This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.

1. ceppo batterico e crescita medio <ol><li> Rendere albumina destrosio e soluzione salina magazzino (ADS) solubilizzando 25 g di albumina di siero bovino, 10,0 g di destrosio, e 4,05 g di cloruro di sodio in 460 ml di acqua deionizzata. Filtro-sterilizzare ADS e conservare a 4 ° C. </li><li> Rendere 7H9 brodo aggiungendo 4,7 g di polvere 7H9 e 2 mL di glicerolo a 900 ml di acqua purificata. Autoclavare il brodo 7H9 a 121 ° C per 10 minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere. Fare 7H9ADST aggiungendo 100 ml di ADS e 0,5 ml di Tween80 a 900 ml di brodo 7H9. Conservare a 4 ° C. </li><li> Pesare 50 mg di kanamicina solfato e sciogliere in 1 ml di acqua deionizzata; la concentrazione finale è di 50 mg / mL. Filtro-sterilizzare e conservare a -20 ° C. Aggiungere 0,5 ml di kanamicina soluzione madre per 1 L di 7H9ADST. NOTA: Questo terreno deve essere fatta fresca, così scalare i volumi modo appropriato secondo la dimensione cultura. </li><li> Crescere M. tuberculosis in 7H9ADST integrato con kanamicina nella cultura in piedi. Agitare la cultura quotidiana e diluirlo prima che la raggiunga OD600 1,0 per evitare grumi. NOTA: Il ceppo M. tuberculosis utilizzato per lo sviluppo di questo metodo è stato trasformato con H37Rv pJAK2.A plasmide 12. pJAK2.A è un plasmide integrativo basato sul vettore pMV361, che permette l&#39;espressione ad alto livello del gene luciferasi di lucciola dal promotore HSP60 e può essere selezionata tramite kanamicina. </li></ol> 2. THP-1 Medium e manutenzione <ol><li> Aggiungere 50 ml di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS) e 5 ml di 200 mM di L-glutammina a 500 ml di RPMI 1640 per fare mezzo RPMI incompleta (circa il 10% FBS e 2 mM glutammina). </li><li> Mantenere una coltura cellulare THP-1 secondo protocollo standard 13. Brevemente, crescere cellule THP-1 in mezzo RPMI incompleta mantenendo una densità cellulare da 0,2 a 1 milione per mL di terreno tra passaggi. </li></ol> 3. Screening intracellulare high-throughput Utilizzando luciferasi che esprimono M. tuberculosis H37Rv <ol><li> Misurare la densità ottica di una sospensione batterica attiva crescita in uno spettrofotometro ad una lunghezza d&#39;onda di 600 nm. Calcolare la densità batterica utilizzando il fattore di conversione di 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 batteri per mL. </li><li> Pipettare i batteri sufficienti per una molteplicità di infezione (MOI) di 10: 1 in una nuova provetta da centrifuga. Pellet a 3.000 xg per 10 minuti e aspirare il liquido. Aggiungere 50 ml di siero umano a 450 ml di RPMI1640. Scala il volume di appropriarsi dei valori per l&#39;esperimento. </li><li> Per opsonize i batteri, risospendere il pellet ad una densità di 1 x 10 8 batteri per 500 ml di RPMI1640 contenente 10% di siero umano. Lasciare la miscela a incubare a 37 ° C per 30 min. Determinare la THP-1 cellule densità coltura contando con un emocitometro e un microsco invertitape. </li><li> Agglomerare le cellule in provette da centrifuga sterili a 100 xg e 37 ° C per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in RPMI incompleta ad una densità di 1 milione di cellule per ml. Aggiungere forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) per un 40 ng ml di concentrazione / finale. NOTA: Questo sarà indicato come il mix di differenziazione. </li><li> Combinare opsonizzati M. tuberculosis con THP-1 mix differenziazione ad una MOI di 10: 1 e aliquota della miscela finale a 100 microlitri per pozzetto in una piastra bianca 96 pozzetti a fondo piatto. Regolarmente agitare la miscela per assicurare uniformità. Permettono la differenziazione e l&#39;infezione di procedere notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. </li><li> Lavare i pozzetti due volte con 100 ml di RPMI ciascuno. Aggiungere composti diluiti alle concentrazioni desiderate in RPMI incompleta ed incubare per 3 giorni. </li><li> Aspirare il terreno dai pozzi. Aggiungere 50 ml di reagente saggio luciferasi in ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con transparent sigillanti piastra adesivi. Consentire 5 min di incubazione a 22 ° C e quindi ottenere una lettura in un luminometro a 1 s per pozzetto. </li></ol> 4. Analisi citotossicità usando un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) 14 <ol><li> Differenziare le cellule THP-1 in RPMI incompleta completato con 40 ng / ml di PMA in chiaro piastre da 96 pozzetti. Mantenere una densità cellulare di 1 milione per mL e un&#39;aliquota di 100 microlitri per pozzetto. Lasciare differenziazione di procedere notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. </li><li> Aspirare il terreno dai pozzetti e lavarli due volte con RPMI 1640. Aggiungere composti diluite in RPMI incompleti ai pozzetti. Incubare per 3 giorni. </li><li> Sciogliere 0.5 g di MTT in 100 mL di tampone fosfato salino (PBS) per ottenere una soluzione stock di 5 mg / mL. filtro sterile e conservare a -20 ° C, al riparo dalla luce; è meglio per rendere questa soluzione fresca. </li><li> 2.5 h before la fine del periodo di incubazione di 3 giorni, aggiungere 25 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto e completare il periodo di incubazione. </li><li> Preparare 50% N, N-dimetil formammide (DMF) miscelando 250 ml di DMF con 250 mL di acqua deionizzata. </li><li> Preparare tampone di estrazione MTT come segue: Pesare 100 g di SDS in una bottiglia da 500 ml e aggiungere 300 ml di DMF al 50%. Applicare a fuoco basso per permettere al SDS sciogliere. Aggiungere 10 ml di acido acetico puro e 12,5 ml di 1 M HCl. Riempire fino al segno da 500 ml con il 50% DMF; la composizione finale del tampone di estrazione è del 50% DMF, 20% SDS, 2,5% di acido acetico e 2,5% 1 M di acido cloridrico. </li><li> Al termine del periodo di trattamento, aggiungere 100 ml di tampone di estrazione (riscaldato a 45 ° C per sciogliere i cristalli) a ciascun pozzetto. Lasciare la miscela a incubare durante la notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. Leggere l&#39;assorbanza a 570 nm. NOTA: Il test di citotossicità migliore viene eseguita in parallelo con un&#39;intracellularischermo lare con persone dello stesso lotto e l&#39;età di cellule THP-1. </li></ol> 5. In brodo di attività di analisi Utilizzando un resazurina Assay 3 <ol><li> Crescere M. tuberculosis in 7H9ADST alla fase di mid-log (~ 0,5-0,8 OD 600). Diluire la cultura con la 7H9ADST a 0,01 OD 600. Diluire i composti in 7H9ADST a 2x le concentrazioni di prova e un&#39;aliquota di 100 microlitri di ciascun composto diluito in ciascun pozzetto. </li><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione batterica diluita in ciascun pozzetto. Lasciare le piastre di incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato per 5 giorni. Sciogliere 10 mg di resazurina in 100 mL di acqua deionizzata e filtro sterile. </li><li> Aggiungere 30 ml di soluzione di resazurina e monitorare il cambiamento di colore dopo 48 ore; la crescita batterica è indicato da una conversione di colore dal blu al rosa. NOTA: Un&#39;analisi quantitativa può essere eseguita misurando sia la fluorescenza a 590 nm con eccitazione a 530 - 560nm o l&#39;assorbanza a 570 nm e 600 nm 15. </li></ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2015. , (2016).</li><li>Yajko, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determining+MICs+of+antimicrobial+agents+for+Mycobacterium+tuberculosis.">Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).</li><li>Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+screening-based+identification+of+inhibitors+against+the+intraphagosomal+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).</li><li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence.">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).</li><li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis.">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy.">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1, 57 (2010).</li><li>Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoevasion+and+immunosuppression+of+the+macrophage+by+Mycobacterium+tuberculosis.">Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis.</a> Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).</li><li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+drug+combinations+for+tuberculosis+therapy+identified+by+a+novel+high-throughput+screen.">Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).</li><li>Lam, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitazoxanide+stimulates+autophagy+and+inhibits+mTORC1+signaling+and+intracellular+proliferation+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).</li><li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Intracellular+Screen+for+New+Compounds+Able+To+Inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+Growth+in+Human+Macrophages.">Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria.">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62, 158-165 (2009).</li><li>. THP-1 (ATCC TIB-202) Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx</a> (2016)</li><li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-examination+and+further+development+of+a+precise+and+rapid+dye+method+for+measuring+cell+growth/cell+kill.">Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill.</a> J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).</li><li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AlamarBlue assay. , (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handbook+of+anti-tuberculosis+agents.+Introduction.">Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction.</a> Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).</li><li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Viability Assays. , (2004).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+efficacy+of+apramycin+in+murine+infection+models.">In vivo efficacy of apramycin in murine infection models.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).</li><li>Ballell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+open-source+drug+discovery:+177+small-molecule+leads+against+tuberculosis.">Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis.</a> ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).</li><li>Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatase+PtpA+is+not+required+for+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+mice.">Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice.</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).</li><li>Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+protein+tyrosine+phosphatase+(PtpA)+excludes+host+vacuolar-H+-ATPase+to+inhibit+phagosome+acidification.">Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).</li><li>Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+virulence+is+mediated+by+PtpA+dephosphorylation+of+human+vacuolar+protein+sorting+33B.">Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B.</a> Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).</li><li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 147-159 (2015).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> J Vis Exp. , e51960 (2014).</li><li>Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+protein+C3+binding+to+Mycobacterium+tuberculosis+is+initiated+by+the+classical+pathway+in+human+bronchoalveolar+lavage+fluid.">Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid.</a> Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+mycobacteria.">Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria.</a> PLoS One. 5, e10777 (2010).</li><li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput/high-content+screening.">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. , e51114 (2014).</li><li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2'+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors.">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Q203,+a+potent+clinical+candidate+for+the+treatment+of+tuberculosis.">Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis.</a> Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests for this work.

L&#39;obiettivo di questo studio era quello di creare un metodo semplice e conveniente HTS utilizzando un modello di infezione intracellulare umana per M. tuberculosis. La tubercolosi è una malattia umana caratterizzata da infezione di macrofagi alveolari di M. tuberculosis. A causa di problemi di biosicurezza, ricerca che coinvolgono modelli biologici sia del batterio e le cellule ospiti è stata utilizzata in passato. Tuttavia, è stato dimostrato che l&#39;uso di batteri surrogate e modelli non umani sono predittori poveri del successo hit-to-lead nello sviluppo di farmaci, indicando che lo screening di stupefacenti è fatto meglio con le cellule umane infettate con M. tuberculosis 19, 20, 21, 22. In questo metodo, abbiamo avanzato e adattato protocolli di screening attuale stato dell&#39;arte per la THP-1 linea cellulare macrofagica-like umano. Al fine di raggiungere alterendimento, abbiamo introdotto diversi miglioramenti tecnici al protocollo infezione. Innanzitutto, abbiamo sostituito tutte le fasi coinvolte nella determinazione CFU e sostituito con un sistema reporter luciferasi-based. Luciferasi di lucciola è stato scelto per il semplice dosaggio punto finale, la rapida degradazione da parte di enzimi lisosomiali cellula ospite, e dei requisiti minimi attrezzature. Questa sostituzione eliminato efficacemente un periodo di incubazione di 30 giorni, nonché i costi di manodopera e di consumo associati placcatura e la colonia di conteggio passi. Un secondo importante miglioramento abbiamo introdotto era elaborazione batch e infezione, che migliora ulteriormente la velocità e la coerenza tra i pozzetti con un protocollo più semplice infezione. Combinando i punti di differenziazione e di infezione in un unico passaggio, siamo stati in grado di accorciare il protocollo di un giorno. Allo stesso tempo, siamo riusciti a ridurre i tre cicli di lavaggio che normalmente verificarsi tra differenziazione e infection, che è una fonte di possibile perdita di cellule THP-1 dovuta al distacco. Questo protocollo è stato sviluppato per lo screening all&#39;interno della linea di cellule THP-1, che conferisce diversi vantaggi. THP-1, come una linea cellulare immortalizzata, può essere attendibilmente coltivate in vitro per oltre 20 passaggi 23. Ciò è particolarmente importante per le grandi campagne di screening, in cui può essere difficile da mantenere abbastanza cellule per la fornitura di una configurazione high-throughput. Inoltre, test in THP-1 fornisce un background genetico omogenea che minimizza la variabilità nei risultati. Questo è estremamente utile per i composti di prova che influenzano le risposte della cellula ospite 10. Come ulteriore vantaggio, l&#39;espressione genica nella linea cellulare THP-1 può essere down-regolato da piccoli RNA interferenti (siRNA) 24. Questo fornisce uno strumento prezioso per le indagini a valle nel modo di azione dei composti di successo. Anche se questo metodo creata usando THP-1 linea cellulare, essapuò essere facilmente adattato per le cellule primarie umane, come le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), come precedentemente illustrato 10. Per simulare meglio l&#39;interazione effettiva tra macrofagi alveolari e M. tuberculosis, il protocollo di dosaggio intracellulare comprende una fase di opsonize batteri. Opsonizzazione con cappotti siero umano M. tuberculosis e facilita l&#39;ingresso delle cellule via recettore del complemento 3 (CR3) 25. Batteri nudo hanno maggiori probabilità di entrare macrofagi attraverso il recettore lectina 8. Dato che il fluido broncoalveolare è noto per contenere componenti di siero umano 25, opsonizzazione, o la sua mancanza, può avere un impatto fondamentale sul risultato di screening. Tuttavia, alcuni possono scegliere di saltare questo passaggio, al fine di semplificare ulteriormente il processo di infezione 16, oppure potrebbe non essere possibile ottenere abbastanza siero umano a causa delle dimensioni del library subendo il blocco 11. Il saggio intracellulare comprende un passaggio per rimuovere tutto il liquido contenente il materiale staccato dai pozzi prima dell&#39;aggiunta del reagente luciferasi. Questo passo è progettato per aumentare il rapporto segnale-rumore riducendo la quantità di reagente usato per pozzetto. Tuttavia, l&#39;inclusione di questa fase può generare dati falsi-positivi per composti che uccidono THP-1 ma non M. tuberculosis, poiché staccati e lisate THP-1 e fluttuante M. tuberculosis verranno eliminate. Pertanto, il protocollo suggerito dal produttore di aggiungere la stessa quantità di luciferasi reagente (100 mL) a ciascun pozzetto deve essere seguita per saggiare per M. tuberculosis sopravvivenza in pozzetti contenenti composti citotossici. In contrasto con il sistema di luciferasi di lucciola, il sistema lux batterica non richiede reagenti esterni per la generazione del segnale 26. Però,il sistema di lucciola è preferito rispetto al sistema lux per i seguenti motivi: In primo luogo, il sistema batterico può essere tossico nei micobatteri 26. In secondo luogo, un sistema reporter più complesso (5 geni lux contro 1 gene per lucciola) è più suscettibile di segnalare inibizione da composti in esame. Infine, reagenti disponibili in commercio per il saggio luciferasi di lucciola forniscono le condizioni necessarie per la generazione del segnale ottimale. D&#39;altra parte, il sistema di luciferasi batterica si basa sulla produzione di ATP e cofattori presenti all&#39;interno dei batteri alla generazione del segnale. Questi possono variare tra diversi trattamenti e non sono facili da controllare. Pertanto, l&#39;aggiunta del reagente luciferasi di lucciola sistema standardizza le condizioni di reazione e fornisce misurazioni più affidabili di attività della luciferasi in tutti i trattamenti. determinazione CFU ha lungo il gold standard per la quantificazione densità batterica. Nel contratto, bioluminescence, come la maggior parte dei giornalisti, non è una misura diretta di batteri. Invece, RLU è funzione sia CFU e lo stato metabolico dei batteri. Altri hanno dimostrato la relazione tra lo più lineare RLU e CFU per micobatteri bioluminescenti in condizioni specifiche 5. In ogni caso, una significativa riduzione nel segnale test luciferasi, indipendentemente sottostante causa-diverso l&#39;inibizione effettiva di enzima luciferasi per attività indicherebbe una riduzione della tubercolosi idoneità M. all&#39;interno della cellula ospite. Pertanto, questi composti sarebbero interessanti dal punto di vista screening di farmaci e non dovrebbe essere escluso sviluppo del metodo. Un&#39;alternativa al protocollo di screening intracellulare luciferasi-based è fluorescente automatizzato microscopia approccio basato 11, 27, 28, 29. la luciferasiuscita saggio viene misurata mediante un luminometro, ei dati ottenuti è quantitativa, mentre microscopia a fluorescenza genera immagini che sono qualitativa. Tuttavia, tramite programmazione di computer intelligente, le immagini possono essere esaminati per generare dati quantitativi. Inoltre, la microscopia a fluorescenza consente più fluorofori per essere utilizzati contemporaneamente, che è molto utile per la raccolta di parametri importanti quali la vitalità cellulare, conta delle cellule, e il tasso effettivo di infezione. Come ci si potrebbe prevedere, questi benefici sono dotati di alcune battute d&#39;arresto. L&#39;investimento iniziale in attrezzature microscopia a fluorescenza automatizzato è molte volte superiore al costo di un luminometro o fluorimetro ed è quindi fuori dalla portata di molti laboratori di ricerca. Per coloro che hanno accesso alle apparecchiature, il trattamento del campione deve essere considerato prima dell&#39;acquisizione delle immagini e l&#39;analisi dei dati. Queste due fasi riguardano l&#39;investimento di tempo nel complesso, con aumenti delle dimensioni della libreria. L&#39;inclusione di etichette fluorescenti supplementari in cellule ospiti, necessitanties passi fissaggio, colorazione e lavaggio, che richiedono quindi investimenti intervento da parte dell&#39;utente e tempi aggiuntivi. Inoltre, la raccolta di dati fluorescente microscopia ed analisi, anche se automatizzato, richiede ancora molto più tempo e risorse rispetto alla semplice lettura saggio di luciferasi. Pertanto, il metodo intracellulare di screening basato luciferasi è più semplice e in grado di maggiore produttività. Il metodo di screening intracellulare luciferasi basata avere una limitazione significativa rispetto ai metodi di screening microscopio basati fluorescenti. Questo è dovuto al fatto che il saggio luciferasi non fornisce i dati per quanto riguarda lo stato di salute dei macrofagi ospitanti. composti citotossici causerebbe la morte dei macrofagi, e quindi batteri vivi possono essere rilasciati nel mezzo e sarebbe più contribuire al segnale finale dosaggio luciferasi. Come risultato, i composti citotossici sembrerebbero causare la morte di M. tuberculosis intracellulare e quindi generazioea gran numero di falsi positivi. Per risolvere questo problema, abbiamo completato il nostro metodo con un metodo MTT per valutare la citotossicità dei composti sui macrofagi ospitanti. Questo modulo del metodo di screening ci fornisce ulteriori informazioni sulla drugability di composti di interesse e consente l&#39;eliminazione precoce di meno-che-ideale farmaci candidati. In alternativa, si può utilizzare anche il saggio luciferasi intracellulare basata prima di effettuare microscopia a fluorescenza automatizzato. In schermi di grandi librerie di composti, questo permette per la valutazione rapida ed efficace di efficacia composto nel modello di infezione dei macrofagi. Di conseguenza, microscopia a fluorescenza automatizzato può essere riservato per studi dettagliati sui candidati migliori, come illustrato da uno studio pubblicato in precedenza 11. Il basso costo e la natura semplice del saggio intracellulare luciferasi a base beneficia anche notevolmente i ricercatori che desiderano testare piccolier librerie chimiche. Nel complesso, il saggio di luciferasi intracellulare a base ha dimostrato di essere uno strumento estremamente flessibile per i laboratori di ricerca di tutti i calibri e per lo screening di progetti di varie dimensioni.

Mycobacterium tuberculosis, l&#39;agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. TB Drug-sensibile è una malattia curabile che richiede più antibiotici per un periodo di 6 mesi. Pur essendo una malattia curabile, la mortalità TB è stato stimato a 1,5 milioni nel 2015 1. Negli ultimi 10 anni, ci sono stati crescenti preoccupazioni sulla prevalenza della farmaco-resistente M. tuberculosis. Multiresistente TB (MDR-TB) è definita come TBC che è resistente ad almeno isoniazide (INH) e rifampicina (RMP), e la maggior parte dei ceppi MDR-TB sono anche resistenti per selezionare farmaci di seconda linea TB, limitando così le opzioni di trattamento . Gli effetti della resistenza ai farmaci creano una sfida maggiore per il trattamento di pazienti co-infettati con il virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV); 400.000 pazienti in tutto il mondo sono morte di tubercolosi associata ad HIV nel 2015 1. Purtroppo, gli Stati Uniti Food and Drug Administrazione ha approvato un solo nuovo farmaco contro la TB MDR-TB, bedaquiline, negli ultimi 40 anni 2. I progressi nella ricerca di una migliore e più brevi terapie TB sono urgentemente necessarie al fine di rimanere in testa nella lotta contro la tubercolosi e la MDR-TB. Tradizionalmente, TB droga schermi vengono eseguite in vitro in condizioni di crescita in terreno di coltura, per cui i composti vengono aggiunti ad una coltura in crescita e la loro efficacia nel sradicare i microrganismi sono determinati dal conteggio delle unità formanti colonie (CFU) su terreno solido. Come conta CFU sono alta intensità di lavoro, che richiede tempo, e costoso, vari metodi indiretti sono stati sviluppati per alleviare questo problema. Tali metodi includono la vitalità dosaggio Alamar Blue 3, la determinazione della fluorescenza 4 dalla proteina verde fluorescente (GFP) o luminescenza 5 dai batteri luciferasi che esprimono, e la stima di adenosina trifosfato totale (ATP) 6, 7. TB tipica è caratterizzata da un&#39;infezione da M. tuberculosis del polmone, in cui i batteri risiedono e replicano all&#39;interno dei fagosomi di macrofagi alveolari 8. Lo schermo semplice in brodo fenotipica può soddisfare patogeni extracellulari; tuttavia, in prospettiva storica, ha colpito composti contro M. tuberculosis individuati con questo metodo spesso non riescono a essere all&#39;altezza delle aspettative durante le fasi di validazione a valle in modelli di infezione. Proponiamo che la tubercolosi farmaco è meglio eseguita in un modello di infezione cellula ospite intracellulare. Tuttavia, i modelli intracellulari possiedono molte barriere tecnologiche e biologiche di screening (HTS) sviluppo ad alta produttività. Un grande ostacolo è la complessità del processo di infezione, esemplificato da numerosi passaggi e la rimozione elaborato di batteri extracellulari da in-tra lavaggio. Un secondo ostacolo principale è il tempo lungo rigenze, il rilevamento crescita, normalmente svolto da CFU contando su piastre di coltura, è un processo che richiede più di 3 settimane per completare. Una soluzione per sostituire una conta è stata fornita mediante microscopia a fluorescenza automatizzata in combinazione con i batteri fluorescenti. Tuttavia, questa soluzione richiede un investimento iniziale che apparecchiatura è fuori portata per molti laboratori di ricerca. Un semplice, a basso costo, e il metodo HTS malattie rilevanti sarebbero migliorare notevolmente il processo di scoperta di nuovi farmaci. In questo studio, riportiamo un nuovo sistema modulare HTS che mira a fornire un rapido e altamente scalabile, ma economica, saggio atto a determinare l&#39;attività dei composti contro M. tuberculosis intracellulare. Questo sistema è composto da tre moduli: (i) intracellulari, (ii) citotossicità, e (iii) Prove in brodo. Il risultato finale combinato fornisce una descrizione completa delle proprietà dei componenti, con ulteriori informazioni riguardanti la modalità potenziale di azione. Questo scSistema reening è stato utilizzato in diversi progetti con varie librerie di composti modalità di azione che colpiscono, compresa l&#39;analisi di sinergia farmaco 9, la stimolazione dell&#39;autofagia 10, e l&#39;inibizione di M. tuberculosis -secreted fattore di virulenza (non pubblicata). I composti di modalità sconosciuta di azione sono stati studiati 11. Una versione modificata di questo metodo è stato adottato anche dal nostro partner industriale come il metodo di screening primario di identificare nuovi composti contro intracellulare M. tuberculosis 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>271210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween80</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine pH7</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Hydrocholoric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>351279212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>351269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M. tuberculosis H37Rv</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom white plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95-well flat bottom clear plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Tropix TR717</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

system for efficacy and cytotoxicity screening of inhibitors targeting intracellular mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

High-Throughput Screening intracellulare con M. tuberculosis che esprime il gene della luciferasi Figura 2A e 1 contengono i dati grezzi raccolti dal luminometro, espressi in unità luminescenti relativa (RLU), che mostra l&#39;effetto di un aumento di concentrazione di TB rifampicina farmaco su M. tuberculosis all&#39;interno cellule THP-1. La figura 2A è un diagramma a dispersione della luminescenza grezzo misurata in RLU per varie concentrazioni di rifampicina. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard della media (SEM). La Figura 2B mostra la riduzione percentuale di luminescenza in pozzetti trattati rispetto ai pozzetti non trattate. I dati dimostrano che la rifampicina è capace di ridurre&gt; 99,9% di RLU da M. tuberculosis intracellulare ad una concentrazione di 0,1 mg / mL. Questo è in accordo con il precedente ay pubblicato MIC tra 0,1 e 0,4 ug / ml 16. Luminescenza prodotta in ciascun pozzetto è un&#39;indicazione del totale luciferasi espressa da M. tuberculosis e quindi è un indicatore dello stato metabolico di M. tuberculosis all&#39;interno del pozzo. È normale livelli luminescenti prime per variare tra esperimenti. In quanto tale, un confronto tra i dati grezzi genererebbe conclusioni inaffidabili. Pertanto, i dati devono essere normalizzati contro un controllo negativo definito, che sarebbero i campioni trattati con solo DMSO. I valori ottenuti possono essere espressi come riduzione percentuale in M. tuberculosis nei pozzetti (Figura 2B). Analisi citotossicità usando il saggio MTT Il saggio MTT è un saggio ben consolidata per la citotossicità eucarioti. Questo saggio colorimetrico indica cellule vive attraverso la conversione di MTT (giallo) performazano color porpora. Questo test viene eseguito senza infezione da M. tuberculosis perché i batteri sono in grado di metabolizzare MTT, che riduce la tossicità osservata dei composti. Un suggerimento comune per il saggio MTT è utilizzare supporti senza l&#39;indicatore di pH rosso fenolo per assorbimento a 570 nm 17. Tuttavia, il tampone di estrazione acidificato descritto in questo metodo è in grado di minimizzare le interferenze causate da rosso fenolo 17. La Figura 3 illustra la citotossicità causata da una crescente concentrazione di un composto di prova G1-1H codificata. Normalmente, una concentrazione di inibizione del 50% (IC 50) viene impiegato per indicare il livello di citotossicità. Nel caso di G1-1H, concentrazioni di 10 uM e 3 pM sono chiaramente sotto della IC50 concentrazione. In brodo attività analisi ciing saggio resazurina Il saggio resazurin è comunemente usato per l&#39;analisi di citotossicità in cellule eucariotiche, ma può anche essere utilizzato per monitorare batteri vivi in brodo 3. Il saggio è un saggio resazurina redox-based simile al dosaggio MTT. Misura livelli NADPH e deidrogenasi NADPH attraverso la conversione di resazurina in resorufina, un fluoroforo rosso. Il modo più semplice e veloce per determinare l&#39;efficacia della droga è quello di cercare la concentrazione trattamento più basso in cui i pozzi rimangono di colore blu. La figura 4 mostra parte di una piastra a 96 pozzetti che mostra gli effetti varie concentrazioni dei apramicina antibiotici hanno sulla resazurina conversione da M. tuberculosis. La MIC in brodo è stato determinato per essere tra 2,5 e 5 mg / mL. Questo è leggermente superiore al valore precedentemente pubblicata di 1,5 pg / ml 18, ma è ancora ben all&#39;interno della acceptabLe gamma. In molti casi, il cambiamento di colore è piuttosto graduale, per cui è difficile fare una determinazione fiducioso. In queste condizioni, è meglio quantificare la quantità effettiva di resazurina conversione utilizzando assorbanza o fluorescenza. A causa delle caratteristiche di assorbanza simili di resazurin e resorufina, determinazione MIC utilizzando assorbanza richiede misurazioni utilizzando due diverse lunghezze d&#39;onda e calcoli complessi 15. Pertanto, il metodo migliore è quello di misurare la fluorescenza usando da 530 a 560 nm lunghezza d&#39;onda di eccitazione e di una lunghezza d&#39;onda di emissione 590 nm, come descritto nella letteratura del produttore 15. La figura 4 illustra una potenziale fonte di incoerenza associato incubazioni più giorni che potrebbero alterare drasticamente risultati dello screening. A causa di umidificazione improprio del incubatore a 37 ° utilizzato per questo esperimento, pozzi sui bordi del p<html> tardive sofferto significativamente più evaporazione. Tutti 15 pozzetti DMSO-trattati dovrebbero essere identici, ma i pozzi lungo i bordi di sinistra e superiore avevano ridotto volumi. Questi pozzi sembrano avere colori diversi rispetto agli altri pozzetti DMSO-trattati al centro della piastra. La stessa incoerenza può anche essere osservata in 2,5 ug / mL pozzetti Apramicina trattati. In questo caso, il volume ridotto potrebbe anche portare ad una lettura quantitativa da uno spettrofotometro e fluorimetro. Evaporazione diventa significativa per tutti gli esperimenti con tempi di incubazione prolungati, quindi bisogna fare attenzione a mantenere ben incubatori umidificati-evitare questa fonte di incoerenza. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig1.jpg" /> Figura 1: Metodo Schemi. Diagramma raffigurante schemi di dosaggio per 3 moduli particolari del sistema di screening ad alto rendimento.<html> _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig2.jpg" /> Figura 2: Rappresentante dati da un intracellulare di esaminare l&#39;efficacia di rifampicina nell&#39;eliminazione M. tuberculosis all&#39;interno cellule THP-1. (A) Grafico della luminescenza medio lettura (in unità di luminescenza relativa) per ciascun trattamento (rifampicina) concentrazione. Le barre di errore indicano l&#39;errore standard della media per ogni triplicato. (B) Grafico della riduzione percentuale calcolata in luminescenza causato da un trattamento del rifampicina, in cui i valori più elevati indicano una maggiore efficacia. La concentrazione inibitoria del 90% (IC 90) in questo caso è da qualche parte tra 0,01 e 0,1 mg / mL.nk &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig3.jpg" /> Figura 3: Dati rappresentativi da un saggio di citotossicità (MTT) per esaminare gli effetti tossici di Compound G1-1H su differenziate cellule THP-1. Grafico della &quot;percentuale di controllo&quot; valori calcolati per ciascuna concentrazione del composto G1-1H trattamento, dove valori maggiori indicano sani cellule THP-1. L&#39;IC 50 in questo caso è da qualche parte tra 10 e 30 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55273/55273fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig4.jpg" /> Figura 4: dati rappresentativi da un resazurina Assay per esaminare la Effectiveness di Apramicina nell&#39;inibizione M. tuberculosis in brodo. Solo dati qualitativi raccolti in questo caso a causa di limitazioni di apparecchiature in 3 (BSL3) laboratorio livello di biosicurezza. La foto mostra parte di una piastra a 96 pozzetti contenenti M. tuberculosis trattati sia con DMSO o quantità variabili di apramicina. I pozzetti DMSO-trattati hanno mostrato una conversione del resazurina a resorufina, come indicato dalla conversione di colore dal blu al rosa. I campioni Apramicina trattata chiaramente sottoposti la conversione del colore sottostante 5 ug / mL. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55273/55273fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> [Rifampicina] </td><td> Rep1 </td><td> rep2 </td><td> rep3 </td><td&gt; Media </td><td> Riduzione% </td></tr><tr><td> 4 mg / ml </td><td> 184 </td><td> 190 </td><td> 210 </td><td> 195 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 1 mg / ml </td><td> 244 </td><td> 215 </td><td> 159 </td><td> 206 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 0,1 mg / ml </td><td> 1037 </td><td> 731 </td><td> 976 </td><td> 915 </td><td> 98 </td></tr><tr><td> 0,01 ug / mL </td><td> 19200 </td><td> 24400 </td><td> 23919 </td><td> 22506 </td><td> 54 </td></tr><tr><td> 0 mg / ml </td><td> 39877 </td><td> 49655 </td><td> 57728 </td><td> 49087 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: dati grezzi dal saggio luciferasi per la determinazione del intracellulare IC 90 di rifampicina. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> [G1-1H] </td><td> Rep 1 A570 </td><td> Rep 2 A570 </td><td> Rep 3 A570 </td><td> A570 media </td><td> % Di greggia </td></tr><tr><td> 30 micron </td><td> 0,056 </td><td> 0,056 </td><td> 0,055 </td><td> 0,056 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10 micron </td><td> 0,518 </td><td> 0,488 </td><td> 0,492 </td><td> 0,499 </td><td> 62 </td></tr><tr><td> 3 micron </td><td> 0,652 </td><td> 0,638 </td><td> 0,656 </td><td> 0,649 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 0 micron </td><td> 0,822 </td><td> 0.782 </td><td> 0,815 </td><td> 0,806 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: dati grezzi dal MTT Assay per la determinazione della citotossicità della prova Compound G1-1H a different concentrazioni.

Watch this Scientific Journal Video about System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis at JoVE.com

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

system-for-efficacy-cytotoxicity-screening-inhibitors-targeting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

8.5K Views.  University of British Columbia.  Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero. 

Video: System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identificazione di fattori di virulenza di Mycobacterium abscessus per replica intracellulare nei fagociti

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...