This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.

1. Sintesi di DOX-PA <ol><li> Pesare 390 mg di doxorubicina e 243 mg di acido palmitico idrazide, e versare in un pallone a fondo tondo. </li><li> Aggiungere 150 ml di metanolo anidro al pallone con una siringa di vetro. Aggiungere 39 ml di acido trifluoroacetico (TFA) con una pipetta. Utilizzando un agitatore magnetico, agitare la miscela di reazione per 18 ore a RT al buio. NOTA: Le quantità di materiali di reazione possono essere scalati verso l&#39;alto o verso il basso per ottenere diverse quantità di DOX-PA. Il rapporto dei reagenti dovrebbe essere mantenuto nelle stesse proporzioni. Reazioni che utilizzano quantitativi DOX nell&#39;intervallo 78 mg a 1.170 mg possono essere eseguite in un laboratorio chimico regolare. </li><li> Purificazione di DOX-PA usando una colonna di gel di silice. 17 <ol><li> Rimuovere il solvente nella miscela di reazione con un evaporatore rotante. Aggiungere 3 g di gel di silice dopo il volume della miscela si riduce a circa 20 ml. Continuare evaporatore ruotante per produrre polveri secche e permettere tegli adsorbimento di prodotti sul gel di silice. Mantenere il campione sotto vuoto per altri 30 minuti dopo si formano le polveri secche. </li><li> Confezione 50 g di gel di silice in una colonna diclorometano come solvente. Aggiungere con cautela il campione di gel di silice contenente prodotto adsorbito alla colonna. </li><li> Eluire la colonna con una miscela di diclorometano e metanolo, aumentando gradualmente la percentuale di metanolo, aumentando così la polarità del solvente (Tabella 1). </li><li> Raccogliere frazioni di eluente in provette (25 ml / tubo) e monitorare i progressi mediante cromatografia su strato sottile (TLC). </li><li> Combinare tutte le frazioni contenenti puro DOX-PA e rimuovere il solvente usando un evaporatore rotante fino alla formazione di polvere secca. Ulteriori essiccare il prodotto sotto vuoto O / N. </li></ol></li><li> Analisi di DOX-PA da TLC. <ol><li> Tagliare una sezione di quattro centimetri x 8 cm della piastra TLC. soluzioni campione Spot 0,5 cm dal fondo del piatto con TLC capillari avvistamento utilizzando soddisfatteHANOL come solvente. </li><li> Porre la piastra TLC in una camera di sviluppo contenente una miscela di diclorometano e metanolo (3/1, v / v). La profondità del solvente deve essere appena inferiore a 0,5 cm. </li><li> Rimuovere la placca dalla camera di sviluppo quando il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra. Segnare la posizione del fronte del solvente con una matita e lasciare la piastra si asciughi. Porre la piastra TLC in una camera di colorazione contenente saturo vapori di iodio per visualizzare campioni. </li></ol></li><li> Analisi di DOX-PA con 1 H-nucleare spettroscopia di risonanza magnetica (1 H-NMR). 18 <ol><li> Sciogliere 15 mg di DOX-PA in 1 ml di metil solfossido-d6 (DMSO) e trasferire il campione in un tubo NMR. </li><li> Inserire il tubo NMR nel magnete dello strumento NMR. Misurare lo spettro protonico, selezionando DMSO come solvente. Rimuovere il tubo NMR dal magnete. Analizzare il risultato NMR 18. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di DOX-PA Le micelle con il metodo Film-dispersione <ol><li> Sciogliere DSPE-PEG (40 mg) e DOX-PA (4 mg) con 2 ml di metanolo in una fiala di vetro da 10 ml. </li><li> Rimuovere il solvente organico sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante fino forma una sottile pellicola nel flacone. NOTA: In alternativa, evaporare i solventi organici sotto gas inerte (per esempio, argon o azoto) per formare una pellicola e mantenere la fiala in un essiccatore a vuoto per rimuovere ulteriormente solvente residuo. </li><li> Trasferimento 2 ml di tampone fosfato di Dulbecco (pH 7,4, DPBS) nella fiala di vetro. </li><li> Posizionare il flacone in un bagno ad ultrasuoni per 3 minuti a temperatura ambiente per generare micelle. NOTA: il potere ad ultrasuoni varia tra i diversi modelli di bagni ad ultrasuoni. Selezionare un&#39;unità in grado di generare energia sufficiente ad ultrasuoni per disperdere la sottile pellicola di polimero / farmaco. La potenza di uscita del bagno a ultrasuoni utilizzati in questo protocollo è di 110 W. </li><li> Mantenere micelle a 4 ° C per una conservazione a breve termine e -20 ° C a lungostoccaggio -term. NOTA: In alternativa, le micelle possono anche essere liofilizzati e ricostituiti con acqua prima dell&#39;uso. Di solito, non crioprotettore o lyoprotectant è necessario per questa formulazione. </li></ol> 3. Caratterizzazione di DOX-PA Le micelle <ol><li> Determinazione della concentrazione DOX-PA in micelle e l&#39;efficienza di incapsulamento farmaco <ol><li> Sciogliere DOX-PA sintetizzato nelle precedenti fasi di DMSO per preparare le soluzioni DOX-PA di cinque diverse concentrazioni: 1 mg / ml, 5 mg / ml, 20 mg / ml, 50 mg / ml, e 100 mg / ml. Misurare l&#39;assorbimento delle soluzioni DOX-PA con un UV-VIS spettrometro a 490 nm. Generare una curva standard in base alle concentrazioni di farmaco DOX-PA e il loro assorbimento corrispondente a 490 nm. </li><li> Diluire 25 ml di micelle di droga-caricato con 500 ml di DMSO. Misurare l&#39;assorbimento a 490 nm con uno spettrofotometro UV-VIS. Calcolare le concentrazioni di farmaco con la curva standard generata in 3.1.1. </li><li> Calcolare efficienza incapsulamento utilizzando la seguente equazione: Encapsulation Drug Efficienza (%) = (quantità di farmaci in micelle) / (quantità di farmaco aggiunto) × 100% </li></ol></li><li> Caratterizzazione della dimensione delle particelle con dispersione della luce dinamica (DLS) <ol><li> Diluire micelle con DPBS (pH 7,4) ad una concentrazione finale DSPE-PEG di 1 mg / ml. Analizzare un campione 2 ml con un analizzatore di dimensione delle particelle per ottenere le dimensioni e polidispersità indice Z-medio (PDI). </li></ol></li><li> Valutazione in vitro dell&#39;attività antitumorale NOTA: utilizzare appropriati tecnica sterile ed operare all&#39;interno di un armadio biosicurezza. <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura cellulare da un pallone di coltura cellulare (ad esempio, T25) contenente DU-145 cellule cancerose della prostata umana e lavare le cellule con 2 ml di DPBS (pH 7,4). </li><li> Aspirare DPBS, aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina (0,25%), e incubare per 2 minuti a 37 ° C per staccare le cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno di coltura cellulare (RPMI 1640 + 10% siero fetale bovino + 1% Antibiotico-antimicotica), quando la maggior parte delle cellule si staccano dal pallone. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare le cellule a 1.000 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet cellulare con 5 ml di mezzo di coltura cellulare e rimuovere un campione per contare il numero di cellule con un emocitometro. Diluire le cellule con mezzo di coltura cellulare ad una densità di 50.000 cellule / ml. Aggiungere sospensioni diluito di cellule in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti (100 ul / pozzetto). Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO 2) per 18 ore per permettere l&#39;adesione cellulare. </li><li> Diluire DOX dimetilsolfossido soluzione (DMSO) e la soluzione DOX-PA DMSO con terreno di coltura cellulare per ottenere concentrazioni finali di droga di 0,1 mM, 0,5 mM, 2 mM, 5 mM e 10 mM, rispettivamente. Mantenere concentrazione DMSO finale in tutti i campioni superiori allo 0,5%. Diluire DOX-PA micelle con terreno di coltura cellulare per ottenere finale co di drogancentrations di 0,1 mM, 0,5 mM, 2 mM, 5 mM e 10 mM, rispettivamente. Utilizzare il mezzo di coltura cellulare in bianco un controllo. </li><li> Rimuovere la piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti dal termostato e sostituire il mezzo di coltura cellulare con 100 ml di mezzo contenente diversi agenti di trattamento previste al punto 3.3.5 (n = 4 per ciascun gruppo). Incubare le cellule nella coltura cellulare incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per un ulteriore 72 hr. </li><li> Aspirare il mezzo e aggiungere 100 ml di mezzo contenente 0,5 mg / ml di 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT). </li><li> Incubare le cellule in incubatore di coltura cellulare per ulteriori 2 ore. Rimuovere con attenzione il supporto e aggiungere 100 ml di DMSO per sciogliere i cristalli formazano. </li><li> Misurare assorbanza con lo spettrofotometro per micropiastre alla lunghezza d&#39;onda di 570 nm e una lunghezza d&#39;onda di riferimento di 670 nm. </li><li> Calcolare la vitalità cellulare utilizzando la seguente equazione: <strong&gt; vitalità cellulare (%) = (A Test / Un controllo) × 100% NOTA: Confrontare la vitalità cellulare tra i diversi gruppi utilizzando una analisi della varianza ad una via (ANOVA) test statistico. Calcolare il IC50 sulla base di vitalità cellulare contro dati di concentrazione di droga. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In questo lavoro, si descrive un metodo pellicola dispersione rapida semplice per la preparazione di micelle. Questo metodo utilizza le proprietà auto-assemblaggio di un polimero amfifilico (ad esempio, DSPE-PEG) per formare core-shell micelle strutturati in un ambiente acquoso. Questo metodo di preparazione micelle ha diversi vantaggi. 1. Si tratta di un semplice processo di formulazione, che evita l&#39;uso di fasi dimensioni riduzione complicate (come estrusione o omogeneizzazione) comunemente utilizzati nella preparazione di liposomi, nanoparticelle, e nanoemulsioni. 19 2. Ha una buona riproducibilità. Eccellente uniformità da lotto a lotto può essere raggiunto quando la formulazione è stata ottimizzata e stabilito. Il protocollo è tollerante alle variazioni delle variabili di processo di preparazione, come resistenza e tempo sonicazione. Sebbene altri metodi (come il metodo di dialisi o il metodo di evaporazione dell&#39;emulsione-solvente) sono disponibili per micelle preparazione, la dispersione pellicolametodo è più conveniente ed efficiente. Pertanto, si ha un grande potenziale per essere adattato per l&#39;uso nella produzione su larga scala di micelle nell&#39;industria farmaceutica. Il limite di questo metodo è che dipende dalle proprietà di auto-assemblaggio di materiali di supporto e quindi è limitato a materiali con tali proprietà. La selezione inadeguato di materiali polimerici può portare al fallimento nel generare formulazioni micellari soddisfacenti. Inoltre, il metodo di preparazione si basa su ultrasuoni per disperdere il polimero / pellicola di farmaci e facilitare la formazione di micelle. La maggior parte disponibili in commercio bagni ad ultrasuoni sono adatti perché solo una debole potenza ultrasonica è necessario per formare micelle. Tuttavia, potrebbe essere un problema se si utilizza un bagno ad ultrasuoni con una potenza molto debole. Povero carico di droga e rilascio prematuro di droga sono grandi preoccupazioni per la consegna della droga micelle. In questo protocollo, abbiamo sviluppato una strategia di lipofila pro-farmaco per aumentare il caricoING di doxorubicina in micelle DSPE-PEG. Coniugazione del doxorubicina con i lipidi notevolmente migliorata la compatibilità e l&#39;interazione del farmaco con il core lipidico di micelle DSPE-PEG. Il pro-farmaco, DOX-PA, è stato sintetizzato da coniugare con doxorubicina lipidi attraverso un acido pH-sensibile idrazone linker. Questo linker è stabile a pH neutro e cleavable a pH acido. 20,21 Così, DOX è stabilmente caricato in micelle DSPE-PEG come un pro-farmaco a pH neutro e ha perdite minime farmaco durante la conservazione e durante la circolazione nel sangue. Una volta micelle DOX-PA entrano nelle cellule tumorali attraverso endocitosi, DOX-PA pro-farmaco sarà scisso e trasformato in libera DOX in risposta all&#39;ambiente endosome acido (pH 5-6). Dal momento che DOX è più idrofila di DOX-PA, questa conversione interromperà le interazioni tra DOX e il nucleo idrofobico di micelle, e quindi facilitare il rapido rilascio di DOX da micelle. Questa caratteristica design innovativo eviterà il rilascio incompleta farmaco, cheè un grave problema associato con coniugati di droga utilizzando linker non scindibili o lento-fendendo. 22 Questo approccio può essere applicato anche alla consegna di altri farmaci. La selezione di un linker appropriato è critico per il successo di questo approccio. I linker devono essere stabili in un ambiente fisiologico al fine di massimizzare la stabilità della formulazione. I linkers dovrebbero essere efficientemente spaccati in risposta a trigger nel microambiente tumorale (ad esempio, pH, enzimi, etc.) per rilasciare il farmaco progenitore. In questo protocollo, DOX-PA è stato caricato in modo efficiente in micelle ad alta efficienza di incapsulamento (~ 100%). La formulazione micelle anche dimostrato stabilità superiore ed è rimasta intatta per almeno tre settimane senza precipitazione farmaco o riduzione della concentrazione del farmaco. Ciò è dovuto alla maggiore interazione fra le frazioni lipidiche nel pro-farmaco e il nucleo lipidico di micelle DSPE-PEG. Ingegnerizzazione del compatibilità di molecole carrier con farmaci per migliorare la loro interazione è una strategia promettente per migliorare le prestazioni delle micelle e altri nanovettori. Questo approccio può migliorare carico di droga e ridurre al minimo il rilascio del farmaco pre-maturo per questi nanovettori. 23 La scelta di una coppia di droga / polimero appropriato è un passo fondamentale nella progettazione di formulazione micelle. La struttura delle molecole di farmaco può essere modificato (approccio pro-farmaco) o la progettazione di materiali di supporto possono essere ottimizzate per migliorare la compatibilità e per migliorare interazioni farmaco / veicolo. 23 24 Inoltre, la modellazione computazionale può essere un utile strumento per aiutare nell&#39;ottimizzazione di nanovettori e permettono di preparare un nanocarrier progettati su misura per specifici un farmaco specifico. In sintesi, si descrive qui un metodo per sintetizzare un lipofila pro-farmaco di doxorubicina. Protocolli per la preparazione e caratterizzazione di droga caricata micelle sono anche described. Il metodo film dispersione è un metodo semplice e promettente per preparare una varietà di sistemi di auto-assemblaggio nanoscala. I metodi di caratterizzazione qui descritti possono essere usati come standard in vitro per determinare le proprietà di nanomedicine, quindi può facilitare l&#39;ottimizzazione dei processi di formulazione e sviluppo prodotto.

La chemioterapia è comunemente usato per trattare varie forme di cancro. La maggior parte, se non tutti, i farmaci chemioterapici hanno effetti collaterali tossici che possono variare da condizioni minori gestibili, come nausea e diarrea, a condizioni che minacciano la vita più. Poiché la maggior parte farmaci antitumorali sono tossici, l&#39;esposizione non selettivo di questi farmaci al tessuto normale provoca inevitabilmente la tossicità. Pertanto, vi è una grande necessità di un approccio terapeutico che può trasportare selettivamente farmaci nelle cellule tumorali. Un&#39;altra sfida con la somministrazione di farmaci antitumorali è la loro scarsa solubilità in acqua. Di solito, sono necessari agenti solubilizzanti per formulare questi farmaci scarsamente solubili. Tuttavia, la maggior parte agenti solubilizzanti, come dimetil solfossido (DMSO), Cremophor EL, e polisorbato 80 (Tween 80) possono causare tossicità epatica e renale, emolisi, reazioni di ipersensibilità acuta e neuropatie periferiche. 1 Perciò, formulazioni sicure e biocompatibili sono necessari per l&#39;uso clinico di poverifarmaci antitumorali mente solubili. Nanovettori sono promettenti sistemi di drug delivery per affrontare le sfide di cui sopra. Questi nanovettori includono liposomi, nanoparticelle 2, 3 micelle, 4-7 coniugati polimero-farmaco, 8 e materiali inorganici. 9 Diversi prodotti nanomedicina (ad esempio, Doxil, Abraxane, e Genexol) sono stati approvati dalle agenzie di regolamentazione per il trattamento di pazienti affetti da cancro. 10 Micelle polimeriche sono promettenti vettori di consegna di droga nano-scala, che sono stati utilizzati con successo per la consegna dei farmaci antitumorali. 4-7,11,12 tipici micelle polimeriche sono preparati da polimeri anfifilici attraverso un processo di auto-assemblaggio. Il core-shell strutturati micelle polimeriche includono un guscio idrofilo e un nucleo idrofobico. Il guscio idrofilo può stabilizzare stericamente micelle e prolungare la loro circolazione nel flusso sanguigno. Il nucleo idrofobico può incapsulare in modo efficace idrofoba dtappeti. A causa delle piccole dimensioni delle micelle (tipicamente inferiori a 200 nm) e proprietà di lunga circolazione, micelle polimeriche sono creduti per conseguire targeting tumorale attraverso una maggiore permeabilità ed effetti di ritenzione (EPR) (tumore passiva targeting). la stabilità della droga di carico è fondamentale per il tumore mira capacità di micelle. Per ottenere il targeting tumorale ottimale, micelle dovrebbero avere perdite di droga minimo prima di raggiungere il sito del tumore, ma rilasciare rapidamente il farmaco dopo aver inserito le cellule tumorali. Inoltre, la stabilità formulazione è anche un requisito essenziale per lo sviluppo dei prodotti, perché la stabilità formulazione determina la fattibilità di sviluppo del prodotto, così come la shelf-life di prodotti sviluppati. Recentemente, sono stati fatti molti sforzi per migliorare il carico di droga in vettori di consegna. Il lipofila approccio pro-farmaco è una strategia che è stata esplorata per migliorare carico di droga in nanoparticelle lipidiche ed emulsioni. 13,14 La conjugation dei lipidi con farmaci in grado di migliorare significativamente la loro lipofilia e migliorare il carico e la conservazione delle componenti lipofile di nanovettori. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco micelle caricati. In primo luogo, la procedura di sintesi per doxorubicina lipofila pro-farmaco è descritta. Poi, viene introdotto un protocollo per la generazione di micelle con un metodo film dispersione. Questo metodo è stato utilizzato con successo nei nostri studi precedenti. 5 DSPE-PEG è stato scelto come materiale di supporto per la preparazione di micelle perché è stato usato con successo per la consegna micelle farmaco. 15,16 Infine, si descrivono diversi saggi in vitro utilizzati per caratterizzare micelle formulazioni e per valutare l&#39;attività antitumorale.

<table><tbody><tr><td>DSPE-PEG2K</td><td>Cordenpharm</td><td>LP-R4-039</td><td>&gt;95%</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>LC Laboratories</td><td>D-4000</td><td>&gt;99%</td></tr><tr><td>Palmitic Acid Hydrazide</td><td>TCI AMERICA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P000425G</td><td>&gt;98.0%</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ACROS Organics</td><td>610981000</td><td>Anhydrous</td></tr><tr><td>Methylene chloride&amp;nbsp;</td><td>FISHER&amp;nbsp;</td><td>D151-4</td><td>99.90%</td></tr><tr><td>Methyl sulfoxide-d&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>ACROS Organics</td><td>AC320760075</td><td>NMR solvent</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic Acid&amp;nbsp;</td><td>ACROS Organics</td><td>AC293811000</td><td>99.50%</td></tr><tr><td>Silica Gel</td><td>FISHER&amp;nbsp;</td><td>L-7446</td><td>230-400 mesh</td></tr><tr><td>Baker Flex TLC Plates</td><td>FISHER&amp;nbsp;</td><td>NC9990129</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DU 145&amp;nbsp; Prostate Cancer Cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>ACROS Organics</td><td>158990050</td><td>98%</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>MEDIATECH INC&amp;nbsp;</td><td>10041CV</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECHNOLOGIES&amp;nbsp;</td><td>15240062</td><td>100x stock solution</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>LIFE TECHNOLOGIES&amp;nbsp;</td><td>10437077</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy</td><td>Varian, Inc</td><td></td><td>300 NMR&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi R-3 Rotavapor</td><td>Buchi</td><td>1103022V1&amp;nbsp;</td><td>Rotary evaporator</td></tr><tr><td>Ultrasonic Bath</td><td>BRANSON ULTRASONICS CORPORATION&amp;nbsp;</td><td>CPX952318R</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS spectrometer Biomate 3</td><td>Thermo Spectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS90&amp;nbsp;</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>Particle Size Analyer</td></tr><tr><td>Microplate Spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Rio-Rad</td><td>Benchmark Plus&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator</td><td>Napco</td><td>CO2 6000</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot&amp;nbsp;</td><td>Systat Software, Inc.</td><td></td><td>Analytical Software</td></tr><tr><td>96-Well Cell Culture Plate</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp; 0.25%</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and characterization of lipophilic doxorubicin pro-drug micelles

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

La Figura 1 mostra lo schema di sintesi di DOX-PA. DOX-PA è stato sintetizzato dalla coniugazione di acido palmitico con doxorubicina attraverso un legame idrazone sensibile al pH. Un leggero eccesso di idrazide dell&#39;acido palmitico è stato utilizzato per agevolare il completamento della reazione. Questo metodo di reazione ha un rendimento molto elevato e solo una piccola quantità di doxorubicina rimasto dopo una reazione 18 ore (Figura 2). La resa è di circa 88%. Al termine della reazione, DOX-PA è stato purificato usando una colonna di gel di silice ed essiccato per ottenere un prodotto solido rosso puro. DOX-PA è stato analizzato con TLC, che ha mostrato un posto unico per purificata DOX-PA (Figura 2). La Figura 3 mostra lo spettro 1 H-NMR di DOX-PA. sono stati osservati caratteristici picchi NMR sia da doxorubicina e acido palmitico, che ulteriormente confermato successo della reazione di coniugazione. Figura 4. bianco micelle DSPE-PEG senza farmaco appaiono come un liquido trasparente. micelle DOX-PA DSPE-PEG appaiono come un liquido rosso; il colore rosso è dovuto alla DOX-PA è caricata in micelle. Risultati rappresentativi di analisi granulometrica sono mostrati in figura 5. La dimensione delle particelle media Z-media per il Bianco micelle DSPE-PEG era 17,0 ± 0,5 nm (PDI = 0,034 ± 0,019). Il caricamento di DOX-PA è leggermente aumentata la dimensione delle particelle micelle; la dimensione delle particelle media Z-media per micelle DOX-PA DSPE-PEG era 25.7 ± 1.6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035). La concentrazione DOX-PA nella formulazione micelle stato determinato sulla base dell&#39;assorbimento a 490 nm. DSPE-PEG ha assorbimento trascurabile a questa lunghezza d&#39;onda, pertanto non interferisce nell&#39;analisi della concentrazione DOX-PA. La concentrazione DOX-PA nella formulazione micelle era1,99 ± 0,11 mg / ml e l&#39;efficienza della droga carico era 99,3 ± 5,7%. L&#39;alta efficienza di incapsulamento è dovuta alla caratteristica lipofilica DOX-PA, che migliora il suo mantenimento nel core idrofobico di micelle. La formulazione ha mostrato un&#39;eccellente stabilità. Non c&#39;era senza precipitazione visibile se conservato a - 4 ° C per 3 settimane. è stato osservato alcun cambiamento significativo nella concentrazione del farmaco durante la conservazione. cellule tumorali della prostata umana DU-145 sono stati trattati con diverse concentrazioni di doxorubicina libera, libera DOX-PA, e micelle DOX-PA DSPE-PEG. La vitalità cellulare è stata determinata alla fine di un trattamento 72 ore utilizzando un saggio MTT (Figura 6). Una riduzione della concentrazione-dipendente della vitalità cellulare è stata ottenuta trattando le cellule DU145 con doxorubicina (IC50 = 0,10 micron), la connessione DOX-PA (IC50 = 0,33 micron), o micelle DOX-PA (IC50 = 0,25 micron). Anche se doxorubicina libero è<html> più efficace della libera DOX-PA o micelle DOX-Pa a concentrazioni più basse (0,1 micrometri e 0,5 micron), gruppi DOX-PA hanno mostrato una maggiore riduzione della vitalità delle cellule di doxorubicina libera a concentrazioni più elevate (2-10 micron). Inoltre, ci sembrava essere alcuna differenza significativa tra DOX-PA e micelle DOX-PA ad entrambe le concentrazioni superiori e inferiori. Vuote micelle DSPE-PEG non hanno mostrato alcuna tossicità (dati non riportati), indicando una buona biocompatibilità e la sicurezza di DSPE-PEG come materiale di supporto consegna della droga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54338/54338fig1.jpg" /> Figura 1. Sintesi di lipofila pro-farmaco di doxorubicina (DOX-PA) Reagenti e condizioni:. Doxorubicina (DOX), idrazide acido palmitico (PA) e acido trifluoroacetico (TFA) disciolto in metanolo sono stati agitata per 18 ore a temperatura ambiente in buio.<html> t = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54338/54338fig2.jpg" /> Figura 2. Cromatografia su strato sottile (TLC). TLC di (1) doxorubicina, (2) miscela di reazione grezza, (3) idrazide dell&#39;acido palmitico, e (4) DOX-PA coniugato. I campioni sono stati sviluppati con una miscela di diclorometano e metanolo (3/1, v / v) e colorati con lo iodio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54338/54338fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54338/54338fig3.jpg" /> Figura 3. 1 H-NMR di DOX-PA in deuterato DMSO. La presenza di picchi caratteristici sia DOX e PA dimostra il successo della reazione di coniugazione.: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54338/54338fig4.jpg" /> Figura 4. Aspetto di micelle. (A) micelle DSPE-PEG e (B) micelle DOX-PA DSPE-PEG. Figure rappresentative vengono presentate per dimostrare l&#39;aspetto del vuoto micelle DSPE-PEG e micelle DOX-PA DSPE-PEG. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54338/54338fig4large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54338/54338fig5.jpg" /> Figura 5. Dimensione delle particelle e distribuzione dimensionale delle micelle. (A) micelle DSPE-PEG e (B) DOX<html> micelle -PA DSPE-PEG. Le dimensioni delle micelle è determinata dalla dispersione della luce dinamica. dati rappresentativi sono presentati per dimostrare dimensioni delle particelle e distribuzione dimensionale. I dati presentati sono SD ± Media (n = 3). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54338/54338fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54338/54338fig6.jpg" /> Figura 6. attività antitumorale di formulazioni micelle. Le cellule DU145 sono stati trattati per 72 ore e la vitalità cellulare è stata misurata usando il saggio MTT. I dati presentati in figura sono media ± DS (n = 4). *, P &lt;0,01, rispetto a DOX trattata gruppi. Non vi è alcuna differenza statistica tra DOX-PA e micelle DOX-PA gruppi trattati. IC 50 è stato calcolato sulla base di vitalità cellulare contro dati di concentrazione di droga.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54338/54338table1.jpg" /> Tabella 1. CH 2 Cl 2 / CH 3 OH eluendo solventi impiegati nella purificazione di DOX-PA.

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Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Un protocollo per la preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco caricata 1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietilene glicole) -2000] (DSPE-PEG) micelle è descritto.

Preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina micelle pro-farmaco

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  Hampton University.  Un protocollo per la preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco caricata 1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietilene glicole) -2000] (DSPE-PEG) micelle è descritto. 

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A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Un approccio Facile ed efficiente per la produzione di micelle reversibile Disulfide Croce-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Ricerca

Biochimica

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its therapeutic benefit. Nanoparticle-based drug combination has been shown to mitigate the problems encountered by free drug combination therapy. Our previous studies have shown that the combination of two anticancer drugs, doxorubicin (DOX) and mitomycin C (MMC), produced a synergistic effect against both murine and human breast cancer cells in vitro. DOX and MMC co-loaded polymer-lipid hybrid nanoparticles (DMPLN) bypassed various efflux transporter pumps that confer multidrug resistance and demonstrated enhanced efficacy in breast tumor models. Compared to conventional solution forms, such superior efficacy of DMPLN was attributed to the synchronized pharmacokinetics of DOX and MMC and increased intracellular drug bioavailability within tumor cells enabled by the nanocarrier PLN. 
To evaluate the pharmacokinetics and bio-distribution of co-administered DOX and MMC in both free solution and nanoparticle forms, a simple and efficient multi-drug analysis method using reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. In contrast to previously reported methods that analyzed DOX or MMC individually in the plasma, this new HPLC method is able to simultaneously quantitate DOX, MMC and a major cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in various biological matrices (e.g., whole blood, breast tumor, and heart). A dual fluorescent and ultraviolet absorbent probe 4-methylumbelliferone (4-MU) was used as an internal standard (I.S.) for one-step detection of multiple drug analysis with different detection wavelengths. This method was successfully applied to determine the concentrations of DOX and MMC delivered by both nanoparticle and solution approaches in whole blood and various tissues in an orthotopic breast tumor murine model. The analytical method presented is a useful tool for pre-clinical analysis of nanoparticle-based delivery of drug combinations.

This protocol describes an efficient and convenient analytical process of sample extraction and simultaneous determination of multiple drugs, doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) and a cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in the biological samples from a preclinical breast tumor model treated with nanoparticle formulations of synergistic drug combination.

Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Ricerca sul cancro

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar concentration forming hydrophobic cores surrounded by hydrophilic shells in aqueous environments. The core of these micelles can be utilized to load hydrophobic, poorly water soluble drugs like docetaxel (DTX) and everolimus (EVR). Systematic characterization of the micelle structure and drug loading capabilities are important before in vitro and in vivo studies can be conducted. The goal of the protocol described herein is to provide the necessary characterization steps to achieve standardized micellar products. DTX and EVR have intrinsic solubilities of 1.9 and 9.6 &#181;g/ml respectively Preparation of these micelles can be achieved through solvent casting which increases the aqueous solubility of DTX and EVR to 1.86 and 1.85 mg/ml, respectively. Drug stability in micelles evaluated at room temperature over 48 hr indicates that 97% or more of the drugs are retained in solution. Micelle size was assessed using dynamic light scattering and indicated that the size of these micelles was below 50 nm and depended on the molecular weight of the polymer. Drug release from the micelles was assessed using dialysis under sink conditions at pH 7.4 at 37 oC over 48 hr. Curve fitting results indicate that drug release is driven by a first order process indicating that it is diffusion driven.

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

Preparazione e caratterizzazione di individuale e Multi-droga Loaded Fisicamente intrappolate polimerici Micelle

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Chimica

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Preparazione facile di Internamente auto-assemblato Lipid particelle stabilizzati da nanotubi di carbonio

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl glycidyl ether (PheGE) on methoxy-polyethylene glycol (mPEG-b-PPheGE). Characterization of the copolymer revealed a narrow molecular distribution (PDI &#60; 1.03) and confirmed the degree of polymerization of mPEG122-b-(PheGE)15. The critical micelle concentration of the copolymer was evaluated using an established fluorescence method with the aggregation behavior evaluated by dynamic light scattering and transmission electronic microscopy. The potential of the copolymer for use in drug delivery applications was evaluated in a preliminary manner including in vitro biocompatibility, loading and release of the hydrophobic anti-cancer drug doxorubicin (DOX). A stable micelle formulation of DOX was prepared with drug loading levels up to 14% (wt%), drug loading efficiencies &#62; 60% (w/w) and sustained release of drug over 4 days under physiologically relevant conditions (acidic and neutral pH, presence of albumin). The high drug loading level and sustained release is attributed to stabilizing &#960;-&#960; interactions between DOX and the core-forming block of the micelles.

The key steps of living anionic polymerization of phenyl glycidyl ether (PheGE) on methoxy-polyethylene glycol (mPEG-b-PPheGE) are described. The resulting block copolymer micelles (BCMs) were loaded with doxorubicin 14% (wt%) and sustained release of drug over 4 days under physiologically relevant conditions was obtained.

Anionico polimerizzazione di un copolimero Amphiphilic per la preparazione di copolimero a blocchi micelle stabilizzata da π-¸ Interazioni Stacking

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Sintesi di Nanoparticelle d'oro modificate Aptamer-PEI-g-PEG Caricate con doxorubicina per la consegna mirata di farmaci

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Phase Change Dimethyldioctadecylammonium-Shelled Microdroplets as a Promising Drug Delivery System: Results on 3D Spheroids of Mammalian Tumor Cells

Significant improvement of phase-change perfluorocarbon microdroplets (MDs) in the vast theranostic scenario passes through the optimization of the MDs composition with respect to synthesis efficiency, stability, and drug delivery capability. To this aim, decafluoropentane (DFP) MDs stabilized by a shell of dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) cationic surfactant were designed. A high concentration of DDAB-MDs was readily obtained within a few seconds by pulsed high-power insonation, resulting in low polydisperse 1 &#181;m size droplets. Highly positive &#950;-potential, together with a long, saturated hydrocarbon chains of the DDAB shell, are key factors to stabilize the droplet and the drug cargo therein. The high affinity of the DDAB shell with cell plasma membrane allows for localized chemotherapeutics delivery by increasing the drug concentration at the tumor cell interface and boosting the uptake. This would turn DDAB-MDs into a relevant drug delivery tool exhibiting high antitumor activity at very low drug doses.
In this work, the efficacy of such an approach is shown to dramatically improve the effect of doxorubicin against 3D spheroids of mammalian tumor cells, MDA-MB-231. The use of&#160;three-dimensional (3D) cell cultures developed in the form of multicellular tumor spheroids (i.e., densely packed cells in a spherical shape) has numerous advantages compared to 2D cell cultures: in addition to have the potential to bridge the gap between conventional in vitro studies and animal testing, it will improve the ability to perform more predictive in vitro screening assays for preclinical drug development or evaluate the potential of off-label drugs and new co-targeting strategies.

Decafluoropentane microdroplets developed with a shell of dimethyldioctadecylammonium bromide exhibited an exceptional colloidal stability and an actractive biointerface. DDAB-MDs proved to be efficient drug reservoirs characterized by a high affinity to plasma membranes together with enhanced uptake and antitumor activity of Doxorubicin against human triple-negative breast cancer (MDA-MB-231) 3D model.

Significant improvement of phase-change perfluorocarbon microdroplets (MDs) in the vast theranostic scenario passes through the optimization of the MDs ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Bioingegneria

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Preparazione e caratterizzazione dei nanoliposomi per l'entratura delle proteine globulari bioattive

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

Produzione microfluidica di liposomi sensibili alla temperatura contengono lysolipid

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...