Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di ricerca dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). L. Liu è un destinatario di CIHR New Investigator Award (MSH-95374).

1. Preparazione del chemiotattico in gel <ol><li> Pipettare 10 ml di 2 × PBS in un tubo da 50 ml conica, e scaldare il tubo mettendolo in un bicchiere contenente acqua calda. </li><li> Pipettare 10 ml di acqua distillata e aggiungere 0,4 g di polvere di agarosio in un altro tubo da 50 ml coniche (con il suo tappo leggermente allentato) e scaldare la miscela fino a poco bollente in un forno a microonde (per ~ 1 minuto in un 700-watt forno a microonde) . </li><li> Aggiungere il riscaldato 2 × PBS alla soluzione di agarosio tubo, agitare la soluzione mista e tenerlo caldo nel bicchiere di acqua calda. </li><li> Micropipetta soluzione chemiotattico (ad esempio, 10 ml di 0,5 mg di CXC chemochine MIP-2 o 12 ml di 1 WKYMVm mM) nel coperchio di un 1,5 mL provetta Eppendorf contenente 3 inchiostro microlitri India e mescolare bene per aspirazione mediante una micropipetta (evitare bolle d&#39;aria). </li><li> Tagliare l&#39;estremità di una punta di 200 microlitri punta della pipetta e micropipetta 110 ml di soluzione di agarosio (42 ° C) nel coperchio e subito mescolare bene con un altro puntale (evitare bolle d&#39;aria). </li><li> Conservare il chemiotattico contenenti gel a +4 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di Cremaster muscolare per microscopia intravitale (Figura 1) <ol><li> Anestetizzare un topo adulto di sesso maschile con una iniezione ip di una miscela di 10 mg / kg xylazina e 200 mg / kg di ketamina cloridrato. </li><li> Radere l&#39;area più giusta vena giugulare esterna e la faccia anteriore dello scroto con un rasoio elettrico. Dopo l&#39;anestesia, è importante prestare particolare attenzione e cura per il mouse anestetizzato. Una lampada di calore può essere usato per prevenire il mouse da ipotermia. Il mouse deve essere privo di riflesso il dolore. </li><li> Effettuare una incisione orizzontale, trovare e cateterizzare la vena giugulare con un tubo in PE-10 pieno di 100 U / mL soluzione salina eparina. Cateterismo della vena giugulare è necessario per la somministrazione di anestetici e farmaci aggiuntivi se necessario. </li><li> Fissare le gambe posteriori del mouse con il nastro ombelicale con il mouse, sdraiato a faccia in su un fatto in casa a bordo del muscolo cremastere (Figura 1). </li><li> Collegare la scheda ad un circolatore d&#39;acqua a 37 ° C per mantenere il muscolo cremastere e il corpo del mouse caldo. </li></ol> Nota: Tutte le procedure di 2,6-2,14 deve essere effettuata molto delicatamente 5. <ol start="6"><li> Fare un&#39;incisione nella pelle scrotale per esporre il muscolo cremastere sinistra. Con attenzione sezionare il muscolo dalla fascia associati. </li><li> Superfuse il muscolo cremastere con 37 ° C-riscaldato bicarbonato soluzione salina tamponata (131,9 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, in mM, pH 7,4) utilizzando una pompa peristaltica. </li><li> Tie una sutura 4-0 alla fine distale del muscolo cremastere a tenerlo premuto sul piedistallo in vetro trasparente visione della scheda del muscolo cremastere. </li><li> Cauterizzare il muscolo cremastere longitudinalmente. Con sutura 4-0, tenere premuto il piatto muscolare e fissarlo lungo i bordi sul piedistallo. Separare il testicolo e l&#39;epididimo dal muscolo sottostante e spostarli nella cavità addominale. </li><li> Superfuse il muscolo a ~ 0,6 ml / min con il 37 ° C-riscaldata buffer di perfusione e coprire il muscolo esposto con un 22 × 22 millimetri coprioggetto di vetro. </li><li> Posizionare la scheda del muscolo cremastere sul palco microscopio, esamina il muscolo sotto il microscopio, trovare un venule adatto postcapillari (Selezionare il venule che è dritto e ramificato ed ha frequenza normale di taglio e un diametro di 25-40 micron) e regolare la telecamera per consentire l&#39;venule da visualizzare in posizione verticale su entrambi i lati a sinistra oa destra del monitor TV. </li><li> Dopo 30 minuti di equilibrio, registrare le immagini video delle venule selezionati postcapillari per 5 minuti come dati di controllo di base utilizzando un videoregistratore. </li><li> Fermare il superfusione e rimuovere il vetrino sul muscolo. </li><li> Inserire un ~ 1-mm 3 dimensioni chemoattractant contenenti gel sulla superficie del muscolo cremastere in una zona preselezionata da 350 micron e parallelo al venule osservato postcapillari, aggiungere il coprioggetto per tenere il gel a posto e superfuse il tessuto muscolare ad una molto ritmo lento (≤ 10 microlitri / min) per consentire la creazione di un gradiente di chemiotattico che viene rilasciato lentamente e formata dal gel. </li><li> Registrare l&#39;immagine video per 90 minuti dopo l&#39;aggiunta del gel contenente chemoattractant. Durante la registrazione, regolare e mantenere l&#39;attenzione sul microscopio aderenti, strisciando, e trasmigrante chemotaxing leucociti all&#39;interno del venule e nel tessuto muscolare. </li><li> Dopo l&#39;esperimento, importare il file video su un computer per l&#39;analisi. </li></ol> 3. Cellula di rilevamento utilizzando ImageJ <ol><li> Su un computer, estrarre e convertire il video in formato AVI (per esempio, l&#39;uso gratuito bitRipper software per convertire video DVD in un file AVI). </li><li> Utilizzare il software di editing video per generare il tempo trascorso film. Ad esempio, utilizzare Windows Movie Maker per fare un tempo trascorso film (a 1 / 512 o 1 / 1024 time-lapse unoT 30-fps rate) da quella originale, video in tempo reale. Convertire e salvare il tempo trascorso non compresso film formato DV-AVI. </li><li> Registrare le immagini del micrometro calibrazione sotto il microscopio stessa impostazione, importare le immagini al computer, aprire le immagini con ImageJ. In ImageJ, i pixel totali appaiono in alto a sinistra dello schermo (ad esempio, 720 × 480 pixel). Misurare le dimensioni dello schermo, sia gli assi X e Y (ad esempio 200 × 150 micron). Da questo, calcolare il numero di pixel per micron (ad esempio, x = 720/200 = 3,6 pixel / micron, e y = 480/150 = 3,2 pixel / micron). </li><li> Per importare il filmato, aprire ImageJ di nuovo, fare clic su &quot;File-Import-Utilizzo filmati QuickTime Plug-in&quot;, selezionare il film da analizzare e fare clic su &quot;OK&quot; a livello di interfaccia di &quot;Opener filmato QT&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Plugin-Manual monitoraggio&quot; per tenere traccia delle cellule. Compila le informazioni rilevanti nei campi in basso prima di iniziare il monitoraggio. In breve, <ol><li> Intervallo di tempo (in secondi) = fold-time-lapse/30 (Ad esempio, un 1020 × time-lapse sarebbe 1020/30 = 34 sec / frame intervallo). </li><li> x / y = calibrazione della micron / pixel di misura utilizzando la calibrazione dell&#39;immagine del micrometro. </li><li> z calibrazione = 0 (come il muscolo cremastere topo è uno strato estremamente sottile di strisciare tessuti e cellule e le migrazioni sono circa 2D in campo chiaro transilluminazione). </li><li> Cerca formato quadrato per centrare = 1. </li><li> Dot dimensioni / Linea larghezza / Dimensione carattere: possono essere modificate se necessario. </li></ol></li><li> Selezionare un punto stabile e chiaro come punto di riferimento. Questo punto di riferimento può essere un punto chiaro e piccole strutturali che rimane invariato e stabile durante l&#39;intero esperimento. Fare clic su &quot;Add Track&quot; per tenere traccia del punto di riferimento dal primo all&#39;ultimo fotogramma e fare clic su &quot;Track finale&quot;. I dati appaiono sul tavolo i risultati automaticamente. </li><li> Pista strisciando e la migrazione di neutrofili uno per uno: fare clic su &quot;Add Track&quot; per monitorare la cellula dalla sua apparizione nel tessuto alla sua scomparsa in ogni fotogramma e fare clic su &quot;Track Fine&quot; per terminare e salvare i risultati in Microsoft Excel. </li></ol> 4. Analisi dei parametri di reclutamento dei neutrofili <ol><li> Aprire il file dei risultati in Microsoft Excel, e analizzare i dati (prendere i cambiamenti di punto di riferimento in analisi). </li><li> Crawling intraluminali <ol><li> Crawling distanza: la distanza totale della cellula striscia nel lume dal sito iniziale aderente al sito trasmigrazione ottimale (micron). </li><li> Crawling velocità: crawling distanza / tempo (micron / min). </li></ol></li><li> Migrazione transendoteliale <ol><li> Trasmigrazione tempo: dal momento in cui il cellulare inizia a trasmigrare attraverso endotelio al tempo in cui l&#39;intero corpo cellulare si trova appena fuori le venule e nessun corpo cellulare può essere visto nel lume (min o sec). </li><li> Tempo distacco: dal momento in cui il corpo cellulare tutto è appena fuori dal venule (subito dopo la trasmigrazione) al punto di tempo in cui la cellula perde il contatto con le venule (la coda si ritrae) (min o sec). </li></ol></li><li> Chemiotassi nei tessuti <ol><li> Distanza di migrazione: la somma della distanza della cella si sposta dal punto iniziale al punto finale della migrazione nel tessuto (micron). </li><li> Velocità di migrazione: la migrazione nel tessuto distanza / tempo (micron / min). </li><li> Chemiotassi distanza: la somma della distanza della cellula migra in asse x nel tessuto (micron). </li><li> Velocità di chemiotassi: chemiotassi distanza / tempo (micron / min). </li><li> Chemiotassi indice: il rapporto tra dividendo la distanza chemiotassi dalla distanza di migrazione nei tessuti. </li></ol></li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Anche se bightfield microscopia intravitale viene utilizzato per lo studio delle interazioni leucociti-endotelio delle cellule e non possono essere necessariamente per i neutrofili, abbiamo confermato che, dai nostri studi di istologia, oltre il 95% delle cellule reclutate in neutrofili chemoattractant trattati con muscoli cremastere erano davvero neutrofili . In questo rapporto, con neutrofili selettivi chemiotattici, vi presentiamo le procedure di tracking il reclutamento dei neutrofili in vivo. In particolare, si descrive un protocollo di monitoraggio strisciare neutrofili intraluminale, migrazione transendoteliale, chemiotassi e nel tessuto muscolare cremastere in topi anestetizzati utilizzando la microscopia time-lapse intravitale video e ImageJ. Il chemoattractant contenenti gel sul muscolo cremastere rilascia lentamente chemiotattico e permette un gradiente chemiotattico da stabilire in tessuto. Chemiotattico dei neutrofili induce neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali in cremasterico venule postcapillari nei topi. L&#39;intero esperimento viene visualizzato sotto un microscopio a campo chiaro verticale intravitale con immagini video proiettate da una telecamera a colori ad un monitor TV e registrate da un videoregistratore. Abbiamo determinato i neutrofilistrisciare intraluminale, la migrazione e la migrazione transendoteliale e chemiotassi nel tessuto muscolare in risposta a dei neutrofili chemoattractant MIP-2 e WKYMVm preparati in gel (Figura 2). Abbiamo scoperto che MIP-2 (a 0,5 mM) e WKYMVm (a 0,1 mm) ha suscitato neutrofili strisciando intraluminale a velocità simili, la migrazione dei neutrofili transendoteliale e distacco dalle venule per la lunghezza paragonabile di tempo, la migrazione e chemiotassi dei neutrofili nel tessuto muscolare quasi alla stessa velocità e con simili indici chemiotassi dei neutrofili (p&gt; 0.05, test t di Student). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. L&#39;illustrazione schematica di un sistema di microscopio intravitale. Il muscolo cremastere è esteriorizzata del mouse sul piedistallo visione chiara del bordo del muscolo cremastere sul palco microscopio e superfused con 37 ° C-riscaldato bicarbonato-salina tamponata. Il microscopio in posizione verticale è collegata con una videocamera a colori CCD per microscopia campo chiaro intravitale. Un bianco e nero profondo raffreddato CCD fotocamera digitale è anche collegato alla porta microscopio a fluorescenza per microscopia intravitale, le immagini da cui sono direttamente elaborati da un computer. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Parametri di reclutamento dei neutrofili di microscopia brightfield intravitale. Reclutamento dei neutrofili è stata indotta dal rilascio graduale di chemoattractant neutrofili MIP-2 o WKYMVm nella preparazione gel messo 350 micron adiacente alla venule postcapillari. Tempo trascorso dati video sono stati analizzati con ImageJ dopo l&#39;elaborazione del video in tempo reale la registrazione di questo esperimento. Crawling dei neutrofili intraluminale (A), il tempo trasmigrazione e tempo distacco (B), la velocità di migrazione e la velocità chemiotassi nei tessuti (C), e l&#39;indice chemiotassi nel muscolo cremastere (D) sono stati determinati dopo la somministrazione di MIP-2 o WKYMVm gel su muscolo cremastere in topi C57BL / 6 (n = 3, # di cellule tracciati = 22 (in A e B) e 27 (in C e D) rispettivamente per MIP-2, e = 26 (in A e B) e 44 ( in C e D) rispettivamente per WKYMVm).

<ol>
	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Microscopia intravitale è lo strumento essenziale per rivelare i meccanismi cellulari e molecolari del reclutamento dei leucociti durante l&#39;infiammazione. Visualizzazione quantitativa per la determinazione delle interazioni leucociti-endotelio cellula microcircolo dei tessuti traslucida come il muscolo cremastere e mesentere rimane il gold standard per l&#39;applicazione della tecnica di 1,5. La microscopia convenzionale intravitale brightfield ha molte caratteristiche uniche tecniche e dei meccanismi di reclutamento rivelato in questi tessuti sono applicabili alla maggior parte dei tessuti in vivo 1,2,6. Tuttavia, i meccanismi di reclutamento dei leucociti in alcuni altri tessuti come i polmoni, il fegato e il cervello sono stati trovati molto diversa da quelle che si rilevano nel muscolo cremastere e mesentere 1. Inoltre, microscopia a fluorescenza deve essere utilizzato in alcuni tessuti meno trasparente. In confronto con la fluorescenza a base di microscopia che è noto per fotodanneggiamento alle funzioni di cellule vive, brightfield microscopia intravitale è più fisiologico e meno dannosi per le cellule e tessuti (quindi con meno artefatti), quando lungo tempo di imaging per osservare dinamiche dei comportamenti cellulari animali vivi è necessaria 7. E &#39;anche più comodo, meno costoso e senza marcatura fluorescente è necessario. D&#39;altra parte, con immagini transilluminazione in microscopia intravitale, movimento di tracciamento automatico cellulare è impossibile con il software di imaging attualmente disponibili sul mercato commerciale. Tuttavia, è molto facile da configurare una diversa fluorescence intravitale sistema di imaging (ad esempio, proiettando le immagini su un fluorescence telecamera CCD e computer) al microscopio stesso campo chiaro intravitale (Figura 1). Questo offre la comodità di passaggio tra campo chiaro e microscopia imaging di fluorescenza per la preparazione del campione stesso in un singolo esperimento. Questo rende anche possibile seguire automaticamente il movimento delle cellule fluorescente in microscopia a fluorescenza intravitale quando il contrasto tra l&#39;intensità di fluorescenza delle cellule etichettati e lo sfondo è abbastanza grande e adatto software di imaging è installato sul computer. Come illustrato qui nella nostra presentazione, dimostriamo il valore di questo nella tecnica in vivo per l&#39;osservazione diretta di tutto il processo di reclutamento dei neutrofili e per la determinazione delle funzioni delle cellule e molecole in ogni fase di reclutamento. Con chemiotattico contenute in preparazione gel e tiene il tessuto, un gradiente chemiotattico unidirezionale può essere stabilita nel tessuto che induce risposte reclutamento dei leucociti simili a quelle naturali che si verificano durante l&#39;infiammazione locale 8,9. Il movimento direzionale dei leucociti da venule postcapillari verso la sorgente di chemoattractant può essere chiaramente visualizzate al microscopio brightfield intravitale il video e la fotografia. Con time-lapse elaborazione video, il movimento delle cellule possono essere monitorati da ImageJ e una serie di parametri altamente riproducibili può essere misurata. Con specifico topi transgenici, gli inibitori selettivi e fattori chemiotattici, dal sistema di analisi ci aiuta a svelare le funzioni di specifiche proteine ​​nel reclutamento dei leucociti. Per esempio, questa tecnica ci ha aiutato a identificare il ruolo di LSP1 nelle cellule endoteliali come il gatekeeper nella regolazione della migrazione dei neutrofili transendoteliale 10, il ruolo di Mac-1 (αMβ2 integrina) in neutrofili strisciare intraluminale, un passo essenziale per ottimizzare la migrazione transendoteliale 3, e il ruolo di PI3Kγ in chemiotassi dei neutrofili nei tessuti 11.

Tabella: Materiali, reagenti e attrezzature specifiche <table border="1"><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Tubi in polietilene, PE10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0,28 millimetri x 0,61 millimetri OD </td></tr><tr><td> China </td><td> Speedball Art </td><td> Super Black </td><td> Pigmento-no di carbonio nero al 100% coloranti </td></tr><tr><td> Cauterio </td><td> Aaron medici </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc. </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato di ketamina </td><td> Bioniche Animal Health Canada, Inc. </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> Murina ricombinante MIP-2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc. </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapura </td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio in posizione verticale </td><td> Olimpo </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> 3CCD telecamera a colori </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD videoregistratore </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> Monitor TV </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Acqua circolatore </td><td> Thermo Scientific </td><td> HAAKE DC10 </td><td></td></tr><tr><td> Pompa peristaltica </td><td> Gilson; Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster muscolare bordo </td><td> Università di Saskatchewan </td><td></td><td> Fatto in casa </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

Il reclutamento dei leucociti circolanti dal flusso di sangue al tessuto infiammato è un processo cruciale e complesso di 1,2 infiammazione. Nel venule postcapillari di tessuto infiammato, leucociti inizialmente laccio e rotolare sulla superficie luminale di venulare muro. Rotolamento arresto leucociti sull&#39;endotelio e sottoposti ferma adesione in risposta alle chemochine o altri fattori chemiotattici sulla superficie venulare. Molti leucociti aderenti trasferirsi dal sito iniziale di adesione al sito di stravaso giunzionale in endotelio, un processo chiamato intraluminale strisciare 3. A seguito di scansione, leucociti si muovono attraverso endotelio (trasmigrazione) e la migrazione nel tessuto extravascolare verso la sorgente di chemiotattico (chemiotassi) 4. Microscopia intravitale è un potente strumento per la visualizzazione delle interazioni leucociti-endotelio delle cellule in vivo e rivelando i meccanismi cellulari e molecolari del reclutamento dei leucociti 2,5. In questo rapporto, forniamo una descrizione completa della usando la microscopia intravitale brightfield di visualizzare e determinare i processi di reclutamento dei neutrofili dettagliato nel muscolo cremastere topo in risposta al gradiente di un fattore chemiotattico dei neutrofili. Per indurre il reclutamento dei neutrofili, un piccolo pezzo di gel (~ 1-mm 3 dimensioni) contenente chemoattractant neutrofili MIP-2 (CXCL2, una chemochina CXC) o WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un analogo sintetico di peptide batterica) è posizionato sul tessuto muscolare adiacente al venule osservato postcapillari. Con il tempo trascorso fotografia-video e computer software ImageJ, strisciando neutrofili intraluminale sull&#39;endotelio, transendoteliale migrazione dei neutrofili e la migrazione e chemiotassi nei tessuti sono visualizzati e monitorati. Questo protocollo permette un&#39;analisi attendibile e quantitativa di numerosi parametri di reclutamento dei neutrofili, come la velocità strisciare intraluminale, tempo di trasmigrazione, il tempo di distacco, la velocità di migrazione, la velocità e l&#39;indice chemiotassi chemiotassi nei tessuti. Abbiamo dimostrato che l&#39;utilizzo di questo protocollo, questi parametri reclutamento dei neutrofili può essere determinato in modo stabile e la locomozione singola cella comodamente rintracciato in vivo.

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Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.6K Views.  University of Saskatchewan. Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ....

Video: Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

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Immunologia e infezioni

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

La valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili Umana Attraverso una coltivate vescica Epitelio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...