Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale svizzero (SNF) progetto grant 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (a JVS) e Leopoldina nell'Unione fraterna LPDS 2011-16 (BS). Questo lavoro ha avvantaggiato da configurazioni ottiche del "Microscopia Imaging Center" (MIC) dell'Università di Berna.

Tutto il lavoro animale è stato approvato dal Comitato cantonale per la sperimentazione animale e condotto secondo le linee guida federali.
1. anestetizzare il Mouse
<ol><li>Indossare indumenti protettivi, camice e guanti.</li>
	<li>Mescolare la ketamina, xilazina e soluzione fisiologica per una lavoro di concentrazione di 20 mg/mL e 1 mg/mL, rispettivamente. Iniettare lo stock di lavoro intraperitonealmente (i.p.) a 8-10 µ l/g del mouse. Posizionare il mouse indietro nella gabbia. Nota: Questo protocollo è stato testato per topi maschi e femmine di 40-week-old 6 con uno sfondo di C57BL/6.</li>
	<li>Preparare la soluzione di acepromazina a 2,5 mg/mL e iniettare 30 µ l i.p., 15 min dopo l'iniezione di ketamina-xilazina (75 µ g/topo).</li>
	<li>Dopo 5-15 minuti, controllare un'adeguata anestesia e analgesia controllando per i riflessi, ad es., riflesso di ritiro della zampa o riflesso corneale.</li>
	<li>Controllo per riflessi circa ogni 30 minuti durante tutta la durata dell'esperimento. Iniettare per via sottocutanea chetamina/xilazina a 1,5 µ l/g di mouse, ogni 60 min o versioni precedenti se i riflessi sono positivi. Nota: Anestesia inalazione come isoflurano non può essere utilizzato con questo protocollo, a causa della fissazione del mouse.</li>
</ol>2. rimuovere il pelo dall'Area di lavoro
<ol><li>Utilizzare un rasoio elettrico per radere una zona che si espande all'incirca da 5 mm caudale della bocca verso le zampe anteriori, che si estende oltre le ganasce verso entrambe le orecchie.</li>
	<li>Applicare crema depilatoria sulla zona rasata con un batuffolo di cotone. Attentamente e accuratamente rimuovere dopo 3 min., per esempio, strofinando con tessuti bagnati.</li>
</ol>3. Fissare il Mouse sul palco
Nota: Questo protocollo utilizza un palco su misura (Figura 1) dotato di due supporti regolabili per vetrini coprioggetto (uno fissato sul palco con una vite, l'altro fissato in modo permanente su di esso); bar regolabile orecchio stereotassica; una stringa che può essere serrata con una vite; un metallo liberamente regolabile riscaldamento anello; e una zona rialzata designato per posizionare il torso del mouse. Questa fase viene modificata da una fase di popliteal di linfonodo, con un titolare di stereotactic aggiunto e un supporto per lo slittamento di copertura inferiore che tiene il SMG esteriorizzato. Piani dettagliati o citazioni dello stage sono disponibili su richiesta.
<ol><li>Preparare la fase rimuovendo i titolari per l'anello di riscaldamento e il titolare di slittamento del coperchio rimovibile. Allentare le viti dei titolari del bar dell'orecchio e del titolare fisso vetrini coprioggetto. Nastro un pezzo di garza al centro dell'area del palco, che serve come lettiera per il mouse.</li>
	<li>Utilizzare colla (Vedi Tabella materiali) per fissare un vetro di copertura del diametro di 20 mm verso l'alto di un supporto metallico cilindrico (questo sarà il vetro di copertura inferiore). Incollare un vetro di copertura di 25 mm sul fondo del piatto di metallo titolare (questo sarà il vetro di copertura superiore). Assicurarsi che i vetri di copertura si sovrappongono circa 2-3 mm con supporti in metallo e che il resto del vetro rimane privo di grasso e colla.</li>
	<li>Posizionare il mouse sulla relativa parte posteriore sulla garza, perpendicolare alla stringa allungata, con la testa centrata tra le barre dell'orecchio.</li>
	<li>Fissare l'estremità superiore del mouse sul palco con nastro chirurgico.</li>
	<li>Successivamente, collegare la stringa in incisivi anteriori e serrare la mascella fino a una posizione orizzontale. Utilizzare un forcipe curvo angolato leggermente tirare fuori la lingua dalla bocca, che facilita la respirazione.</li>
	<li>Strettamente, ma non con forza, tirare la coda e con nastro adesivo sul palco.</li>
	<li>Allineare le barre di orecchio per raggiungere un angolo di circa 30° tra il bar e il bordo del palco. Per garantire questo angolo, utilizzare un righello di triangolo per tracciare un angolo di 30° destra e sinistra su un foglio di carta e posizionare la fase trasparente sulla carta per allineare i possessori di conseguenza.</li>
	<li>Difficoltà la mascella tra le barre di orecchio spostando contemporaneamente la barra destra e sinistra verso l'interno fino a quando la mascella è immotile e serrare le viti. Osservare il movimento del torace prima, durante e dopo la correzione della mascella. Ridotto o assente respirazione indica che le barre siano fissate al collo, non l'osso della mascella; in questo caso, ripetere la procedura di fissaggio immediatamente.</li>
	<li>Fornire il riscaldamento al mouse, ad esempio, inserendo una lampada di riscaldamento nelle vicinanze e/o un rilievo di riscaldamento sotto il palco.</li>
</ol>4. esposizione chirurgica della ghiandola salivaria utilizzando un microscopio stereoscopico
Nota: Le operazioni seguenti richiedono l'uso di un stereomicroscopio, una pinzetta e forbici chirurgiche. Poiché la procedura è terminale, non è necessario mantenere le condizioni di esercizio sterile. Strumenti puliti di etanolo è sufficiente.
<ol><li>Individuare la posizione approssimativa del lobo SMG destra cercando un lieve rigonfiamento della pelle circa 15 mm caudale della bocca e mediale di 5 mm della linea della mascella. Sollevare una piega di pelle piccolo nel centro del rigonfiamento e tagliare per creare e apertura di circa 5 mm di lunghezza.</li>
	<li>Applicare immediatamente un anello 4 mm-alta di grasso per vuoto sulla pelle che circonda il taglio. (Utilizzare una siringa riempita di grasso vuoto con ago ipodermico 25g smussata).</li>
	<li>Riempire l'anello di grasso con soluzione fisiologica per garantire che il tessuto rimane umido durante l'operazione.</li>
	<li>Sotto lo stereomicroscopio, distruggere il tessuto connettivo utilizzando la seguente procedura: utilizzare un forcipe fine per tenere saldamente un pezzo di tessuto connettivo direttamente collegato a SMG e utilizzare una pinza seconda per tirare il tessuto connettivo distale fino a quando non si rompe. Garantire che alcuni tessuto connettivo rimangono collegata con il SMG; Questo è auspicabile poiché permette la gestione. Non toccare la ghiandola stessa con il forcipe, dal momento che questo causerà lo spurgo.</li>
	<li>Ripetere questo movimento di interrompere prima del tessuto connettivo in cima la ghiandola, quindi sul lato mediale (tra il lobo destro e sinistro del SMG). Non separare la sublinguale dalla ghiandola sottomandibolare.</li>
	<li>Continuare a rimuovere il tessuto connettivo laterale in senso antiorario attorno la SMG (mediale alla caudale, a distale, rostrale).</li>
	<li>Assicurare che il rifornimento di sangue, vasi linfatici efferenti e del dotto salivare, che sono tutti situati in un pacco presso il sito cranico della ghiandola, non sono rotti.</li>
	<li>Una volta che il tessuto connettivo laterale è interrotto, è possibile utilizzare pinze per tirare il tessuto connettivo attaccato all'estremità caudale della SMG verso l'alto per sollevare l'estremità caudale del SMG. Distruggere il tessuto connettivo sotto il lobo SMG, a partire dalla caudale e lo spostamento verso la fine rostrale.</li>
	<li>Continuare finché non viene rimosso il tessuto connettivo a tutti i siti di SMG (escluso il sito rostrale con alimentazione/scarico principali vasi sanguigni e il WD).</li>
</ol>5. fissaggio della ghiandola
<ol><li>Confermare che l'anello di grasso che tiene la soluzione salina è di almeno 4 mm in alto e non perdendo (Vedi punto 4.2).</li>
	<li>Installare il coperchio inferiore in vetro (Vedi punto 3.2) collegando la barra di metallo al suo supporto regolabile in altezza. Assicurarsi che il titolare di vetrini coprioggetto è regolato nella posizione massima e non toccare l'anello di grasso quando collegato alla fase. Posizionare il titolare dalla direzione caudale ad un angolo di circa 60° per il mouse, con il vetrino coprioggetto che copre circa due terzi (parti caudale e distale) del lobo esposto. Abbassare il vetro di copertura fino a quando entra in contatto con la ghiandola.</li>
	<li>Completare l'anello di grasso sopra il vetro di copertura per formare un nuovo serbatoio di soluzione fisiologica.</li>
	<li>Estrarre con cautela il lobo SMG in cima il coprioggetto con il forcipe, solo toccando il tessuto connettivo collegato ad esso (l'organo possa essere capovolte con il sito di fondo rivolto verso l'alto).</li>
	<li>Assicurarsi che l'anello di grasso ha un'altezza anche di almeno 4 mm e non ci siano perdite. Se necessario, ricarica il serbatoio salino utilizzando un 30 G siringa riempita con soluzione fisiologica.</li>
	<li>Garantire che il titolare di vetro di copertura per il vetro di copertura superiore è nella sua posizione massima. Utilizzare la vite per fissare il supporto metallico con il vetro di copertura superiore di 25 mm al titolare. Utilizzare le viti regolabili del titolare per posizionare il vetro di copertura, in modo che il SMG è centrato in pieno.</li>
	<li>Utilizzare le viti del supporto regolabile per abbassare il vetro di copertura superiore fino a quando si mette direttamente in contatto il SMG. Osservare la forma e la colorazione della ghiandola durante questo passaggio. Se l'area della superficie della ghiandola appare più grande, o la colorazione cambia (per esempio dal rosa al bianco), immediatamente mettere il vetro di copertura per una posizione più alta per alleviare la pressione sul SMG.</li>
	<li>Controllare il serbatoio soluzione fisiologica per perdite cercando di bolle d'aria e/o gocce di soluzione fisiologica all'esterno del serbatoio. Se viene rilevata una bolla di aria o di perdita, rimuovere vetrini coprioggetto sia tutto grasso e ricominciare dal punto 2.</li>
	<li>Vite chiuse tutte le viti di fissaggio.</li>
</ol>6. Fissare l'anello di riscaldamento e la sonda di temperatura
<ol><li>Inserire una sonda di temperatura nel serbatoio e posizionarlo vicino alla ghiandola, quindi il filo della sonda alla fase del nastro.</li>
	<li>Applicare un anello di grasso per lo slittamento di copertura superiore con la SMG nel centro (il diametro dell'anello grasso deve corrispondere al diametro dell'anello di riscaldamento). Posizionare l'anello di riscaldamento sopra il vetrino coprioggetto e sigillare con del grasso. Il tubo di anello di riscaldamento alla fase del nastro.</li>
</ol>7. imaging
Nota: Utilizziamo un sistema di microscopio a due fotoni verticale dotato di un Laser sintonizzabile in Ti:Sa e un microscopio a fluorescenza con obiettivi di acqua-immersione X 20 o 25 X. Correzione in tempo reale di tessuto deriva durante l'acquisizione può essere implementato utilizzando una fase automatizzata e VivoFollow19. Questo migliora la stabilità dell'acquisizione delle immagini, ma non è obbligatorio.
<ol><li>Accendere il sistema di microscopia in posizione verticale, utilizzando un apposito software fornito dal produttore del microscopio. Sintonizzare il Laser Ti:Sa a una lunghezza d'onda di eccitazione 780-900 nm.</li>
	<li>Collegare il tubo di riscaldamento sul ring di riscaldamento. Una pompa peristaltica acqua circola acqua calda (riscaldata immergendo la parte del tubo in un bagno di acqua di 80° C) attraverso l'anello per scaldare il SMG.</li>
	<li>Collegare la sonda di temperatura ad un termometro digitale. Regolare la velocità della pompa peristaltica, se la temperatura è non tra 35-39 ° C. Più velocemente la pompa funziona, caldo ottiene l'oggetto e viceversa.</li>
	<li>Prima di iniziare l'acquisizione di immagini, eseguire un controllo visivo della velocità di flusso di sangue. Controllare attentamente il passaggio dei leucociti attraverso i capillari sottili o tramite l'iniezione di destrano fluorescente. Nota: Per via endovenosa iniettato destrano fluorescente si riempirà immediatamente fuori l'intero sistema vascolare SMG quando il flusso sanguigno è fisiologico. Questo è praticamente sempre il caso in questa procedura.</li>
	<li>Per seguire le cellule immuni, profondità imaging è in genere tra 20-150 µm sotto la superficie del SMG identificato dal segnale di generazione di armoniche 2nd . Pile di registrare immagini di 150-300 µm di campo con risoluzione pixel di circa 512 x 512 o superiore e z-profondità di 20-60 µm con spaziatura di 2-4 µm tra immagini. Ripetere ogni 20-30 secondi acquisizione dello stack per una durata complessiva di 20-60 min.</li>
	<li>Utilizzare il termometro digitale per controllare i livelli di temperatura minima e massima dopo acquisizione di sequenza di una sola immagine. Scartare la sequenza di immagini, se il valore minimo o massimo non è nella gamma di 37 ± 2 ° C. Riempire l'acqua per immersione dell'obiettivo tra sequenze di immagini.</li>
	<li>Alla fine della sessione di imaging, eutanasia i topi di CO2 asfissia nell'ambito dell'anestesia. Nota: Questo è in accordo con le linee guida federali svizzere della sperimentazione animale; altre linee guida per l'eutanasia potrebbe applicare altrove.</li>
</ol>

<ol>
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Y., Nu&#241;ez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+Sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage.</a> Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).</li><li>McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+causes+of+variation+of+body+temperature+in+mice.">Some causes of variation of body temperature in mice.</a> Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).</li><li>Baumgart, K., Wagner, F., Gr&#246;ger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+metabolic+effects+of+hypothermia+and+inhaled+hydrogen+sulfide+in+anesthetized+and+ventilated+mice.">Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice.</a> Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).</li><li>Crouch, A. 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W., Borst, A., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplitude+modulation+of+femtosecond+laser+pulses+in+the+megahertz+range+for+frequency-multiplexed+two-photon+imaging.">Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging.</a> Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).</li><li>Potma, E. O., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+lipid+bilayers+with+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).</li></ol>

Conflitti di interesse non dichiarati.

Questo protocollo offre un approccio diretto per l'imaging in vivo di murine ghiandole salivarie sottomandibolari e sublinguale usando la microscopia non lineare verticale spesso utilizzata nel campo dell'immunologia. Il metodo può essere adattato per l'imaging di altre ghiandole esocrine della regione del collo e della testa. Per esempio, il nostro laboratorio ha eseguito imaging della ghiandola lacrimale in modo analogo (non mostrato).
Rimuovendo il tessuto connettivo intorno la SMG è la fase più critica del presente protocollo, poiché possono verificarsi danni ai tessuti accidentale. Danni per il rifornimento di sangue principale di SMG richiedono immediata cessazione dell'esperimento, poiché il tessuto SMG diventerà ipossico. Se è danneggiato il tessuto SMG stesso, emorragia in genere si ferma naturalmente di coagulazione. Tuttavia, occorre considerare che il pregiudizio innesca l'infiammazione sterile e30, che potrebbe influenzare la lettura sperimentale di rilascio di citochine proinfiammatorie. Una complicazione più comune, ma meno critica durante la microchirurgia sono perdite nel serbatoio soluzione fisiologica. Per ridurre al minimo il verificarsi di perdite, sempre applicare grasso a pelle asciutta e senza peli. Patching una perdita è solitamente inutile: invece, rimuovere tutto il grasso, pulire la pelle con un batuffolo di cotone asciutto e riapplicare da zero.
Durante la formazione immagine, una temperatura vicina alla temperatura fisiologica del corpo deve essere mantenuta (circa 37 ° C per maschio e femmina C567BL/6 topi31). Poiché sia ipo - e ipertermia alterare sangue flusso32,33, funzione fisiologica di SMG non può presumere in quelle condizioni. Tuttavia, abbiamo non osservato alcuna differenza nel flusso sanguigno o motilità delle cellule T durante piccole (± 2 ° C), transitorio (< 5 min) deviazioni dalla temperatura ottimale.
Ridurre al minimo movimento del tessuto è essenziale per la buona qualità delle immagini. Diversi tipi di movimento del tessuto indesiderati possono verificarsi e hanno cause tipiche che possono subire la risoluzione dei problemi. In primo luogo, continuo xyz-drift è solitamente causato da SMG lentamente alla deriva nella sua posizione originale attraverso tessuto connettivo associato. Questo succede se il vetro di copertura inferiore è stato installato troppo alto, o il tessuto connettivo intorno la SMG non era completamente interrotte. In secondo luogo, lento e continuo z-drift può verificarsi se la temperatura è instabile. In questo caso attentamente regolare il riscaldamento e attendere che la temperatura stabile, a circa 15 min prima di formazione immagine. Infine, palpitazione tessuto moto avviene quando la camera Salina non è sigillata ermeticamente. La pressione si accumula e rilascia in camera salina con ogni ciclo di respirazione. In combinazione con perdite o bolle d'aria, questo porta a palpitazione flussi fluidi, che traducono direttamente al tessuto SMG. In questo caso, rimontaggio del coprioggetto e Camera Salina è la soluzione più affidabile.
La massima profondità di imaging dipende dalla lunghezza d'onda di eccitazione utilizzato e fluorophores impiegato. Come praticamente tutte le impostazioni dell'imaging videomicroscopia, coloranti rosso-spostato o proteine fluorescenti che possono essere eccitate con lunghezze d'onda lunghe (900-1.100 nm) permette per tessuti più profondi di imaging di coloranti verdi ed eccitazione più brevi lunghezze d'onda.
il SMG è stato utilizzato come organo di modello per endo - ed esocitosi e membrana rimodellamento3,27,28, infezione34, autoimmunità11e tumore biologia12. Permette ulteriormente molte forme di manipolazione: coloranti, composti farmacologici e gli anticorpi possono essere consegnati alla ghiandola attraverso il flusso sanguigno. In alternativa, il SMG possono essere mirate direttamente tramite l'inserimento di una canula di WD, che è stato usato per trasportare virus11, destrani3, DNA25, coloranti29o agenti farmacologici3.
Il campo di imaging videomicroscopia continua a trarre profitto da un crescente toolbox di genetica e biochimica fluorescente tecniche di etichettatura. I progressi in ingegneria genetica offrono mouse linee e linee cellulari con sofisticati marcatori fluorescenti. Esempi recenti includono etichettatura dei sottoinsiemi delle cellule specifiche (CD11c+ cellule35) o proteine citoscheletriche dinamici (Lifeact36), fotoconvertibile marcatori per cella di rilevamento 37e reporter in tempo reale del nucleare traslocazione (NFAT38) o segnalazione39calcio. Altre applicazioni possono utilizzare sonde fluorescenti biochimici, che evidenziano specifici compartimenti subcellulari (come il DNA binding 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o membrana lipofilico coloranti). La microscopia NLO moderna offre molte soluzioni possibili per meglio rispondere alle domande sperimentale. Per esempio, multiplex due fotoni imaging è stato sviluppato per aumentare fortemente la velocità di acquisizione massimo40. Altre tecniche offrono privo di etichetta multiphoton imaging, generazione di seconda o terza armonica segnali15, oppure misurando le vibrazioni di risonanza caratteristica di molecole (coerente anti-Stokes Raman scattering)41. Così, quando le procedure praticabile per l'esposizione del tessuto e la stabilizzazione sono disponibili, i limiti del disegno sperimentale per lo più sono impostati per lo sperimentatore risorse e creatività.

Saliva è secreta dalle ghiandole esocrine per lubrificare il cibo, proteggere le superfici mucose del tratto orale e per fornire gli enzimi digestivi, nonché sostanze antimicrobiche1,2. Oltre alle ghiandole salivari minori sparpagliate nel submucosa orale, ci sono tre insiemi bilaterale delle ghiandole importanti identificate come parotidea, sublingual e sottomandibolare, in base alla loro posizione1,2. Cellule epiteliali a forma di piramide, organizzati in boccetta-a forma di sacs (acini) o demilunes che sono circondati dalle cellule myoepithelial e una membrana dello scantinato, secernono i componenti sierose e mucose di saliva1. Il luminal spazio stretto degli scarichi dei acini nei dotti intercalate, che uniscono nei condotti striati, fino a quando finalmente si uniscono in un unico dotto escretore1. Il dotto escretore principale della SMG è chiamato dotto di Wharton (WD) e si apre nella caruncola sublingual3,4. Il vano epiteliale SMG rappresenta pertanto una struttura altamente arborized con collettore terminale endpoint, simile ad un fascio di uva1,5,6. L'interstizio SMG è composto da vasi sanguigni e linfatici, incorporati nel tessuto connettivo7 contenente nervi parasimpatici8 e matrice extracellulare5. Ghiandole salivari normali umani e roditori contengono anche cellule T, macrofagi e cellule dendritiche9, così come le cellule di plasma che secernono immunoglobuline A (IgA) in saliva9,10. Grazie alle sue molteplici funzioni nella salute e nella malattia, il SMG è un argomento di interesse per molti campi della ricerca biologica, tra cui odontoiatria4, immunologia11, oncologia12,8di fisiologia e biologia cellulare 3.
Imaging dei processi cellulari dinamici e interazioni è un potente strumento nella ricerca biologica13,14. Lo sviluppo del tessuto profondo imaging e innovazioni inmicroscopes basato su ottica non lineare (NLO), che si basano su scattering o assorbimento di fotoni più dal campione, ha permesso di esaminare direttamente i processi cellulari in tessuti complessi13 ,15. Assorbimento di fotoni più implica la distribuzione dell'energia di eccitazione totale dai fotoni di bassa energia, quali eccitazione fluoroforo confini per il piano focale e permette così la più profonda penetrazione del tessuto con ridotta photodamage e rumore da fuori fuoco eccitazione13,15. Questo principio è impiegato da microscopia del due-fotone (14) e consente per l'imaging di fluorescenza esemplari nelle profondità di fino a 1 mm15,16. Mentre commercialmente disponibili 14 configurazioni sono diventati facile da usare e affidabile, la grande sfida per l'imaging di videomicroscopia è attentamente esporre e stabilizzare l'organo bersaglio dei topi anestetizzati, soprattutto per l'imaging delle serie di lasso di tempo. Diversi metodi per la correzione digitale deriva dopo acquisizione dati sono stati pubblicati17,18 e recentemente abbiamo sviluppato "VivoFollow", un sistema di correzione automatica, che contrasta il tessuto lento deriva in tempo reale utilizzando un computerizzato fase19. Tuttavia, è ancora fondamentale per alta qualità delle immagini per ridurre al minimo movimento del tessuto, particolarmente veloci movimenti provocati dal respiro o battito cardiaco19. Procedure di preparazione e di stabilizzazione sono state pubblicate per gli organi multipli, compreso il midollo spinale20, fegato21, pelle22, polmone23e linfonodo24. Inoltre, modelli per l'imaging della ghiandola salivaria del ratto sono stati sviluppati3,25 e ulteriormente raffinato per l'imaging videomicroscopia ad alta risoluzione di murino che SMG su misura per un microscopio invertito installazione26, 27 , 28.
Qui, presentiamo un protocollo pratico ed adattabile per videomicroscopia imaging di SMG murino usando la microscopia non lineare verticale, che è comunemente usata per l'imaging intravital nel campo dell'immunologia. A tal fine, abbiamo modificato una fase di immobilizzazione ampiamente autonomo utilizzata per preparazioni popliteal di linfonodo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Narketan 10 %&#160; (Ketamine) 20ml (100 mg/ml)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>3605877535982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>680538150144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline NaCl 0.9%</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3535789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml)</td>
			<td>Fatro</td>
			<td>6805671900029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9818L</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removal cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>4002448090656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>Durapore (3M)</td>
			<td>1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>Durapore (3M)</td>
			<td>1538-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue Ultra gel, instantaneous glue</td>
			<td>Pattex, Henkel</td>
			<td>4015000415040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1343/ 631-1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease for laboratories 60 g glisseal N</td>
			<td>Borer (VWR supplier)</td>
			<td>DECO514215.00-CA15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T )</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T )</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Migros</td>
			<td>617027988254</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Gazin 5 x 5 cm</td>
			<td>Lohmann and Rauscher</td>
			<td>18500</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red dextran 70kDa</td>
			<td>&#160;Molecular Probes</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade Blue dextran 10kDa</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>D1976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon system</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td>TrimScope I and II</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>n/a</td>
			<td>or other water immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>95969077651</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy

Ghiandola salivare sottomandibolare (SMG) è uno dei tre ghiandole salivari maggiori ed è di interesse per molti diversi campi della ricerca biologica, tra cui immunologia, oncologia, odontoiatria e biologia cellulare. La SMG è una ghiandola esocrina composto da cellule epiteliali secretive, miofibroblasti, cellule endoteliali, nervi e matrice extracellulare. Processi dinamici cellulari nel ratto e topo SMG precedentemente sono stato ripreso, principalmente utilizzando invertito sistemi multi-fotone microscopio. Qui, descriviamo un semplice protocollo per la preparazione chirurgica e la stabilizzazione di SMG murino in topi anestetizzati per in vivo imaging con sistemi di microscopio verticale multi-fotone. Presentiamo insiemi di immagine videomicroscopia rappresentativa di endogeno e trasferiti passivamente cellule fluorescenti, tra cui l'etichettatura dei vasi sanguigni o condotti salivari e generazione di seconda armonica di visualizzare collagene fibrillare. In somma, il nostro protocollo consente preparazione chirurgica delle ghiandole salivari del mouse nei sistemi di microscopia in posizione verticale, che sono comunemente usati per l'imaging intravital nel campo dell'immunologia.

Questo protocollo permette la formazione immagine di quasi l'intero lato dorsale o ventrale del SMG. Il campo visivo in genere include anche ghiandola salivaria sublingual, che differisce leggermente da SMG in composizione cellulare4. Entrambe le ghiandole sono incapsulate dal collagene fibrillare e suddiviso in lobi. La maggior parte delle 14 sistemi possono produrre un'immagine privo di etichetta collagene fibrillare misurando il segnale armonico 2nd , ma solitamente molecole fluorescenti sono necessari per la visualizzazione delle strutture cellulare e subcellulare. Ad esempio, espressione ubiquitaria transgenico della proteina fluorescente verde (GFP) in combinazione con il segnale armonico 2nd è sufficiente per identificare i acini, dotti e vasi sanguigni nel SMG per le loro caratteristiche morfologiche. Questa configurazione può essere utilizzata per osservare transgenici marcatori fluorescenti con espressione specifica del tipo di cella per identificare sottogruppi di cella specifica. La figura 2 Mostra una rete ofCOL1A1-GFP reporter-esprimendo fibroblasto-come le cellule del tessuto connettivo. Anche mostrato sono i vasi sanguigni, etichettati da iniezione endovenosa di un colorante fluorescente accoppiato ad alto peso molecolare destrano. Il vano luminal dei condotti può anche essere etichettato (Figura 3) quando il colorante viene iniettato il WD29retrogradually.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57283/57283fig1.jpg"> Figura 1 : Su misura fase. (un e un *) due titolari liberamente regolabili per vetrini coprioggetto; bar regolabile orecchio stereotassica (b e b *); (c) una stringa che può essere serrata con una vite; (d) un metallo liberamente regolabile riscaldamento anello; (e) ha sollevato la zona designata per posizionare il torso del mouse. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57283/57283fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57283/57283fig2.jpg"> Figura 2 : Sistema vascolare indicatore (rosso) e rete di cellule esprimenti COL1A1-GFP (green). Sistema vascolare etichettati per iniezione endovenosa del coniugato Texas Red-destrano (MW 70 kDa). Collagene fibrillare tra due lobi sono visualizzata come il segnale armonico 2nd (blu). Viene mostrato una singola z-proiezione di 15 immagini impilate con 47 µm profondità. Barra della scala = 40 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57283/57283fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57283/57283fig3.jpg"> Figura 3 : Luminal condotto con l'etichetta dopo l'iniezione di WD. Vasi sanguigni etichettati con 70 kDa-MW Texas Red-destrano (rosso), condotto lume etichettati con cascata blu-destrano (bianco; 10 kDa MW) tramite iniezione retrograda attraverso il WD e passivamente trasferiti GFP+ CD8+ T cellule (verde) nel SMG. Mostrato è una singola z-proiezione di 27 immagini impilate con profondità di 50 µm. Barra della scala = 40 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57283/57283fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

Descriviamo un protocollo per esporre chirurgicamente e di stabilizzare la ghiandola salivare sottomandibolare murina per videomicroscopia imaging utilizzando la microscopia intravital in posizione verticale. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre ghiandole esocrine della testa e collo regione dei topi e altri piccoli roditori.

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

preparation-murine-submandibular-salivary-gland-for-upright

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Views.  University of Bern. Descriviamo un protocollo per esporre chirurgicamente e di stabilizzare la ghiandola salivare sottomandibolare murina per videomicroscopia imaging utilizzando la microscopia intravital in posizione verticale. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre ghiandole esocrine della testa e collo regione dei topi e altri piccoli roditori.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Saliva, le ghiandole salivari, e Collection emolinfa dalle zecche Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...