Siamo grati a Liam Tyron per la sua lettura esperta del manoscritto. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti dalle scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) D. A. cappa. D. A. Hood è anche titolare di un Canada Research Chair in fisiologia cellulare.

Tutte le procedure relative agli animali erano esaminate e approvate dal comitato di cura di York University degli animali. All'arrivo presso la struttura animale all'Università di York, tutti i ratti sono stati dati un minimo di cinque giorni per acclimatarsi al loro ambiente prima della procedura chirurgica, con cibo fornito ad libitum. Anche se questo protocollo è stato applicato in precedenza per altre specie15,17,22, la carta corrente si basa sul lavoro pionieristico di Pette e colleghi23 e si concentra sul modello del ratto, in particolare.
1. preparazione dell'unità di attività contrattile cronica
<ol><li>Utilizzando un voltmetro, controllare il potenziale delle batterie al litio moneta. Nota: Il potenziale di ogni batteria deve essere 3.0 ± 0,10 V.</li>
	<li>Inserire due o tre batterie nello slot dell'unità in modo che il potenziale totale è 6-9 V. Nota: È a discrezione dei ricercatori a considerare quanto potenziale (6 o 9 V) per mantenere durante la procedura intera sperimentale. Secondo lo studio di progettazione e l'intensità desiderata dello stimolo, 2 o 3 batterie possono essere usate.</li>
	<li>Verificare che l'unità stia funzionando correttamente tramite l'indicatore di impulso, di esporre l'unità a 1 impulso emesso da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi.</li>
</ol>2. intervento chirurgico di attività contrattile cronica
Nota: Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima della procedura chirurgica. Durante e immediatamente dopo l'intervento chirurgico, la temperatura corporea dei topi è mantenuta da un rilievo di riscaldamento. È preferibile eseguire l'intervento chirurgico su un telo chirurgico. Il chirurgo deve indossare guanti chirurgici sterili, nonché un camice da laboratorio pulito. Se necessario, si consiglia di indossare una maschera respiratore monouso.
<ol><li>Anestetizzare ratti sotto 1-3% isoflurane inalazione con l'ossigeno, che è gestito da un sistema di Vaporizzatore gas. Confermare l'animale è completamente sedata controllando hindlimb pizzico di punta e osservando la frequenza e profondità respiratoria. Applicare il lubrificante oculare sugli occhi per evitare la secchezza. Applicare un'iniezione sottocutanea di Meloxicam (0,5 mg/mL) a 2 mg/kg. Nota: Si consiglia inoltre di avere un'applicazione multi-modale di analgesia (ad es., Meloxicam più lidocaina) per ridurre al minimo qualsiasi dolore durante e dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Delicatamente Radere l'arto posteriore sinistro, come pure una striscia intorno al tronco dalla parte posteriore del collo, intorno alle spalle degli arti anteriori e attraverso il torace anteriore. Strofinare delicatamente le zone rasate con iodio e alcol etilico per disinfettare.</li>
	<li>Con l'animale che pone sul suo stomaco, praticare una piccola incisione (~0.5 cm) sul retro del collo al centro della regione rasata (l'area palpabile tra scapole) usando un bisturi (lama n. 10).</li>
	<li>Individuare il nervo peroneo comune.<ol>
<li>Animale sul suo lato destro del rullo e fare un ~ 2-3 cm-lungo taglio nella pelle dell'arto posteriore sinistro. L'area di incisione intorno i gruppi muscolari di coscia superiore che è monumentale tra la fossetta dell'articolazione del ginocchio e la parte posteriore vicino all'origine della coda di destinazione. Nota: Fare attenzione a non contaminare la prima area di incisione quando si cambia la posizione del corpo.</li>
		<li>Utilizzando punte blunt curvo forbici chirurgiche, sezionare la zona sottocutanea ampiamente ~3.5 - 4 cm, che separa la pelle dal muscolo sottostante al fine di rendere una tasca tra la pelle aperta e muscolo sottostante. Aprire la pelle dal tessuto di fondo su tutta la circonferenza dell'incisione (~1.5 cm2).</li>
		<li>Praticare una piccola incisione (meno di 0,5 cm) sul muscolo bicipite femorale con forbici chirurgiche, assicurando che le punte delle forbici sono di taglio basso direttamente attraverso il muscolo.</li>
		<li>Aprire delicatamente la zona del taglio fino a quando i gruppi muscolari interna e il nervo peroneo comune sono visibili (la profondità dei tessuti muscolari esterne (cioè, bicipite femorale) è di circa ~0.5 cm). Utilizzando forcipe, delicatamente tocco/pizzico il nervo visibile e osservare le risposte dei gruppi muscolari di destinazione (ad es., TA muscolo) e dita dei piedi (visibile dorsiflexion) per confermare che il nervo peroneo comune è isolato. Nota: Questo passaggio deve essere effettuato con estrema cautela per evitare di tagliare o danneggiare il nervo.</li>
		<li>Fissare la finestra tirandola aperta con metallo divaricatori tale che la dimensione della finestra è ~1.5 cm2 con il nervo peroneo che si trova al centro della finestra. Utilizzare il piccolo gancio metallico collegato a cinghie e/o elastici che vengono fissate alla superficie del tavolo (o bordo di chirurgia) (Figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Fissare il cavo a entrambi i lati del nervo.<ol>
<li>Preparazione di ~ 50-60 cm di politetrafluoroetilene (PTFE)-rivestito di filo di acciaio sottile e piegarlo a metà. Nota: Potrebbe essere utile per esporre PTFA-rivestito filo sotto la luce UV prima dell'intervento.</li>
		<li>Agganciare la parte piegata del filo nella fessura di una canna di acciaio inox lungo cm 30. Passare l'asta, insieme con il filo, per via sottocutanea da tasca aperta del hindlimb verso l'area piccola incisione sul retro del collo, in un modello di L-forma fino alla gamba e lungo il centro della schiena.</li>
		<li>Trovare le due estremità del filo presso l'arto posteriore. Spelare i fili dal momento che tutti i fili sono isolati in PTFE. Con attenzione usando un bisturi, spelare le estremità del filo di ~1.5 cm. Se i fili diventano sfilacciati, ritagliale e ri-strip. Avvolgere le estremità dei conduttori spogliato intorno ad un ago 21G smussata (5 volte), rendendo una bobina. Una volta che le bobine siano state effettuate correttamente, rimuovere l'ago da loro.</li>
		<li>Utilizzando una dimensione di seta chirurgica 6-0, fissare ciascuna delle bobine su entrambi i lati del nervo peroneo comune (Figura 2A).<ol>
<li>Fare un nodo alla fine della bobina e si sutura sul lato sinistro del nervo. Assicurarsi che la bobina sia 1.5-2.5 mm dal nervo.</li>
			<li>Per fissare la bobina, applicare due o tre suture supplementari lungo la bobina.</li>
			<li>Ripetere questi passaggi sul lato destro del nervo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Applicare 2-3 gocce di soluzione antibiotica (ampicillina in soluzione salina; 132 mg/mL) e quindi con attenzione la finestra (cioè, tessuto del muscolo bicipite femorale) usando la seta di dimensioni 5-0 suturare.</li>
	</ol></li>
	<li>Senza bloccare vento slack rimanenti di filo (circa il diametro del dito indice) e spingere la tasca sottocutanea sopra l'incisione suturata del muscolo bicipite femorale (circa sopra l'anca).</li>
	<li>Applicare 2-3 gocce di soluzione antibiotica nuovamente (ampicillina in soluzione salina; 132 mg/mL). Chiudere la pelle aperta di pinzatura.</li>
	<li>Collegare i fili (che fuori dell'area di incisione del collo) per lo stimolatore CCA.<ol>
<li>Collegare prese pin con i fili.<ol>
<li>Tagliare l'anello del filo che esce l'incisione nella parte superiore del collo per creare 2 estremità del filo (questi conducono le bobine suturato ai lati del nervo peroneo).</li>
			<li>Usando un bisturi, spelare le estremità dei fili da ~0.5 cm. tagliare i fili sfilacciati, se presente.</li>
			<li>Lentamente spingere le parti spogliate dei cavi nel foro delle prese pin e utilizzando un saldatore, saldare i fili sulle prese pin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Facoltativamente, selezionare la connessione dei cavi.<ol>
<li>Collegare i pin ad un'unità di stimolatore grande benchtop tramite morsetti a coccodrillo.</li>
			<li>Fornire un singolo impulso di 9 V (0,1 ms, 10 Hz) per confermare che TA muscoli contratti e sinistra piede dorsiflexes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Passare le estremità dei conduttori collegati pin attraverso il tampone di garza sterile che è ~ 4 x 4 cm.</li>
		<li>Collegare i pin per l'unità di stimolatore CCA.<ol>
<li>Passare i cavi attraverso il foro nella base della casella di stimolatore. Nota: Questa casella è una camera fatta in casa per l'unità di stimolatore CCA ed è 3,5 cm × 3,5 cm × 2,5 cm13.</li>
			<li>Inserire le spine nelle prese di connessione dell'unità di CCA. Inserire delicatamente l'unità CCA nel vano. Utilizzare una virata appiccicosa per fissare l'unità CCA nella parte inferiore della camera.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzando un nastro atletico o il nastro chirurgico poroso, difficoltà della camera con nastro adesivo intorno il torso rasato. Chiudere il coperchio dell'alloggiamento con tre strati di nastratura e finire avvolgendo un nastro intorno ai lati della finestra di stimolatore per garantire la casella (Figura 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Verifica se il CCA sta lavorando di esporre l'unità a un singolo impulso di luce infrarossa (spettro di lunghezza d'onda > 770 nm) che viene emesso da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi. Nota: Se il CCA è correttamente funzionante, i ricercatori sarà in grado di vedere che i muscoli del hindlimb (cioè, TA) sono contraenti in risposta alla luce a infrarossi.</li>
	<li>Il ratto di osservare e monitorare la temperatura fino a quando non ha pienamente riacquistato coscienza. Casa in una gabbia di singolo occupante per prevenire qualsiasi danno da altri animali e non lasciare alcun tunnel o oggetti di plastica nella gabbia per il resto dello studio per mitigare il rischio di danni all'apparecchio stimolatore o lesioni all'animale. Alimentazione con una bottiglia di acqua incluso Amoxicillin (0,5 mg/mL).</li>
	<li>Applicare la dose di 1 mg/kg di Meloxicam per via sottocutanea ogni 24 h dopo l'intervento chirurgico, che continua almeno per 72 h.</li>
</ol>3. cronica attività contrattile
<ol><li>Dopo l'intervento chirurgico, consentire almeno 5-7 giorni per un pieno recupero dell'incisione e zone di sutura in/intorno i muscoli scheletrici. Nota: Durante e dopo la procedura CCA, controllare accuratamente la condizione di ogni animale osservando i loro comportamenti (ad es., mangiare, bere, e/o in movimento). Inoltre, determinare qualsiasi stress grave o effetti negativi verificando un cambiamento di peso corporeo prima e dopo la procedura CCA.</li>
	<li>Il giorno di stimolazione di CCA, accendere CCA esponendo l'unità stimolatore ad un singolo impulso di luce infrarossa (lunghezza d'onda > 770 nm) da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi.</li>
	<li>Applicare 3 o 6 h di stimolazione CCA 10 Hz. Nota: I tempi per la stimolazione è fino al ricercatore. La frequenza di stimolazione non è mai stata alterata in questi esperimenti, e solo molto modesti miglioramenti nell'adattamento mitocondriale sono state osservate estendendo la stimolazione da 3 a 6 ore al giorno, nella nostra esperienza. Se possibile, controllare la stimolazione e l'animale ogni 30-60 min.</li>
	<li>Successivamente al periodo CCA desiderato, spegnere l'unità CCA tramite esposizione alla luce a infrarossi (stessa procedura di accensione dell'unità).</li>
	<li>Se l'applicazione di più giorni, ripetere il passo 3.2. 3.4.</li>
	<li>Determinare i tempi di raccolta del tessuto. Ad esempio, raccogliere tessuti 24 h dopo l'inizio del combattimento finale di CCA (cioè, 18 h dopo l'ultima stimolazione di CCA di 6 h), che si svolge sotto l'anestesia, come fatto durante la procedura chirurgica di CCA. Immediatamente dopo aver raccolto tutti i tessuti, eutanasia animali asportando il cuore mentre l'animale è ancora sotto anestesia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holloszy, J. O., Coyle, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptations+of+skeletal+muscle+to+endurance+exercise+and+their+metabolic+consequences.">Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).</li><li>Hood, D. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il modello di attività contrattile cronica (CCA) di esercizio, attraverso il muscolo bassa frequenza stimolazione in vivo, è un eccellente modello per studiare gli adattamenti fenotipica del muscolo per esercitare13,24,25 , 26. come dimostrato in precedenti studi20,27, CCA è un efficace strumento mediante il quale i ricercatori possono controllare formazione volumi e frequenze (cioè, il tempo e giorni) e indagare vari biochimici e/o molecolari eventi nel corso di ripetuti attacchi di attività contrattile. Una delle migliori caratteristiche di questo modello è che i muscoli dell'arto posteriore controlaterale sono utilizzati come controllo interno, che contribuisce a ridurre al minimo la variabilità tra gli animali. Inoltre, i nostri numerosi esperimenti oltre un decennio hanno dimostrato che l'unità esterna di CCA non limita ordinaria modelli comportamentali di un animale (ad es., roaming, mangiare e dormire) e consente l'utilizzo di ulteriori trattamenti sperimentali di tali come iniezioni di droga. Così, i ricercatori possono applicare il protocollo CCA nei loro studi di formazione con le proprie modifiche sperimentali.
Questo protocollo CCA ha diverse fasi critiche, anche se tutti i passaggi possono esigere una concentrazione ad alto livello a causa di una natura di chirurgia di sopravvivenza. È particolarmente importante collegare i fili alle posizioni coerenti, e si consiglia vivamente di avere il ricercatore stesso abile a eseguire l'intervento per mantenere la coerenza in landmarking nello stesso punto del nervo, sutura fili alla stessa distanza dalla nervo, ecc. Inoltre, è necessario confermare la sicurezza della taping prima e durante l'applicazione di CCA, perché nastro allentato o usurata può portare a un fallimento della procedura.
Questo modello CCA ha alcune piccole limitazioni. Poiché l'unità di stimolazione di CCA è fissato con nastro adesivo, alcuni animali presentano irritazioni della pelle intorno alla zona di nastratura. Questo potrebbe essere migliorata negli studi futuri attraverso l'uso di una giacca da indossare che dovrebbe sostituire la camera di CCA senza nastratura, tuttavia, non abbiamo avuto successo con tali Giacche. In alternativa, lo stimolatore può essere impiantato nello spazio intraperitoneale per evitare la nastratura procedura28, anche se questa procedura è più invasiva. Inoltre, l'unità descritta stimolatore esterno è progettato per essere controllato tramite l'esposizione ai raggi infrarossi. Tuttavia, se un'unità non riesce a rispondere alla luce infrarossa, ciò potrebbe indicare cambiamenti nella resistenza o sensibilità dell'unità dopo lungo tempo di utilizzo. L'implementazione di un microchip in ultima analisi, può evitare l'uso della luce infrarossa e consentirebbe a tutti i parametri di CCA essere programmato e memorizzati, abilitazione CCA da applicare in modo più controllato e preciso. Tutti i disegni di studio dovrebbero anche considerare l'uso della chirurgia di sham arto controlaterale per escludere eventuali possibili esiti derivanti dalla procedura chirurgica stessa.
Vale la pena di continuare a indagare come CCA può regolare del muscolo massa e fenotipo dopo i periodi di inattività muscolare cronica, o nel contesto di altre malattie muscolari. Come mostrato in recenti studi clinici29,30, CCA può essere applicato anche per esaminare la sua efficacia sui meccanismi di segnalazione anabolizzanti nelle popolazioni di invecchiamento. In conclusione, noi incoraggiamo i ricercatori a prendere vantaggio di utilizzare questo protocollo CCA nei loro studi, per cui possono indagare i vari meccanismi cellulari e molecolari alla base fenotipica adattamenti del muscolo scheletrico esercizio cronico.

Muscolo scheletrico può adattarsi per esercitare attività di formazione attraverso i cambiamenti nella sua bioenergetica e struttura fisica1. Una delle principali alterazioni provocate da allenamento di resistenza è la biogenesi mitocondriale, che può essere valutata da un aumento nell'espressione di componenti mitocondriali (ad es., le unità secondarie del citocromo c ossidasi [COX]), così come l'espressione di il coactivator transcriptional, PGC-1 α2. Un crescente numero di studi hanno indicato che numerosi altri fattori, tra cui fatturato mitocondriale e mitophagy, sono anche importanti per l'adattamento del muscolo. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali esercizio acuto o cronico regolano questi processi in muscolo scheletrico sono ancora poco chiari.
Per delineare le vie che regolano gli adattamenti indotti dall'esercizio muscolare, vari modelli di esercizio sono stati utilizzati comunemente negli studi nei roditori, tra cui tapis roulant, corsa ruota e il nuoto esercizio. Tuttavia, questi protocolli hanno alcune limitazioni, in quanto sono necessarie ~ 4-12 settimane per osservare questi cambiamenti fenotipici3,4,5. Come metodo alternativo sperimentale, bassa frequenza indotta da stimolazione cronica attività contrattile (CCA) è stato effettivamente utilizzato, come può portare ad adattamenti muscolari in un periodo sostanzialmente più corto (cioè, fino a 7 giorni) e suoi effetti sembrano essere paragonabile o addirittura superiore di altri protocolli di esercizio. Inoltre, la presenza di ormonale6, temperatura7ed effetti neurologici8 può rendere difficile capire muscolo-specifiche risposte all'esercizio cronico. Ad esempio, dell'ormone tiroideo9,10 e fattore di crescita insulino-simile (IGF) -111 sono stati identificati per mediare adattamenti indotto dall'allenamento del muscolo, che possono regolare anche altre vie di segnalazione in scheletrico muscolo. In particolare, gli effetti indotti da CCA minimamente sono regolati da fattori sistemici, che permette di concentrare attenzione sulla risposta diretta del muscolo scheletrico all'attività contrattile.
L'unità esterna per CCA fu introdotto da Tyler e Wright12ed è stato sviluppato con modifiche12. In breve, l'unità si compone di tre parti principali: un rivelatore ad infrarossi che può essere attivato e disattivata tramite l'esposizione a luce infrarossa, un generatore di impulsi e un indicatore del polso (Figura 1). Il disegno di circuito dettagliate dell'unità stimolatore è stato descritto in precedenza13. Le caratteristiche dettagliate e specifiche di CCA possono essere trovate maggiore profondità in un numero di revisione articoli14,15,16,17. In breve, il protocollo di stimolazione è progettato per attivare il nervo peroneo comune a bassa frequenza (cioè, 10 Hz), e i muscoli innervati (tibiale anteriore [TA] e muscolo estensore digitorum longus [EDL]) sono costretti a contratto per un lunghezza predeterminata di tempo (ad esempio, 3-6 h). Nel corso del tempo, questo sposta i muscoli di cui sopra ad un fenotipo più aerobico, dimostrato da un aumento della densità capillare18 sia contenuto mitocondriale19,20,21. Pertanto, questo metodo è un modello collaudato di imitare alcuni degli adattamenti formazione resistenza principali all'interno del muscolo scheletrico di ratti.
Questa carta presenta una procedura dettagliata della chirurgia l'impianto dell'elettrodo per indurre CCA in modo che i ricercatori possono applicare questo modello nei loro studi di esercizio. CCA è un eccellente modello per studiare il corso di tempo degli adattamenti muscolari, fornendo così un efficace strumento per l'indagine sui vari eventi molecolari e segnalazione ad entrambi i punti tempo presto e tardi segue l'inizio dell'allenamento fisico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronic contractile activity unit</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm)</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Box should be made of opaque material or covered in an opague tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coin lithium ion batteries (3V)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>CR2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medwire</td>
			<td>Leico Industries</td>
			<td>316SS7/44T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder pin (socket)</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>ED6218-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonas porous tape</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>5104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture silk (Size 5)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture silk (Size 6)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>706G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved blunt scissor (11.5 cm Length)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved blunt scissor (15 cm Length)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14111-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate haemostatic forceps (16 cm Length)</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>06-0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter)</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip applying forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>20-916-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staples (clips)</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>BN507R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal hooks/retractor</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine (500 mL)</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>#NPN00172944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Novopharm</td>
			<td>#DIN00872644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Boehringer</td>
			<td>#DIN02240463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital multimeter (voltmeter)</td>
			<td>Soar Corporation</td>
			<td>ME-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED digital stroboscope</td>
			<td>Lutron Electronic Enterprise</td>
			<td>DT-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of chronic stimulation to study contractile activity-induced rat skeletal muscle phenotypic adaptations

Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente adattabile, poichè le proprietà biochimiche e fisiologiche sono notevolmente alterate in risposta all'esercizio cronico. Per studiare i meccanismi di fondo che portano a vari adattamenti muscolari, un numero di protocolli di esercizio come tapis roulant, ruota running e nuoto esercizio è stato utilizzato negli studi sugli animali. Tuttavia, questi modelli di esercitazione richiede un lungo periodo di tempo per raggiungere adattamenti muscolari, che possono anche essere regolamentati da fattori umorali o neurologici, limitando le loro applicazioni nello studiare gli adattamenti indotti da contrazione muscolo-specifico. La stimolazione indiretta bassa frequenza (10 Hz) per indurre l'attività contrattile cronica (CCA) è stata utilizzata come modello alternativo per l'allenamento, come correttamente può portare ad adattamenti mitocondriale muscolare entro 7 giorni, indipendente da fattori sistemici. Questa carta descrive in dettaglio le tecniche chirurgiche necessari per applicare il trattamento di CCA a muscolo scheletrico di ratti, per studi di applicazione diffusa in futuro.

Abbiamo dimostrato che l'attività contrattile cronica (CCA) è uno strumento efficace per indurre adattamenti favorevoli mitocondriali nel muscolo scheletrico. I ratti sottoposti a 7 giorni di CCA (6 h al giorno) visualizzare rafforzata la biogenesi mitocondriale nel muscolo stimolato rispetto l'arto posteriore non stimolate controlaterale (controllo). Questo aumento della biogenesi mitocondriale è indicato dall'espressione aumentata della proteina di PGC-1 α (Figura 3A), considerato il principale regolatore della biogenesi mitocondriale, insieme con le elevazioni delle altre proteine mitocondriali chiave COX-I e COX-IV, che sono componenti importanti della catena di trasporto degli elettroni. Inoltre, l'attività dell'enzima citocromo c ossidasi (COX), un indicatore utile di contenuto mitocondriale, aumentato circa il 30% dopo 7 giorni di CCA (Figura 3B). Inoltre, abbiamo valutato i cambiamenti nella funzione mitocondriale utilizzando fibre muscolari permeabilized per misurare la capacità respiratoria mitocondriale e trovato che CCA ha provocato un aumento del maximal respiratoria (cioè, stato 3) capacità del muscolo sottoposti a 7 giorni di stimolazione rispetto al muscolo di controllo (Figura 3). Inoltre, entrambe le popolazioni mitocondriale, subsarcolemmali (SS) e intermyofibrillar (FMI), aumentati dopo 7 giorni di CCA (Figura 4A e B), e abbiamo trovato le frazioni di IMF dal muscolo sottoposto a 7 giorni di attività contrattile per essere colore rosso osservabile ulteriori rispetto a quelli derivati dal muscolo del controllo (CON) mediante centrifugazione differenziale, presumibilmente che indica i livelli elevati di mioglobina, EME e altri elementi relativi a ossigeno (Figura 4).
Adattamenti ai sistemi lisosomiale e autofagia possono anche essere determinati da CCA. In particolare, abbiamo osservato un aumento nell'abbondanza della proteina di fattore di trascrizione EB (IL2RG; Figura 5A), il principale regolatore della biogenesi lisosomiale, da CCA affatto tempo punti (cioè, 1, 3 e 7 giorni), così come altri marcatori lysosomal come proteina della membrana lisosomiale-collegata 1 (LAMP1; Figura 5B). È interessante notare che, il nostro studio ha dimostrato che le alterazioni all'autofagia, mitophagy e sistemi lysosomal accadere prima della biogenesi mitocondriale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig1.jpg"> Figura 1. Un diagramma schematico Mostra componenti principali di uno stimolatore CCA portatile unità Questa figura è stata modificata da Takahashi et al. 13. IR, infrarossi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig2.jpg"> Figura 2. L'impianto di elettrodi e stimolatore. (A) una finestra per collegare i fili ai due lati del nervo peroneo comune. (B) un'immagine esemplare per dimostrare un corretto assemblaggio del CCA. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig3.jpg"> Figura 3. PGC-1alpha, respirazione mitocondriale e l'attività enzimatica con CCA. (A) CCA induce adattamenti mitocondriali nel muscolo scheletrico, come indicato da un aumento nei livelli della proteina di PGC-1 α. Un'immagine rappresentativa della macchia è mostrata insieme a ß-actina come il controllo di carico. CON si riferisce al controllo, cioè, arto posteriore controlaterale non sottoposti a CCA e piega cambiamento dati sono stati ottenuti normalizzando risultati relativi CON al giorno 1. (B) l'attività di COX e (C) permeabilizzate respirazioni del muscolo erano anche aumentati dopo 7 giorni di CCA. Tutti i dati vengono visualizzati come media ± SEM (N = 6-8). †P < 0,05, effetto di interazione tra CCA e tempo; §P < 0,05, effetto principale della CCA; P < 0,05, differenza significativa vs controllo al giorno 1. Figura 3A e 3B sono stati modificati da Kim e cappuccio19. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig4.jpg"> Figura 4. Prova della biogenesi mitocondriale nel muscolo con CCA. (A e B) Immagini al microscopio elettronico indicano volumi allargate di subsarcolemmale (SS) e di intermyofibrillar mitocondri (FMI) in muscolo scheletrico di ratti esposti a CCA per 7 giorni. Questa immagine è stata modificata da Ljubicic et al. 21e barre della scala indicano 1 µm. (C) un confronto di fractionations mitocondriale muscolare tra controllo (CON) e muscolo stimolato (CCA) dopo 7 giorni di stimolazione di CCA. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig5.jpg"> Figura 5. Il sistema lisosomiale è aumentata di 7 giorni di CCA. Questo è indicato da aumento di abbondanze di proteina in entrambi IL2RG (A) e (B) LAMP1. Risultati sono mostrati come piegare le modifiche normalizzando i dati relativi CON 1 giorno. (C) immagini rappresentative della macchia sono mostrati e GAPDH è un controllo di carico. §P < 0.05, effetto principale di CCA. Tutti i dati vengono visualizzati come media ± SEM (N = 8); ¶P < 0.05, effetto principale del tempo; P < 0,05, differenza significativa contro controllo (CON) al giorno 1. Questa figura è stata modificata da Kim e cappuccio19. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Questo protocollo descrive l'uso del modello di attività contrattile cronica di esercizio per osservare gli adattamenti indotti da stimolazione del muscolo scheletrico nell'arto posteriore del ratto.

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

application-chronic-stimulation-to-study-contractile-activity-induced

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K Views.  York University. Questo protocollo descrive l'uso del modello di attività contrattile cronica di esercizio per osservare gli adattamenti indotti da stimolazione del muscolo scheletrico nell'arto posteriore del ratto.

Video: Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Cultura Vivo del faringea Archi allo Studio cuore e muscoli Progenitori e la loro nicchia

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

Diffrazione a raggi X del muscolo scheletrico Murine intatto come strumento per studiare la base strutturale della malattia muscolare

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Esecuzione di Xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...