	<li>Decantare il supernatante in rifiuti e lasciar invertito il pellet ad asciugare su una salvietta di carta in una cappa per ~ 20 min o sotto un flusso di azoto fino a quando la pallina inizia leggermente a crepa.</li>
	<li>100-200 µ l di buffer di solubilizzazione di proteina, a seconda della dimensione del pellet. Nota: Tenere il volume di tampone di solubilizzazione aggiunto al campione più basso possibile. Successivi filtro Aided campione preparazione (FASP) può utilizzare solo fino a 50 μL di campione solubilizzato per colonna; qualsiasi più deve essere suddiviso in più colonne FASP.</li>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni e vortice la pallina nella soluzione. Si noti che il campione può essere viscoso a causa di sostanze umiche precipitando insieme con la proteina, che sarà rimossi con una successiva centrifugazione.</li>
	<li>Agitare il campione in un incubatore/agitatore per 30 min a 300 giri/min, 40 ° C, per solubilizzare le proteine in soluzione e procedere alla digestione delle proteine.</li>
	<li>Snap congelare il campione in azoto liquido e conservare in un congelatore a-80 ° C fino al momento per la digestione delle proteine.</li>
</ol>2. lipidi preparazione (temporizzazione ~ 20 min)
<ol><li>Una volta che i campioni del lipido sono asciutti, aggiungere 200 μL di 2:1 cloroformio: metanolo nel flaconcino, vortice in soluzione e trasferimento in una provetta da 1,5 mL in polipropilene, di aggiungere un ulteriore 200 μL al vetro fiala, vortice e pipettare i lipidi rimanenti e trasferire al tubo.</li>
	<li>Centrifugare i detriti fuori il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in un flaconcino di vetro del lipido e conservare a-20 ° C fino all'analisi LC-MS/MS (ulteriori dettagli per LC-MS/MS in Metodi supplementari).</li>
	<li>Se i campioni non possono essere analizzati immediatamente dopo la preparazione, i lipidi devono essere memorizzati in solvente a-20 ° C per evitare ossidazione e degradazione.</li>
</ol>3. metabolita preparazione e derivatizzazione (temporizzazione ~ 5 h)
<ol><li>Il giorno dopo l'estrazione, rimuovere i campioni di metabolita dal Vac velocità e memorizzare secco a-20 ° C fino al momento per la derivatizzazione e analisi sul GC. Se non in esecuzione i metaboliti su un GC, poi prepararli utilizzando il protocollo appropriato per lo strumento.</li>
	<li>Immediatamente prima di derivatizzante i metaboliti per analisi sul GC, trasferirli dalle fiale di vetro di grandi dimensioni con l'aggiunta di 200 μL di metanolo, Vortex e aggiungendo ad un tubo in polipropilene 1,5 mL. Ripetere una volta.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 10 min, 4 ° C. Trasferire il surnatante in piccole fiale di vetro, aggiungere una membrana traspirante nella parte superiore e completamente asciutta in un Vac di velocità.</li>
	<li>I metaboliti di derivatizzare aggiungendo 20 µ l di soluzione di dimethylamine la fiala del campione e vortex per 30 s su un Vortex a velocità media. Attenzione: Dimethylamine cloridrato provoca gravi ustioni e gravi lesioni oculari, può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Indossare occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio e lavorare in una cappa aspirante.</li>
	<li>Utilizzare un sonicatore vasca per garantire che il campione è completamente sciolto.</li>
	<li>Incubare il campione in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione mantenuto a 37 ° C per 1 h e 30 min con 1.000 giri/min agitazione.</li>
	<li>Capovolgere il flaconcino una volta per mescolare i campioni con gocce di condensate sulla superficie del tappo. Selezione del campione verso il basso a 1.000 x g per 1 min, RT</li>
	<li>Eseguire la sililazione aggiungendo 80 µ l (usando una siringa) di N-metil - N-(trimetilsilile) trifluoroacetamide con trimethylchlorosilane di 1%. Vortexare per 10 sec. Attenzione: Massimiliano + 1% TMC può causare corrosione cutanea, lesioni oculari gravi e tossicità d'organo specifica ed è un liquido e vapori infiammabili. Indossare occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio e lavorare in una cappa aspirante.</li>
	<li>Incubare il campione in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione mantenuto a 37 ° C per 30 min con 1.000 giri/min agitazione.</li>
	<li>Capovolgere il flaconcino una volta per mescolare i campioni con gocce di condensate sulla superficie del tappo.</li>
	<li>Selezione del campione verso il basso per 5 min a 2.000 x g, RT</li>
	<li>Trasferire la soluzione ha reagita in fiale appropriati per l'analisi GC-MS.</li>
</ol>4. proteine digestione (tempi d ~ 1)
<ol><li>Centrifugare il campione a 15.000 x g per 5 min, RT, a pellet eventuali detriti.</li>
	<li>Eseguire filtro-Aided--preparazione del campione (FASP) la digestione utilizzando FASP Kit (Vedi Tabella materiali) seguente modifica istruzioni31,32 del produttore:<ol>
<li>Aggiungere 400 μL di buffer urea 8 M in una colonna FASP (500 μL 30K MWCO filtro spin).</li>
		<li>Una volta che il campione ha finito di centrifugazione, pipettare il sovranatante (scartare il pellet) e aggiungere fino a 50 μL del campione a 400 μL di 8m urea nella colonna. Nota: Aggiungere solo fino a 50 μL di campione per ogni colonna. Se non c'è più di 50 μL di campione, utilizzare più colonne e combinare i peptidi dopo la digestione. È meglio lasciare questo volume più basso possibile (30 µ l è ideale) al fine di garantire la FASP colonna rimuoverà tutti della SDS che può interferire notevolmente con analisi massa spec.</li>
		<li>Sistemare la colonna nel tubo incluso 1,5 mL e centrifugare il campione a 14.000 x g per 30 min, RT</li>
		<li>Rimuovere il flusso continuo in rifiuti e aggiungere 400 μL di 8m urea alla colonna e centrifugare nuovamente.</li>
		<li>Ripetere il passaggio precedente ancora una volta per un totale di 3 urea risciacqui. Nota: Assicurarsi che il campione va vicino secchezza sulla colonna, se c'è qualche più di ~ 30 µ l restante del filtro dopo ogni giro, continuare la centrifugazione.</li>
		<li>Aggiungere 400 μL di 50mm NH4HCO3 e centrifugare a 14.000 x g per 20 min, eliminare i rifiuti e ripetere una volta.</li>
		<li>Trasferire le colonne in una provetta da centrifuga pulito 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 75 μL di tampone di digestione della tripsina alle colonne e incubare a 37 ° C per 3 h in un'incubatrice con un coperchio di prevenzione di condensazione a 750 giri/min.</li>
		<li>Aggiungere 40 µ l di 50mm NH4HCO3 alle colonne.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 14.000 x g per 15 min raccogliere i peptidi nel tubo, mantenendo i contaminanti di alto peso molecolare in cima alla colonna.</li>
		<li>Aggiungere 40 μL di 50mm NH4HCO3 per la colonna e centrifugare di nuovo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scartare la colonna, a secco giù i peptidi nel tubo una Vac velocità di ~ 30 µ l e l'analisi BCA (kit di dosaggio di proteina acida bicinconinico; Vedi Tabella materiali) i peptidi.</li>
	<li>Facoltativamente, eseguire un passaggio di pulizia se sospetta contaminazione SDS (visibili bolle)33. Un'estrazione in fase solida deve essere fatto in seguito se si sceglie questa opzione. Informazioni dettagliate su questo metodo di pulizia sono disponibile nei Metodi supplementari.</li>
	<li>Diluire il campione per analisi MS o facoltativamente procedere al frazionamento di HPLC (due passaggi successivi).
</li>
	<li>Per frazionare, diluire i campioni ad un volume di 400 µ l con tampone di 10 mM ammonio formiato (pH 10.0).</li>
	<li>Risolvere su una colonna C18 (Vedi Tabella materiali) separando a 0,5 mL/min utilizzando un sistema HPLC con formiato di ammonio di fasi mobili (A) 10 mM, pH 10.0 e (B) formiato di ammonio 10 mM, pH 10.0/acetonitrile (10:90).<ol>
<li>Regolare il gradiente alla 100% al 95% A oltre il primo min 10, 95% A 65% A oltre min 10 a 70, A 65% a 30% A oltre 70 a 85, mantenere alla 30% A oltre min 85 a 95 min.</li>
		<li>Riequilibrare con 100% A oltre min 95 a 105 e tenere al 100% A fino a 120 min.</li>
		<li>Raccogliere le frazioni ogni 1,25 min (96 frazioni sopra l'intera sfumatura) e infine combinare ogni riga per un totale di 12 campioni o alterni per 24 campioni (ciascuno con n = 8 o n = 4 frazioni in pool).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asciugare tutte le frazioni sotto vuoto e aggiungere 15 µ l di acqua ultrapura a ciascuno per la conservazione a-20 ° C fino all'analisi LC-MS/MS.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hultman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+of+permafrost,+active+layer+and+thermokarst+bog+soil+microbiomes.">Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes.</a> Nature. 521, 208-212 (2015).</li><li>White, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moleculo+long-read+sequencing+facilitates+assembly+and+genomic+binning+from+complex+soil+metagenomes.">Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes.</a> mSystems. 1, (2016).</li><li>White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototrophic+biofilm+assembly+in+microbial-mat-derived+unicyanobacterial+consortia:+Model+systems+for+the+study+of+autotroph-heterotroph+interactions.">Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions.</a> Front Microbiol. 5, (2014).</li><li>Isaacson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+extraction+techniques+for+enhanced+proteomic+analysis+of+plant+tissues.">Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues.</a> Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

È importante notare che non tutti i laboratori avranno la stessa attrezzatura disponibile così determinati metodi, ad esempio il passaggio di Lisi, possono essere adattati. Qui usiamo nel vortex e sonicating, tuttavia l'uso di un battitore di perlina grande 50 mL avrebbe funzionato. Se non sono disponibile un liofilizzatori con una temperatura del collettore in grado di-105 ° C, i campioni possono essere essiccati sotto un flusso di azoto. Anche i tipi di suolo variano notevolmente e possono includere sabbia, limo, argilla, torba e terriccio (ecc.), e possono anche variare basato sul pH, salinità e ricchezza di materia organica. Ciascuno di questi varianze possa avere un impatto sul protocollo, quindi è importante essere flessibili e apportare modifiche quando necessario. È fondamentale, tuttavia, che i rapporti e le percentuali rimangono gli stessi.
Il protocollo MPLEx Mostra la grande promessa per applicazione in numerosi sistemi biologici e ambientali e la possibilità di attivare multi-omic analisi della comunità microbica del suolo. Comparazioni precedente di MPLEx ad altri protocolli di estrazione per diversi sistemi illustrato un alto grado di peptide sovrapposizione10. Tuttavia, uno ha osservato limitazione era che MPLEx non era applicabile alle proteine del plasma sanguigno che hanno bisogno di essere impoverito. In questi casi, le proteine precipitate non erano ben riconosciute dagli anticorpi nelle colonne immunodepletion necessari per un'ampia copertura del proteoma del plasma. Di conseguenza, gli approcci più standard di estrazione devono essere utilizzati in queste circostanze. Una limitazione ulteriore notata per l'approccio di estrazione MPLex è che esso non discernere tra proteine intracellulari ed extracellulari, tuttavia questo è vero per tutti gli altri del suolo proteina estrazione protocolli pure.
In questo manoscritto, MPLEx fornito risultati per 3376 peptidi, 105 lipidi e 102 metaboliti polari nel suolo nativo prairie Kansas utilizzando i metodi di estrazione e analisi dettagliati nella sezione protocollo. Migliore sovrapposizione è stata osservata fra i peptidi estratti nel controllo e nella MPLEx approcci dei singoli sistemi rispetto alla comunità microbica del suolo (Figura 2). Non si tratta di una limitazione, ma una conseguenza di lavorare con le comunità microbica del suolo estremamente complicato. Questi risultati sono ulteriormente notati come le tecniche di estrazione di terreno ben noto di SDS e MoBio non si sovrapponevano bene sia a causa della grande diversità e difficoltà di estrazione del suolo proteine ugualmente. È interessante notare che, il protocollo MPLEx ha permesso l'identificazione di peptidi più totale rispetto a SDS o MoBio e rilevato anche componenti aggiuntivi non visti in analisi.
Queste osservazioni fanno MPLEx una tecnica molto promettente per lavorare con i formati piccoli campioni, riducendo la variabilità sperimentale globale multi-omic e riducendo i tempi di preparazione del campione. I vantaggi possibili con MPLEx guardare per abilitare la funzionalità di multi-omic e analisi richieste per gli studi su larga scala comunità microbica.

Valutazione comunità microbica del suolo ha importanti implicazioni per la comprensione di carbonio in bicicletta e il cambiamento climatico. Recenti studi hanno tuttavia evidenziato difficoltà, come la mancanza di genomi sequenziati per microbiota in vari tipi di suolo e la funzione sconosciuta di molte delle proteine rilevate. Questi risultato di sfide a causa del terreno essendo più complessa comunità microbica conosciuti alla data di1,2,3. Analisi multi-omic, che combinano risultati da metagenomica, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomica e studi lipidomica, recentemente sono stati implementati in numerosi studi di terreno per ottenere una maggiore comprensione i microbi presenti, mentre ottenere informazioni complete circa i cambiamenti molecolari che avvengono a causa di perturbazioni ambientali1,4,5. Una sfida con multi-omic studi è che la spettrometria di massa (MS)-base metaproteomic, metabolomica e lipidomica misurazioni in genere richiedono un processo di estrazione specifica per ogni omic MS compatibile6,7 , 8 , 9. queste precise procedure subordina l'applicazione estremamente difficili o impossibili quando solo una limitata quantità di campione è disponibile. Queste sfide ci hanno spinti a studiare una simultanea metabolita, della proteina e del lipido (MPLEx) metodo di estrazione capace di usando più piccoli volumi di campione o masse, migliorando la precisione e fornendo più veloce preparazione del campione per tutte le tre analisi 10. ad oggi, esistono procedure estrazione alternativi del suolo che possono raggiungere tutti questi obiettivi.
Per attivare globale multi-omic analisi di un campione di terreno unico, un protocollo di estrazione con solvente organico basato su cloroformio, metanolo e acqua separazioni era utilizzato10. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per lipido totale estrazioni9,11 e più recentemente è stato modificato per l'estrazione simultanea di metaboliti, proteine e lipidi da un singolo campione12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, consentendo la meno quantità di campione e variabilità sperimentale10. Nel protocollo MPLEx, cloroformio non è miscibile con acqua, che costituisce la base per la separazione chimica trifasica dei costituenti del campione in frazioni distinte. Di conseguenza, la fase acquosa superiore contiene i metaboliti idrofili, seguiti da un disco di proteine e poi uno strato di lipidi nella fase di cloroformio di fondo (Figura 1). Quando MPLEx viene applicato alla maggior parte dei suoli, residui di particolato si accumulano nella parte inferiore dei tubi di campionamento e possono essere eliminato dopo aver raccolgono tutti i livelli. Ogni tipo di suolo può essere differente, tuttavia e in terreno altamente organico quali torba, i detriti del terreno rimane nello strato intermedio e non cadono sul fondo del tubo di campionamento. MPLEx offre diversi vantaggi quando isolare la molecola più tipi dallo stesso campione come 1) piccole quantità di campione può essere utilizzato per le analisi multi-omic, 2) multi-omic estrazioni dalla stessa diminuzione di campione variabilità nel complesso sperimentale, e 3) una maggiore quantità di campioni può essere preparato molto più veloce per maggiore velocità effettiva studi10. Insieme, questi vantaggi sono vitali per fornire la migliore capacità di misurazione per la valutazione di campioni di terreno e loro comunità microbiche complesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650498</td>
			<td>Stored at -20&#176;C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Stored at -20&#176;C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified water from Millipore</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Water purification system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td>!Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil protein extraction kit</td>
			<td>MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen</td>
			<td>30000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Trizma HCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td>!Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>Stored at -20&#176;C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208884</td>
			<td>!Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V528A</td>
			<td>20&#181;g vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>!Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>!Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>226904</td>
			<td>!Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270970</td>
			<td>!Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69478</td>
			<td>!Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water purification system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>model MPGP04001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td></td>
			<td>model FB505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>model 5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tube swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL fixed angle rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-6-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td></td>
			<td>model V22PWE150IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette controller</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>12-654-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL, 25mL glass serological pipettes</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-27F, 13-678-36D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer with Thermotop</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015, 5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 &#8211; 2.0 mm blend stainless steel beads</td>
			<td>NextAdvance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.15 mm garnet beads</td>
			<td>MoBio</td>
			<td>13122-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>11-100-16SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>14512130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper strips, pH range 0&#8211;14</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>M95903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-103 21-108</td>
			<td>chloroform compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL vortex attachment</td>
			<td>MoBio</td>
			<td>13000-V1-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>02-591-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27.25x70mm glass vials</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>03-339-22K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe Easier plate membranes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>BERM-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BPWP-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater shaker incubator</td>
			<td>Benchmark, Incu-Shaker Mini</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog rotisserie tube rotator</td>
			<td>SoCal BioMed, LLC</td>
			<td>82422001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-Aided-Sample-Prep kit</td>
			<td>FASP; Expedeon</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek, EPOCH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 Degree Celsius Freezer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13986149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 Degree Celsius Freezer</td>
			<td>Stirling Ultracold</td>
			<td>SU78OUE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap Velo</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters NanoEquityTM UPLC system</td>
			<td>Millford, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL media bottle</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>1395-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters vial</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass MS sample vial and inserts</td>
			<td>MicroSolv</td>
			<td>9502S-WCV, 9502S-02ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass HPLC vial and snap caps</td>
			<td>MicroSolv</td>
			<td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC 96-well plate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large glass vial 27.25x70mm</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>03-339-22K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7934021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polished stainless steel flat head spatula</td>
			<td>Spoonula; FisherBrand</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 &#956;M with 4.6x20 mm guard column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003117, 186003064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 series HPLC system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G1380-90000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL centrifuge tube</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>11700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50&#181;L and 250&#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81517, 80975, 81175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette Bulbs</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z111597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Branson 1800 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Centrifuge</td>
			<td colspan="2">Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSpin Columns, C18 Silica</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SEM SS18V</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mplex protocol for multi-omic analyses of soil samples

Spettrometria di massa (MS)-base metaproteomic integrato, metabolomica e studi lipidomica (multi-omic) stanno trasformando la nostra capacità di comprendere e caratterizzare le comunità microbiche in sistemi ambientali e biologici. Queste misurazioni sono anche attivazione avanzate analisi delle comunità microbiche complesse del suolo, che sono i più complessi sistemi microbici noti fino ad oggi. Analisi multi-omic, tuttavia, sono sfide di preparazione del campione, poiché estrazioni separate sono in genere necessari per ciascuno studio di omic, amplificando così notevolmente il tempo di preparazione e la quantità di campione richiesto. Per risolvere questa limitazione, è stato creato un metodo 3-in-1 per l'estrazione simultanea di metaboliti, proteine e lipidi (MPLEx) dallo stesso campione di suolo adattando un approccio a base di solvente. Questo protocollo MPLEx ha dimostrato di essere sia semplice e robusto per molti tipi di campioni, anche quando utilizzati per quantità limitate di campioni di terreno complesso. Il metodo MPLEx abilitato anche notevolmente le misurazioni di rapida multi-omic necessari per acquisire una migliore comprensione dei membri di ogni comunità microbica, mentre la valutazione dei cambiamenti in atto su perturbazioni biologiche ed ambientali.

Quando il protocollo MPLEx è stato utilizzato per estrarre le molecole da Kansas prairie nativo suolo (un Mollisol), l'analisi triplice copia fornito risultati per 3376 peptidi, 105 lipidi e 102 metaboliti polari (tutte le identificazioni uniche). Mentre il protocollo MPLEx è stato ben stabilito per estrazione generali di lipidi e metaboliti12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, suo confronto ai comuni metodi di estrazione di proteine di terreno per analisi microbiche, quali kit di estrazione della proteina del suolo (Vedi tabella di Materiali) e SDS (sodio dodecil solfato) estrazioni35, viene ulteriormente valutata qui. Per valutare queste tecniche, Kansas prairie nativo suolo proteine erano estratti ogni approccio e analizzati direttamente con controfase LC-MS/MS utilizzando un sistema UPLC accoppiato con uno spettrometro di massa quadrupole/Orbitrap ibrido. Informazioni dettagliate sui parametri del metodo sono disponibili nei Metodi supplementari. Il peptide sperimentale risultante spettri MS/MS da ogni approccio di estrazione sono stati confrontati con il peptide previsto sequenze da rappresentante del Kansas prairie nativo metagenoma2 utilizzando una MS rigorose-GF + probabilità spettrale cut-off di 1 x 10 -10 36 , 37 e un taglio di massa errore di meno di 5 ppm. Si deve osservare che gli analiti estratti dal terreno mediante il protocollo MPLEx sono adatti per studi basati su MS e altre tecniche analitiche. Quando inizialmente confrontando tre replica dei metodi conosciuti di MoBio e SDS, solo il 12% dei peptidi sovrapposti tra le due tecniche mostrando la complessità della comunità microbica ed effetti di diversa estrazione (Figura 2). Sul confronto di MPLEx con estratti MoBio e SDS, ~ 38% dei peptidi osservati utilizzando il metodo MPLEx inoltre sono stati rilevati quando si utilizzano le estrazioni di SDS e/o MoBio (Figura 2). Considerando il numero di specie nel Kansas del suolo comunità batterica e suo metagenoma2, la sovrapposizione di identificazioni del peptide è ragionevole e a causa della sua complessità, la combinazione degli approcci Estratti altri peptidi che ciascuno da solo 35. Inoltre, poiché questi campioni sono stati sono stati usati insieme e analizzati da solo 1-dimensionale LC-MS/MS, la complessità di campionamento estremamente elevate era possibilmente causando alcuni pregiudizi nella rilevazione a causa di concentrazioni di diversi peptidi estratte da ciascun approccio. Il protocollo MPLEx è stato applicato anche ad altri tipi di terreno come permafrost e zone umide, e in tutti i casi i risultati preliminari di proteomica sono di qualità simile a quella dei Kansas prairie nativo suolo dati qui presentati.
L'ampia applicabilità dell'approccio MPLEx, è stata precedentemente valutata utilizzando un insieme diversificato di campioni, tra cui il archaeon Sulfolobus Sulfolobus, un unicyanobacterial consorzio38, tessuto di corteccia cerebrale del mouse, urina umana, e foglie da thaliana di Arabidopsis (Figura 2)10. Per tutti i campioni tranne A.thaliana, estrazioni di urea sono il modo più comune per estrarre le proteine, quindi sono stati usati come l'approccio di controllo per la valutazione. I risultati di a. thaliana MPLEx sono stati confrontati a un'estrazione eseguita con acido tricloroacetico (TCA) perché pianta le foglie sono ricche di composti fenolici che devono essere rimossi prima del MS analisi39. In tutti i casi, il numero delle proteine osservato dal metodo MPLEx era simile a quella per i controlli10, che indica la sua utilità per molti tipi di campioni diversi. Inoltre, c'erano tendenze associate alle classi di specifiche proteine estratte in tutti i tipi di campione (compreso il terreno). Pertanto, l'ampia applicabilità di MPLEx a numerosi sistemi biologici e ambientali rende un approccio promettente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57343/57343fig1.jpg"> Figura 1. Uno schema che mostra il processo di MPLEx, nei quali metaboliti, proteine e lipidi contemporaneamente vengono estratti dallo stesso campione di suolo per le analisi di MS. <a href="/files/ftp_upload/57343/57343fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57343/57343fig2.jpg"> Figura 2. Diagrammi di Venn, che illustrano la sovrapposizione di peptide per un insieme diversificato di campioni estratti utilizzando MPLEx e un metodo di estrazione di proteine a base di urea standard normalmente eseguita. Dati da MPLEx estrazione del archaeon S.acidocaldarius, Consorzio unicyanobacterial, urina umana, corteccia del cervello del mouse e A.thaliana pianta lascia adattati da Nakayasu, E. S. et al 201610. <a href="/files/ftp_upload/57343/57343fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Un protocollo è presentato per estrazione di metaboliti, proteine e lipidi da un campione di terreno singolo simultaneamente, permettendo tempi di preparazione del campione ridotto e abilitazione multi-omic analisi di spettrometria di massa di campioni con quantità limitate.

Il protocollo MPLEx Multi-omic nell'analisi di campioni di terreno

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.8K Views.  Pacific Northwest National Laboratory. Un protocollo è presentato per estrazione di metaboliti, proteine e lipidi da un campione di terreno singolo simultaneamente, permettendo tempi di preparazione del campione ridotto e abilitazione multi-omic analisi di spettrometria di massa di campioni con quantità limitate.

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Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Ricerca

Chimica

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, electronics and biomedical applications. Due to their accelerating production and use, CNTs constitute a potential environmental risk if they are released to soil and groundwater systems. It is therefore essential to improve the current understanding of environmental fate and transport of CNTs. The transport and retention of CNTs in both natural and artificial media have been reported in literature, but the findings widely vary and are thus not conclusive. There are a number of physical and chemical parameters responsible for variation in retention and transport. In this study, a complete procedure of selected multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) is presented starting from their surface modification to a complete set of laboratory column experiments at critical physical and chemical scenarios. Results indicate that the stability of the commercially available MWCNTs are critical with their attached surface functional group which can also influence the transport and retention of MWCNT through the surrounding medium.

Surface properties of a nanoparticle are important for their interaction with the surrounding medium. Therefore the surface modification of carbon nanotubes can be critical for their transport and retention through porous media. Here, lab scale column experiments are used to understand the possible transport and retention of these nanoparticles.

Trasporto di nanotubi di carbonio modificati superficie attraverso una colonna di terreno

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

A Direct, Early Stage Guanidinylation Protocol for the Synthesis of Complex Aminoguanidine-containing Natural Products

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important structural element found in many complex natural products and pharmaceuticals. Owing to the continual discovery of new guanidine-containing natural products and designed small molecules, rapid and efficient guanidinylation methods are of keen interest to synthetic and medicinal organic chemists. Because the nucleophilicity and basicity of guanidines can affect subsequent chemical transformations, traditional, indirect guanidinylation is typically pursued. Indirect methods commonly employ multiple protection steps involving a latent amine precursor, such as an azide, phthalimide, or carbamate. By circumventing these circuitous methods and employing a direct guanidinylation reaction early in the synthetic sequence, it was possible to forge the linear terminal guanidine containing backbone of clavatadine A to realize a short and streamlined synthesis of this potent factor XIa inhibitor. In practice, guanidine hydrochloride is elaborated with a carefully constructed protecting array that is optimized to survive the synthetic steps to come. In the preparation of clavatadine A, direct guanidinylation of a commercially available diamine eliminated two unnecessary steps from its synthesis. Coupled with the wide variety of known guanidine protecting groups, direct guanidinylation evinces a succinct and efficient practicality inherent to methods that find a home in a synthetic chemist&#39;s toolbox.

Here, we present a protocol for direct, early stage guanidinylation that enables rapid total synthesis of aminoguanidine-containing small organic molecules. An advanced synthetic intermediate used in the synthesis of a blood coagulation factor XIa inhibitor was prepared using this protocol.

Un diretto, Early Stage Guanidinylation protocollo per la sintesi di complessi Aminoguanidine contenenti prodotti naturali

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

Protocollo per la sintesi di<em&gt; Ortho</em&gt; Derivati ​​all&#39;anilina -trifluoromethoxylated

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

A Protocol for the Production of Gliadin-cyanoacrylate Nanoparticles for Hydrophilic Coating

This article presents a protocol for the production of protein-based nanoparticles that changes the hydrophobic surface to hydrophilic by a simple spray coating. These nanoparticles are produced by the polymerization reaction of alkyl cyanoacrylate on the surface of cereal protein (gliadin) molecules. Alkyl cyanoacrylate is a monomer that instantly polymerizes at RT when it is applied to the surface of materials. Its polymerization reaction is initiated by the trace amounts of weakly basic or nucleophilic species on the surface, including moisture. Once polymerized, the polymerized alkyl cyanoacrylates show a strong affinity with the object materials because nitrile groups are in the backbone of poly (alkyl cyanoacrylate). Proteins also work as initiator for this polymerization because they contain amine groups that can initiate the polymerization of cyanoacrylate. If aggregated protein is used as an initiator, protein aggregate is surrounded by the hydrophobic poly(alkyl cyanoacrylate) chains after the polymerization reaction of alkyl cyanoacrylate. By controlling the experimental condition, particles in the nanometer range are produced. The produced nanoparticles readily adsorb to the surface of most materials including glass, metals, plastics, wood, leather, and fabrics. When the surface of a material is sprayed with the produced nanoparticle suspension and rinsed with water, the micellar structure of nanoparticle changes its conformation, and the hydrophilic proteins are exposed to the air. As a result, the nanoparticle-coated surface changes to hydrophilic.

This article presents a protocol for the production of protein-based nanoparticles that changes the hydrophobic surface to hydrophilic. The produced nanoparticle is an assembly of gliadin-cyanoacrylate diblock copolymers. Spray coating with the produced nanoparticle changes the surface of target material to a hydrophilic surface.

Un protocollo per la produzione di nanoparticelle gliadina-cianoacrilato per rivestimento idrofilo

This article presents a protocol for the production of protein-based nanoparticles that changes the hydrophobic surface to hydrophilic by a simple spray ...

A Simple and Efficient Protocol for the Catalytic Insertion Polymerization of Functional Norbornenes

Norbornene can be polymerized by a variety of mechanisms, including insertion polymerization whereby the double bond is polymerized and the bicyclic nature of the monomer is conserved. The resulting polymer, polynorbornene, has a very high glass transition temperature, Tg, and interesting optical and electrical properties. However, the polymerization of functional norbornenes by this mechanism is complicated by the fact that the endo substituted norbornene monomer has, in general, a very low reactivity. Furthermore, the separation of the endo substituted monomer from the exo monomer is a tedious task. Here, we present a simple protocol for the polymerization of substituted norbornenes (endo:exo ca. 80:20) bearing either a carboxylic acid or a pendant double bond. The process does not require that both isomers be separated, and proceeds with low catalyst loadings (0.01 to 0.02 mol%). The polymer bearing pendant double bonds can be further transformed in high yield, to afford a polymer bearing pendant epoxy groups. These simple procedures can be applied to prepare polynorbornenes with a variety of functional groups, such as esters, alcohols, imides, double bonds, carboxylic acids, bromo-alkyls, aldehydes and anhydrides.

We describe the catalytic insertion polymerization of 5-norbornene-2-carboxylic acid and 5-vinyl-2-norbornene to form functional polymers with a very high glass transition temperature.

Un protocollo semplice ed efficiente per l&#39;inserimento catalitica polimerizzazione di norborneni funzionali

Norbornene can be polymerized by a variety of mechanisms, including insertion polymerization whereby the double bond is polymerized and the bicyclic ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

Un protocollo per reazioni sicuro litiazione Utilizzando organolitio Reagenti

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Un protocollo ottimizzato per la radiomarcatura efficiente di oro nanoparticelle utilizzando un<sup&gt; 125</sup&gt; Azide gruppo I-etichettati protesico

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl Modifica e caratterizzazione attraverso il Dicroroo circolare

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). Traditional PAs possess charged amino acids as solubilizing groups (lysine, arginine), which are directly connected to a lipid segment or can contain a linker region made of neutral amino acids. Tuning the peptide sequence of PAs can yield diverse morphologies. Similarly, PPAs possess a hydrophobic segment and neutral amino acids, but also contain polyamine molecules as water solubilizing (hydrophilic) groups. As is the case with PAs, PPAs can also self-assemble into diverse morphologies, including small rods, twisted nano-ribbons, and fused nano-sheets, when dissolved in water. However, the presence of both primary and secondary amines on a single polyamine molecule poses a significant challenge when synthesizing PPAs. In this paper, we show a simple protocol, based on literature precedents, to achieve a facile synthesis of PPAs using solid phase peptide synthesis (SPPS). This protocol can be extended to the synthesis of PAs and other similar systems. We also illustrate the steps that are needed for cleavage from the resin, identification, and purification.

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles PPAs and Related Biomaterials

The synthesis of polyamine-based peptide amphiphiles (PPAs) is a significant challenge due to the presence of multiple amine nitrogens, which requires judicious use of protecting groups to mask these reactive functionalities. In this paper, we describe a facile method for the preparation of these new class of self-assembling molecules.