Vorremmo ringraziare Joshua Singer, Jonathan Schenk, come pure gli ospiti premurosi per i commenti sul manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Ben White e Harold Zakon per discussioni sulla tecnica. Jonathan Schenk ha fornito i dati per la Figura 3A. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione Whitehall e un R21 NIH al QG.

1. preparare mosche e identificare GAL4 promotore linee
<ol><li>Selezionare una linea di promotore GAL4 e attraversarlo con mosche che trasportano il transgene UAS-NaChBac sia un transgene optogenetica per l'attivazione. Nota: UAS-CsChrimson11 è selezionata a causa della sua alta conduttanza e la facilità con cui si attiva NaChBac-mediata dei potenziali di azione. UAS-NaChBac sia UAS-CsChrimson sono disponibili dal Repository di scorte di Bloomington.</li>
	<li>Preparare tutto-trans retinico come una soluzione in etanolo (35 mM) e conservare la soluzione in congelatore a-20 ° C.</li>
	<li>µ L di mix 28 di questo stock in circa 5 mL di patata reidratata fiocco cibo e aggiungere questa miscela alla parte superiore di una fiala di convenzionale media della drosofila .</li>
	<li>Sollevare le mosche adulte esprimendo csChrimson sul cibo contenente 0,2 mM all-trans-retinale per 1 – 3 giorni11.</li>
</ol>2. preparare il brodo di TTX
<ol><li>Creare una soluzione di riserva di 1mm TTX in acqua distillata o deionizzata. Conservare questa soluzione in un frigorifero di laboratorio per diversi mesi. Controllare le politiche di istituzioni per quanto riguarda lo stoccaggio di TTX come molte istituzioni classificano TTX come una sostanza pericolosa o controllata.</li>
</ol>3. preparare mosche per elettrofisiologia
<ol><li>Raccogliere 1 – 3 giorni adulto anziano mosche che vengono generati sul cibo con all-trans-retinale. Nota: Consultare Murthy e Turner nel 2013 per una descrizione dettagliata della patch di bloccaggio della drosofila neuroni12,13.</li>
	<li>Mettere le mosche in una fialetta di scintillazione. Posizionare la fiala sul ghiaccio per 1 min immobilizzare le mosche.</li>
	<li>Utilizzare pinze grossolane per inserire una Mosca in una camera di registrazione su misura. La camera è costituito da un 3 ½" cerchio taglio laser da 1/16" acrilico. Taglio un foro ¾" è il centro cui è collegato un foglio personalizzato con epossidica a 2 componenti. La pellicola contiene un triangolare a forma di speranza che viene inserito al volo.</li>
	<li>Applicare cera o resina epossidica curabile UV intorno all'animale di fissare saldamente all'interno della camera di registrazione.</li>
	<li>Illuminare la preparazione con una fibra ottica a collo di cigno per la visualizzazione sotto un microscopio stereoscopico. Impostare le fibre a collo di cigno per illuminazione obliqua regolandoli in modo che essi illuminano al volo direttamente dal lato.</li>
	<li>Regolare il livello di luce al più basso possibile che ancora permette la chiara visualizzazione della Mosca. Questa intensità luminosa varierà da singoli esperimenti. Nota bene: Questo protocollo può essere adattato utilizzando un in situ cervello explant metodo14.</li>
	<li>Recuperare la registrazione esterna salino. La soluzione salina contiene in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (idrossimetil) metil-2-aminoethane-solfonici, 8 trealosio, glucosio 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2e 4 MgCl2 (regolata a mΩ 270 – 275). La soluzione salina viene fatto gorgogliare con 95% O25% CO2 (carbogen) e ha un pH regolato a 7,315.</li>
	<li>Posto 4-6 gocce di soluzione fisiologica registrazione extracellulare sopra la preparazione vola. A questo punto, aumentare il livello di luce al microscopio di dissezione per una migliore visibilità.</li>
	<li>Affilare un filo di tungsteno mediante elettrolisi. Per rendere il filo, preparare una soluzione satura di KNO3 e applicare circa 20 V di AC corrente mentre la punta del filo nella soluzione 20 volte per 100 ms ogni di immersione fino a quando la punta è nitida. Utilizzare il filo di tungsteno affilata per rimuovere la cuticola sulla testa al volo ed esponendo così il cervello.</li>
	<li>Inoltre espone il cervello rimuovendo la trachea e corpi grassi che lo circondano. Se l'accesso ai lobi antennali, utilizzare un filo di tungsteno piegato o un attrezzo simile per infilare delicatamente antenne sotto il foglio di registrazione camera per aumentare la visibilità. Utilizzare pinze taglienti per strappare delicatamente la guaina glial che copre l'area di interesse in cui verranno effettuate registrazioni.</li>
	<li>Trasferire la camera di registrazione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia. Immediatamente inizio perfusione con soluzione fisiologica registrazione esterna gorgogliare con carbogen per preservare il cervello. Il serbatoio di soluzione salina è posizionato sopra il tavolino del microscopio e gravità-è alimentato alla preparazione. Utilizzare una linea del vuoto e un matraccio di Erlenmeyer 2L per raccogliere le saline dei rifiuti.</li>
</ol>4. ottenere cellule intere registrazione
<ol><li>Tirare pipette patch un estrattore commerciale pipetta. Consultare il manuale per le impostazioni ottenere un'appropriato pipetta con una resistenza di punta vicino a 7 mΩ.</li>
	<li>Aggiungere 4 µ l di soluzione di registrazione interna in una pipetta patch. La soluzione salina interna è costituito da 140 potassio aspartato, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA e 1 KCl in mM.</li>
	<li>Impostare il patch clamp amplificatore per registrazione di cellule intere. Zero offset dell'amplificatore e impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova. Qui, viene utilizzato un amplificatore del morsetto di Patch dei sistemi AM 2.400.</li>
	<li>Applicare pressione positiva attraverso la pipetta e avvicinarsi alla cella. Utilizzare un micromanipolatore per indirizzare la pipetta e contattare la cella. Rilascio di pressione positiva. Insieme il potenziale della holding della membrana a -60 mV. La pipetta deve formare un sigillo gigaohm con membrana delle cellule come evidenziato da un sub-picoamp bassa corrente di tenuta. Nota: Se usando GFP guidato delle cellule il targeting, tenta di ridurre al minimo utilizzo della luce epifluorescente per impedire l'attivazione ChR2 e potenziale depressione sinaptica. Attendere alcuni minuti prima di applicare il passaggio 5.</li>
	<li>Impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova da -50 mV a -60 mV. Questa impostazione è standard su amplificatori di patch-clamp. Impulsi di prova rivelerà un grande transitorio capacitivo che rappresenta la corrente necessaria per ricaricare la pipetta di patch. Rimuovere capacitivi transitori regolando le manopole di compensazione di capacità su AM 2400 o simili amplificatore.</li>
	<li>Applicare brevi impulsi di pressione negativa a rottura della membrana cellulare e ottenere la configurazione di cellule intere. Nota: Una configurazione di cellule intere è osservata quando c'è un grande aumento nei transienti capacitivi che mostra la capacità del neurone. Un piccolo aumento della corrente di mantenimento (baseline) sarà probabilmente anche osservato. Impostare l'amplificatore corrente morsetto modalità e regolare il potenziale della cella a -50 a -60 mV.</li>
</ol>5. Verifica della connettività sinaptica
<ol><li>Configurare il sistema di acquisizione dati per attivare un driver LED per generare impulsi di luce. Qui, un sistema DAQ di National Instruments è usato con Matlab per fornire un segnale analogico a un driver LED. L'intensità del LED è regolato tramite il segnale analogico per il driver. Il LED è una lunghezza d'onda di 620-630 nm LED.</li>
	<li>Posizionare il LED rosso ad alta potenza direttamente sotto la preparazione. Regolare l'intensità della luce in modo che 0,238 mW/mm2 raggiunge al volo.</li>
	<li>Attivare i neuroni presinaptici durante la registrazione dalla cellula postsinaptica di interesse. Raggiungere la cella attivazione optogenetically, pharmacogentically, o tramite la stimolazione del nervo. Qui, vengono applicati csChrimson e brevi impulsi di luce rossa. Nota: Connessioni sinaptiche possono essere monitorate sia in tensione oppure morsetto corrente come EPSPs come EPSC. Una connessione sinaptica dovrebbe essere visibile prima di applicare TTX in risposta ad un impulso di luce di 40 ms. Se nessuna connessione è osservata, è improbabile che i neuroni sono sinapticamente connessi sia mono - o polysynaptically. L'azienda potenziale può essere regolata per sottolineare le connessioni eccitatori o inibitori di conseguenza.</li>
	<li>Se una connessione è osservata in salino normale, aggiungere TTX per il sistema di perfusione per ottenere una concentrazione finale di 1 µM. utilizzare una pompa di ricircolo per acquisire e riutilizzare la soluzione fisiologica per conservare TTX. La pompa peristaltica sarà disegnare la soluzione salina dalla vasca e restituirlo al serbatoio salino.</li>
	<li>Regolare la velocità della pompa per fornire un forte vuoto costante che non consente tale livello salino nel bagno a salire e scendere. Nota: L'applicazione di TTX dovrebbe comportare la cessazione di chiodare l'attività nel neurone che viene monitorato in cellule intere. Questo conferma che abbastanza TTX è stato aggiunto per la soluzione fisiologica.</li>
	<li>Applicare di nuovo brevi impulsi di luce rossa (40 ms per ogni impulso). A questo punto, qualsiasi connessione sinaptica che rimane è probabile monosinaptica. Aggiungere farmacologici antagonisti per le saline a ricircolo per testare la natura chimica delle connessioni sinaptiche che rimangono in TTX. Nota: Quando si combinano optogenetica e targeting fluorescente dei neuroni, può essere importante non attivare con insistenza la popolazione presinaptica dei neuroni durante il tentativo di ottenere una registrazione. Questo può portare alla depressione sinaptica e rende difficile vedere le connessioni. Perché csChrimson ha una banda di eccitazione lunga che si estende in linea di massima nella gamma della proteina fluorescente verde, un fluoroforo rosso può essere utilizzato per visualizzare i neuroni e channel2rhodopsin (Ch2R) possono essere usati per eccitare le popolazioni delle cellule. Questa operazione richiede specifica genetica e un cubo di filtro personalizzato. Per generare mosche adatti, è possibile rendere mosche che esprimono il fluoroforo rosso (RFP o mCherry) nell'ambito dei sistemi di espressione binaria sistema LexA o Q. Questi dovranno essere incrociate con le mosche che esprimono un promotore Gal4 e geni effettori UAS-Ch2R e UAS-NaChBac. Il cubo di filtro ottimale per epifluorescenza avrà una gamma stretta di eccitazione per eccitare il fluoroforo rosso, ma non eccitare Ch2R. Inoltre, il set di filtri deve includere un filtro di emissione di passaggio lungo per raccogliere più luce emessa. Abbiamo usato un filtro personalizzato impostato da Chroma che comprendeva parte numeri et580/25 x e t600lpxr (dal set 49306), ma con un filtro di barriera/emissione di et610lp.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Analisi TERPS complimenti attuale tecniche utilizzate per circuito cracking attivando il rilevamento delle sinapsi tra neuroni identificati. In particolare, l'approccio rivela connessioni monosinaptica largamente silenziamento potenziali di azione con TTX durante il ripristino di eccitabilità in una popolazione di seleziona dei neuroni con il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac. Rilascio sinaptico è tratta da stimolo optogenetica mentre eventi postsinaptici sono monitorati con cellule intere registrazioni. TERPS si distingue dagli altri approcci come stretta da essendo sensibile di massa o volume trasmissione ha suscitato alle distanze più lunghe e la capacità di eseguire manipolazioni farmacologiche. La tecnica è relativamente semplice da impiegare e richiede solo una registrazione dell'elettrodo e una fonte di luce per optogenetica stimolazione, che è più fattibile di ottenere duale cellule intere registrazioni su parti pre- e post-sinaptici della sinapsi. Un requisito fondamentale dei TERPS è che i potenziali di azione sono facilmente bloccati da TTX nel sistema in fase di studio. Ma, poiché TTX agisce sui neuroni attraverso una vasta gamma di phyla tassonomica, è probabile che TERPS potrebbe essere applicato in generale per entrambi i sistemi modello dei mammiferi e invertebrati marini.
TERPS può essere facilmente modificata in un certo numero di buone maniere per facilitare sia la stimolazione della popolazione presinaptica putativa o per la registrazione da bersagli postsinaptici. Qui, uno strumento di optogenetica è stato usato per stimolare le popolazioni, anche se l'attivazione di una varietà di meccanismi è possibile. Stimolazione del nervo di assoni sensoriali, ad esempio, è routine negli studi della trasmissione dal nervo antennale in Drosophila16 ed è adatta in altri sistemi sensoriali, tra cui i nervi periferici che contiene neuroni che mechanosensory. Un approccio simile al test connettività funzionale in Drosophila espresso GCaMP indicatori di calcio in una popolazione di neuroni mentre guidano l'attività in un'altra popolazione tramite i recettori ionotropici purinocettori P2X2 e ATP applicazione2. Questo approccio dovrebbe essere compatibile con TERPS semplicemente co-esprimendo il transgene di NaChBac con il ricevitore di P2X2 in un neurone e GCaMP in un'altra popolazione per un metodo privo di patch. Tuttavia, si deve usare cautela con approcci causando depolarizzazioni più lenti, come i recettori progettista muscarinici basati esclusivamente attivati da un designer drug (DREADDs)17,18. Depolarizzazione lenta potrebbe portare all'inattivazione di NaChBac prima della generazione del potenziale d'azione.
Metodi simili a TERPS sono state impiegate nei sistemi mammiferi. Tali tecniche si combinano TTX e channelrhodopsin a tracciare la connettività tra i neuroni. Channelrhodopsin attivazione solo generalmente non depolarizzarsi neuroni sufficientemente, e così il potassio canale blocco 4-AP è essere applicato con TTX per suscitare release19,20,21. Mentre questo funziona in molte sinapsi, potrebbe non funzionare in alcune sinapsi metabotropici se il bersaglio a valle del recettore è un canale del potassio sensibile 4-AP. Per esempio, serotoninergica modulazione della risposta olfattiva in falene si basa direttamente sulla modulazione di tale un 4-AP sensibili K+ corrente (IA)22. Questo approccio, inoltre, non funzionava a CSDn a synapse LN (dati non mostrati). Così, TERPS ha un vantaggio di richiedere meno intervento farmacologico rispetto ad altri metodi comunemente usati e potrebbero funzionare alla gamma più ampia o sinapsi.
Ci sono alcune limitazioni a TERPS che dovrebbero essere considerati. In primo luogo, ci possono essere effetti collaterali da espressione cronica del canale NaChBac durante lo sviluppo. Funzione e circuito corretto assemblaggio può essere confermate confrontando l'attività dei neuroni tra controllo vola manca il costrutto NaChBac e Vola con il costrutto in assenza di TTX. Per evitare tali problemi, espressione del transgene NaChBac potrebbe essere controllato temporaneamente via l'espressione del repressore GAL4 sensibili alla temperatura, GAL8023. Inoltre, se una sinapsi è osservata soltanto in un modo stato-dipendente, è concepibile che sopprimendo l'attività di rete con TTX potrebbe nascondere una tale connessione. È importante sottolineare che un collegamento positivo osservato con TERPS probabile rappresenta una vera connessione mono-sinaptica, mentre un risultato negativo non è prova dell'assenza di una connessione.
Mentre TERPS può rivelare la capacità del trasmettitore rilasciare da un neurone per interessare postsinaptica partner chiaramente, le dinamiche di canale lento di NaChBac e le potenzialità di altopiano associate sua attivazione rendono meno applicabile allo studio dei classici neurotrasmissione. Un approccio per alterare TERPS per più veloce, più naturale rilascio del trasmettitore sarà per esprimere una versione modificata di TTX-insensibile di endogeno della drosofila sodio canale para al contrario di NaChBac. Questa alterazione sarebbe risultato nell'attività naturalistiche chiodando nella cellula presinaptica e consentire un'analisi più convenzionale della trasmissione sinaptica in assenza di attività di rete. Questo avrebbe grandi potenzialità per gli studi delle sinapsi tasso di codifica, alle quali suscitando una vasta gamma di attività presinaptica senza reclutamento polisinaptici reti sarebbe auspicabile.

Degli obiettivi principali delle neuroscienze è quello di mappare le connessioni tra i neuroni a comprendere il fluiscono di informazioni attraverso circuiti. Numerosi approcci e risorse sono diventati disponibili per testare la connettività funzionale tra neuroni in una gamma di sistemi modello1,2. Per generare gli schemi di collegamento più precisi utilizzando elettrofisiologia, è importante risolvere se osservate connessioni tra due cellule sono diretti e monosinaptica versus indiretto e polisinaptici. Un gold standard per fare questa distinzione nei neuroni dei mammiferi è di misurare la latenza tra singolo action potentials nelle cellule presinaptiche e l'insorgenza di correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) nel secondo neurone. Monosinaptica connessioni dovrebbero avere brevi latenze di pochi millisecondi e bassa variabilità3. Questo approccio può essere complicato in neuroni invertebrati poiché sinapsi possono verificarsi nel loro dendriti lontano dal sito di registrazione somatico, causando ritardi nel rilevamento a causa di distanze lungo elettrotoniche tra conduttanze postsinaptiche e la registrazione elettrodo. Tali ritardi possono introdurre ambiguità riguardo poli-versus monosinaptici contributi. Inoltre, piccoli eventi sinaptici può decadere prima di raggiungere il sito di registrazioni somatiche e guidano l'attività presinaptica più forte, è probabili reclutare polisinaptici eventi.
Varie tecniche sono state sviluppate per verificare le connessioni monosinaptica negli invertebrati. Un approccio utilizza soluzioni alta catione bivalente (Hi-Di) che contengono in eccesso Mg ++ e Ca+ +. Questa soluzione blocca le connessioni polisinaptici di riduzione probabilità di rilascio e crescente potenziale di azione soglia per favorire il rilevamento di monosinaptica ingresso4,5. Determinare il rapporto preciso di Mg Ca ++ ++ necessaria, tuttavia, non è banale e polisinaptici contributi possono persistere per stimolazione anche modesto6. Un approccio alternativo chiamato GFP ricostituzione attraverso partner sinaptica (stretta) sfrutta la vicinanza tra membrane pre- e postsinaptiche trovato alle sinapsi di dedurre una connessione monosinaptica 7. Qui, un componente della proteina fluorescente verde (GFP) è espresso in un neurone, e il frammento complementare della molecola è espressa in un presunto partner postsinaptico. La presenza di fluorescenza indica che i due neuroni sono nelle vicinanze per consentire la ricostituzione della molecola GFP e implica l'esistenza di una sinapsi. STRETTA può segnalare sinapsi falsamente, però, se due cellule strettamente hanno apposto membrane, come in un nervo o fascicolo. Varianti di impugnare eliminano tali falsi positivi tramite il tethering il frammento presinaptico della GFP direttamente alla sinaptobrevina, permettendo così la ricostituzione solo alle sinapsi attivo8. Mentre stretta e le sue varianti sono stati strumentali nel determinare la connettività funzionale in Drosophila CNS, alcuni collegamenti potrebbero non essere reso visibili da afferrare se le distanze tra i partner di pre- e postsinaptici è relativamente grande. Questo è particolarmente pertinente nella valutazione della trasmissione volume associato neuromodulation9 o di inibizione GABAergica10.
Qui, una tecnica complementare e romanzo è dimostrata per test connessioni dirette monosinaptica in Drosophila CNS. Questo metodo, chiamato tetrodotossina Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS), opera di co-espressione di tetrodotossina (TTX)-canale del sodio resistente, NaChBac e un attivatore di optogenetica in una cellula presinaptica durante la registrazione da presunti postsinaptica partner9. In presenza di TTX, tutte le attività di potenziale di azione-mediata è soppressa in cellule diverse da quelle che esprimono NaChBac. Il canale di NaChBac Ripristina selettivamente eccitabilità nelle celle presinaptiche mirate, permettendo la trasmissione sinaptica luce-evocati. Questo metodo consente la forte attivazione dei neuroni presinaptici, tale che le connessioni possono essere risolti postsynaptically registrando somatico, riducendo la probabilità di reclutamento circuiti polisinaptici. D'importanza, questa tecnica permette lo studio della trasmissione di volume e rivela la diffusione del trasmettitore liberato da un singolo neurone in tutto un circuito. Inoltre, TERPS può rivelare la natura chimica della connessione attraverso farmacologia convenzionale. TERPS è adatto ad uso in qualsiasi sistema di modello che permette l'espressione transgenica dei canali del sodio TTX-insensibile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">UAS-csChrimson</td>
			<td style="width:219px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:344px;">55135</td>
			<td style="width:167px;">Used as a neural activator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UAS-NaChBac</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9466</td>
			<td style="width:167px;">Resotores excitibility in cells in TTX</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tetrodotoxin</td>
			<td>Tochris</td>
			<td>1078</td>
			<td style="width:167px;">Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">all trans-Retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td>
			<td>R2500</td>
			<td style="width:167px;">Require co-factor for channelrhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Weldable 321 Stainless Steel&#160;Sheet,&#160;0.002&#34;&#160;Thick,&#160;10&#34;&#160;Wide</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3254K7</td>
			<td style="width:167px;">Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td style="width:167px;">Used for dissection of preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Waxer</td>
			<td>Almore</td>
			<td>Eectra Waxer 66000</td>
			<td style="width:167px;">Used during dissection to secure fly in foil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraffin Wax</td>
			<td>Joann</td>
			<td>4917217</td>
			<td style="width:167px;">Used with waxer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Number 5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#5CO</td>
			<td style="width:167px;">Used for dissection and desheathing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissection Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td style="width:167px;">Used to remove parts of the cuticle during dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tungsten wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>797500</td>
			<td style="width:167px;">Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Reciculating Peristaltic Pump</td>
			<td>Simply Pumps (Amazon)</td>
			<td>PM200S</td>
			<td style="width:167px;">for recirculating TTX</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Speed Controller for peristaltic pump</td>
			<td>Zitrades (Amazon)</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Versa-Mount&#160;Precision Compressed Air Regulator</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td style="width:344px;">1804T1</td>
			<td style="width:167px;">For applying positive pressure during patching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capilaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:344px;">TW150F-3</td>
			<td style="width:167px;">For patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multipurpose Gauge</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3846K431</td>
			<td style="width:167px;">Gauge for pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrophysiology Camera</td>
			<td>Dage MTI&#160;</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td style="width:167px;">Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IR LED</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>M850F2</td>
			<td style="width:167px;">For oblique illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fiber optic for IR LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M89L01</td>
			<td style="width:167px;">Couples to IR LED</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 40X</td>
			<td>LUMPlanFLN</td>
			<td style="width:167px;">This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Amber LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M590L3d</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing RFP and mCherry</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blue LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M470L3d</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing GFP</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GFP filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49011</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Custom mCherry Filter Set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td style="width:344px;">&#160;et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic</td>
			<td style="width:167px;">Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dichroic to combine Amber and blue LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:344px;">DMLP550R</td>
			<td style="width:167px;">Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Red LED</td>
			<td>LEDSupply</td>
			<td>Cree XPE 620 - 630 nm</td>
			<td style="width:167px;">Used to drive csChrimson</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LED Driver</td>
			<td>LEDSupply</td>
			<td>3021-D-E-1000</td>
			<td style="width:167px;">Used to drive LEDs for optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-225</td>
			<td style="width:167px;">Used to position pipette during recordings</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patchclamp Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 2400</td>
			<td style="width:167px;">An equivalent amplifier is suitable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bessel Filter</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>LPF 202A</td>
			<td style="width:167px;">Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Data Acquisition System&#160;</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI PCIe-6321&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 781044-01</td>
			<td style="width:167px;">Used to record data from amplifier to computer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>779556-01</td>
			<td style="width:167px;">Used to connect amplifier to DAQ card.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Steel Foil&#160;</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3254K7</td>
			<td style="width:167px;">Steel foil for custom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnets</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>D42</td>
			<td style="width:167px;">To secure recording chamber to ring stand</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;">1/16&#34; Cell Cast Acrylic Clear</td>
			<td>Pololu</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels

Qui, una nuova tecnica chiamata Tetrotoxin (TTX) Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS) viene applicata per verificare monosinaptica connessioni tra i neuroni bersaglio. Il metodo si basa sulla co-espressione di un attivatore transgenico con il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac, in un neurone presinaptico specifico. Connessioni con presunto partner post-sinaptico sono determinate dalle cellule intere registrazioni in presenza di TTX, che blocca l'attività elettrica nei neuroni che non esprimono NaChBac. Questo approccio può essere modificato per funzionare con qualsiasi attivatore o l'imaging del calcio come un reporter di connessioni. TERPS aggiunge il set crescente di strumenti disponibili per determinare la connettività all'interno di reti. Tuttavia, TERPS è unico in quanto segnala anche attendibilmente massa o volume trasmissione e trasmissione di spillover.

TERPS è utilizzato per distinguere tra mono - e polisinaptici contributi in connessioni sinaptiche tra i neuroni. Mentre la stimolazione debole di una cella può essere utilizzata per verificare le connessioni dirette, guidando una maggiore attività presinaptiche spesso reclute polisinaptici connessioni (Figura 1A). TERPS funziona cheesprimono il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac e un attivatore di optogenetica e test delle connessioni in presenza di TTX per eliminare connessioni polisinaptici (Figura 1B). TTX blocca efficacemente i potenziali di azione del cervello di Drosophila , rendendolo un'adeguata preparazione per TERPS (Figura 2A). Transgenici espressione del canale del sodio di NaChBac Salva eccitabilità nei neuroni e si traduce in un potenziale grande altopiano (Figura 2B).
Interneuroni locali (LN) nel lobo antenne mostrano robuste risposte alla stimolazione olfattiva (Figura 3A). Tuttavia, poiché EPSPs individuali non sono facilmente risolti presso la soma LN, rimane poco chiaro se tali risposte derivano direttamente dall'input di neurone olfattivo del ricevitore (ORN) o indirettamente input tramite neuroni di proiezione (PN) (Figura 3B). Utilizzando TERPS, ORNs mostrato qui, infatti rendere dirette connessioni sinaptiche con LNs (Figura 3).
Una caratteristica unica dei TERPS è la sua capacità di risolvere in particolare trasmissione extra-sinaptica volume che può verificarsi con GABA o neurotrasmettitori come la serotonina. Stimolazione di un neurone serotoninergico (il CSDn) nel lobo antennal Drosophila si traduce in un misto di eccitazione ed inibizione in un interneurone locale (Figura 4A e fig. 4B). L'eccitazione è meditato di acetilcolina del trasmettitore eccitatorio e l'inibizione è causato da serotonina (Figura 4 e Figura 4). TERPS può essere utilizzato per determinare se le connessioni sono monosinaptici eliminando polisinaptici connessioni (Figura 4E). In TTX, una forte inibizione è ancora osservata in LN, suggerendo che arriva da direttamente dall'attivazione di un neurone serotoninergico specifico (Figura 4F e Figura 4). Questa connessione è bloccata dalla metisergide antagonista della serotonina. La sinapsi eccitatoria mediata dall'acetilcolina è stata eliminata in TTX, suggerendo che ha presentato da fonti polisinaptici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig1.jpg"> Figura 1 : TERPS Elimina collegamenti polisinaptici e isolati ingressi monosinaptici. (A). un diagramma schematico che aumentando l'attività presinaptica può reclutare polisinaptici connessioni. (B). un diagramma che illustra come TERPS può rimuovere contributi polisinaptici utilizzando TTX per eliminare attività spiking in neuroni. Eccitabilità esclusivamente viene ripristinato in una popolazione di neuroni che possono poi essere eccitato optogenetically. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57052/57052fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig2.jpg"> Figura 2 : NaChBac ripristina l'eccitabilità neuronale in Drosophila neuroni. (A) l'applicazione di 1 µm che TTX abolisce chiodare in neuroni di Drosophila . Sia attività spontanea e inibizione di odore-evocati sono eliminati in TTX. (B) NaChBac e csChrimson sono espressi nella CSDn e il cervello è esposto a TTX. la stimolazione csChrimson depolarizza il CSDn e dopo una soglia, c'è grande aumento nella tensione di membrana CSDn non-lineare. Questa rapida depolarizzazione costituisce un potenziale di plateau-come (inset). Ogni colore attraverso intensità di simulazione corrisponde al colore stesso nell'inserto di tensione. Questa figura è stata modificata da Zhang e Gaudry 20169. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57052/57052fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig3.jpg"> Figura 3 : TERPS rivela monosinaptica connessioni tra Rodolfo e LNs. (A), A registrazione di esempio mostrano una risposta di odore in un LN. Questa risposta può essere mono - o polisinaptici in natura. (B) TERPS possono essere testati presso il ORN a synapse LN. TTX è utilizzato per bloccare i potenziali di azione e l'eccitabilità in tutte le cellule nella preparazione. Eccitabilità esclusivamente viene ripristinato in ORNs tramite il canale del sodio di NaChBac. Il ORNs può quindi essere eccitato con channelrhodopsin a suscitare rilascio sinaptico. Eventi sinaptici sono misurati post-synaptically usando cellule intere registrazioni. (C) TERPS rivela che il ORN a synapse LN è monosinaptica. TERPS può anche essere combinato con farmacologia per mostrare che la sinapsi è colinergica e bloccati dalla Mecamilamina di antagonista del recettore nicotinico (200 µM). La barra grigia verticale indica la durata della stimolazione di ORN. Questa figura è stata modificata da Zhang e Gaudry nel 20169. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57052/57052fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig4.jpg"> Figura 4 : TERPS è sensibile al rilascio di trasmissione di massa o volume dai neuroni modulatori. (A) la stimolazione dei risultati CSDn in un potenziale di azione da un LN registrato nel lobo antenne di Drosophila . (B) The LN è hyperpolarized modo che CSDn stimolazione provoca un'attività sottosoglia. La risposta di LN è costituito da una depolarizzazione veloce seguita da un hyperpolarization più lento. La barra grigia indica il tempo di stimolazione CSDn. Metisergide (50 µM), un antagonista del ricevitore 5-HT ampio, blocca il hyperpolarization lento ma non ha alcun effetto sulla depolarizzazione. Mecamilamina blocca la depolarizzazione veloce suggerendo che è colinergica in natura. TERPS (C) può essere utilizzato per risolvere i componenti chimici del CSDn a synapse LN sono mono-versus polisinaptici. (D) The CSDn è stimolata in presenza di TTX e postsinaptica LN risposte sono misurate nelle cellule intere registrazioni. Il hyperpolarization persiste in TTX suggerendo che è monosinaptica in natura. Questo hyperpolarization è bloccato anche da metisergide, costanti con la trasmissione serotoninergica. La depolarizzazione breve che rimane in TTX è probabilmente mediata da gap elettrico di accoppiamento, come esso non bloccati da antagonisti nicotinici. Questa figura è stata modificata da Zhang e Gaudry nel 20169. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57052/57052fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementari 1: lamina di Drosophila. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57052/DrosophilaFoil.pdf" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 2: fisiologia camera. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57052/PhysiologyChamber.pdf" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels at JoVE.com

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Questo articolo presenta un metodo per verificare le connessioni monosinaptica tra neuroni impiegando tetrodotossina e il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac.

Esaminando monosinaptica connessioni in Drosophila utilizzando i canali di sodio tetrodotossina resistenti

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

9.9K Views.  University of Maryland. Questo articolo presenta un metodo per verificare le connessioni monosinaptica tra neuroni impiegando tetrodotossina e il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac.

Video: Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

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Neuroscienze

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress has been made in our understanding of differences in response properties of neurons in different cortical layers5-8, yet there is still a great deal left to learn about whether and how neuronal populations encode information in a laminar-specific manner.
Existing multi-electrode array techniques, although informative for measuring responses across many millimeters of cortical space along the cortical surface, are unsuitable to approach the issue of laminar cortical circuits. Here, we present our method for setting up and recording individual neurons and local field potentials (LFPs) across cortical layers of primary visual cortex (V1) utilizing multi-contact laminar electrodes (Figure 1; Plextrode U-Probe, Plexon Inc).
The methods included are recording device construction, identification of cortical layers, and identification of receptive fields of individual neurons. To identify cortical layers, we measure the evoked response potentials (ERPs) of the LFP time-series using full-field flashed stimuli. We then perform current-source density (CSD) analysis to identify the polarity inversion accompanied by the sink-source configuration at the base of layer 4 (the sink is inside layer 4, subsequently referred to as granular layer9-12). Current-source density is useful because it provides an index of the location, direction, and density of transmembrane current flow, allowing us to accurately position electrodes to record from all layers in a single penetration6, 11, 12.

A fundamental issue in our understanding of cortical circuitry is how networks in different cortical layers encode sensory information. Here we describe electrophysiological techniques utilizing multi-contact laminar electrodes to record single-units and local field potentials and present analyses to identify cortical layers.

Esaminando l&#39;elaborazione locale di rete che utilizza multi-contatto laminare elettrodi di registrazione

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Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar tasks. Participants' behavior during task performance in an fMRI scanner can then be correlated to the brain activity using the blood-oxygen-level-dependent signal. We measure behavior to be able to sort correct trials, where the subject performed the task correctly and then be able to examine the brain signals related to correct performance. Conversely, if subjects do not perform the task correctly, and these trials are included in the same analysis with the correct trials we would introduce trials that were not only for correct performance. Thus, in many cases these errors can be used themselves to then correlate brain activity to them. We describe two complementary tasks that are used in our lab to examine the brain during suppression of an automatic responses: the stroop1 and anti-saccade tasks. The emotional stroop paradigm instructs participants to either report the superimposed emotional 'word' across the affective faces or the facial 'expressions' of the face stimuli1,2. When the word and the facial expression refer to different emotions, a conflict between what must be said and what is automatically read occurs. The participant has to resolve the conflict between two simultaneously competing processes of word reading and facial expression. Our urge to read out a word leads to strong 'stimulus-response (SR)' associations; hence inhibiting these strong SR's is difficult and participants are prone to making errors. Overcoming this conflict and directing attention away from the face or the word requires the subject to inhibit bottom up processes which typically directs attention to the more salient stimulus. Similarly, in the anti-saccade task3,4,5,6, where an instruction cue is used to direct only attention to a peripheral stimulus location but then the eye movement is made to the mirror opposite position. Yet again we measure behavior by recording the eye movements of participants which allows for the sorting of the behavioral responses into correct and error trials7 which then can be correlated to brain activity. Neuroimaging now allows researchers to measure different behaviors of correct and error trials that are indicative of different cognitive processes and pinpoint the different neural networks involved.

The goal of our research is to correlate behavior to brain activity. Accurate behavioral measures and imaging techniques allow us to elucidate brain-behavior relationships.

Correlare risposte comportamentali alla segnali fMRI di Human corteccia prefrontale: Esame Processi Cognitivi Utilizzando Task Analysis

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larvale Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...