L'autore ringrazia Susan Whitfield per la preparazione delle figure e Camille Martin e Hillary Samagaio per assistenza con alcuni esperimenti.

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens.">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+Rhizobiaceae+to+plant+cells.">Attachment of Rhizobiaceae to plant cells.</a> The Rhizobiaceae. , 235-249 (1998).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+promotes+the+attachment+of+Agrobacterium+tumefaciens.strain+NT1+to+carrot+cells.">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li><li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots.">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li><li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts.">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel,+attB,+attD,+and+attR+mutants.">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li><li>Morton, E. 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L'autore dichiara che non ha nessun concorrenti interessi finanziari.

È importante essere consapevoli di tutte le superfici a cui i batteri possono aderire durante l'esperimento. Così i batteri che sono in grado di legarsi al vetro possono essere sottovalutati se i conteggi delle cellule vitali sono fatte utilizzando provette e pipette. Se le piante sono cresciute in agar o terreno e alcuni dell'agar o terreno rimane sulle piante i batteri possono associare il materiale aderente anziché alle piante. D'altra parte, lavare la superficie della pianta, specialmente nel caso di radici, può rimuovere rivestimenti di superficie naturali come mucose e quindi alterare i risultati delle prove di aderenza.
È importante essere certi che i batteri aggiunti alla miscela di incubazione rimangono vivi durante l'esperimento. Così i conteggi delle cellule vitali dei batteri liberi così come allegati ordinariamente dovrebbero essere fatta. Alcuni trattamenti o mutazioni batteriche possono ridurre il tasso di crescita batterica o effettivamente causare la morte di una frazione della popolazione batterica. Batteri vivi e morti non siano distinguibili nel microscopio a meno che non vengono utilizzati coloranti speciali. C'è un kit di macchia utile per live/dead batteri che dipende l'esclusione di coloranti dai batteri viventi. Tuttavia, se una popolazione mista di specie batteriche è presente quindi i conteggi delle cellule vitali delle specie di interesse rischia di essere il metodo più semplice per determinare se l'incubazione ha provocato la morte batterica.
Composizione media influenzerà la crescita e la sopravvivenza batterica. Radice dell'essudato e materiali rilasciato dalla ferita e tagliare siti fornirà il substrato per supportare la modesta crescita batterica. Fosfato, azoto e ferro tendono ad essere limitante in queste condizioni. Cationi bivalenti come calcio e magnesio possono influenzare l'adesione. In alcuni casi fonte di carbonio possa influenzare adesione. pH è anche importante. In generale il pH della rizosfera è tra 5.5 e 6.5.
È necessario prestare attenzione nell'utilizzo di batteri contrassegnati con resistenza agli antibiotico. Gli antibiotici più spesso utilizzati sono la rifampicina e acido nalidixico. Resistenza a questi antibiotici è in genere dovuta a mutazioni in geni cromosomici (RNA polimerasi e girasi, rispettivamente) e pertanto non possono essere facilmente trasferiti ad un altro ceppo durante l'incubazione. Questo tipo di resistenza anche non provocare la degradazione o la modifica dell'antibiotico. Marcatura di batteri con un plasmide-sopportate gene marcatore non è raccomandato a meno che il plasmide non può essere trasferito a qualsiasi altri batteri. La resistenza agli antibiotici non deve essere dovuto modifica degradazione o chimica dell'antibiotico come antibiotici batteri sensibili sarà quindi in grado di crescere su piastre antibiotici se essi si trovano vicino i batteri resistenti.
I metodi descritti in questa carta sono utili per campioni di piccole dimensioni e/o esperimenti dove i campioni devono essere contenuti (per esempio, esperimenti che coinvolgono agenti patogeni umani). Per campioni di grandi dimensioni (superiori a 100 g di materiale o di più di 50 piante) altri metodi o drastica modificazione di questi metodi sarebbero necessari10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. la presenza di un gran numero di microrganismi diversi le specie oggetto di studio può anche porre problemi significativi. Possibili soluzioni includono l'uso di batteri contrassegnato con una proteina fluorescente o la resistenza agli Antibiotico, come descritto nei passaggi 6.1.2 e 7.3. Tuttavia, quando i batteri di interesse sono rari individui in una grande popolazione di altri microrganismi questi indicatori non siano sufficienti per consentire una valutazione univoca dei numeri dei batteri in fase di studio.
Tutti i metodi descritti qui sono metodi di laboratorio di base. Modifiche minori sarebbero necessari per gli studi di serra. Altre importanti modifiche sono suscettibili di essere necessario per gli studi sul campo dove protozoi, insetti e altri animali predazione e clima variazione complicare la fornitura di condizioni definite per gli esperimenti. In futuro questi metodi possono essere estesa per includere le interazioni di due o più microrganismi sulla superficie della pianta.

La misura di associazione batterica per piantare le superfici è diventato importante in tre situazioni disparate. La prima situazione è l'esame della trasmissione di agenti patogeni umani su pianta superfici1,2,3. L'obiettivo è di impedire l'associazione batterica o di rimuovere o uccidere i batteri associati e quindi a ridurre la trasmissione della malattia da materiale vegetale. La seconda situazione è l'esame dell'associazione degli agenti patogeni della pianta per pianta superfici4. Ancora una volta l'obiettivo è di impedire l'associazione o di rimuovere o uccidere i batteri associati e quindi per ridurre la malattia. La terza situazione è l'esame dell'associazione di batteri simbiotici o pianta-growth-promoting5,6. L'obiettivo è quello di promuovere batterica vincolante e quindi di aumento di salute delle piante e delle colture produce.
Le tecniche per la misurazione associazione batterica per piantare le superfici descritte in questo articolo sono poco costoso e relativamente facile da realizzare. Gli unici requisiti sono un microscopio e materiali trovati generalmente in un laboratorio di batteriologia. Per alcune tecniche un sonicatore vasca è utile. Le tecniche descritte sono progettate per l'associazione di esperimenti condotti utilizzando campioni di relativamente piccole dimensioni. Misure di associazione sono effettuate in laboratorio, anche se potrebbe essere possibile modificare alcune di queste tecniche per l'utilizzo in serra o in campo.
Queste tecniche sono state usate per misurare l'associazione batterica a radici, germogli, foglie di taglio, taglio frutta e pomodorini intatti nel laboratorio7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Essi sono stati utilizzati anche per misurare la colonizzazione della radice delle piante che crescono nel terreno o sabbia nel laboratorio16. Le tecniche sono state utilizzate con molte specie batteriche come Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas fluorescens. Un'utile descrizione dei metodi per valutare l'interazione di a. tumefaciens con superfici può essere trovata in Morton e Fuqua (2012)17. In tutti i casi le dimensioni del campione coinvolte erano piccole, generalmente meno di 25-50 piante. Le tecniche descritte sono adatte per l'utilizzo con agenti patogeni umani che hanno bisogno di essere tenuto confinato durante gli esperimenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:731px;" width="731">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:143px;">light microscope</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">seeds</td>
			<td style="width:164px;">any&#160;</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">make a note of the seed lot number and the cultivar</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">bleach</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">bath sonicator</td>
			<td style="width:164px;">any scientific supply company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">T9284</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">nutrient agar&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Difco&#160;</td>
			<td style="width:125px;">001-01-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">soytone</td>
			<td style="width:164px;">Difco&#160;</td>
			<td style="width:125px;">24360</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Sand</td>
			<td style="width:164px;">sea sand Fisher Scientific</td>
			<td style="width:125px;">S25</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">sand</td>
			<td style="width:164px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S9887</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">conetainers</td>
			<td style="width:164px;">Stuewe &#38; Sons, Inc.</td>
			<td style="width:125px;">Ray-Leach cone-tainers</td>
			<td style="width:299px;">many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">parafilm</td>
			<td style="width:164px;">any scientific supply company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">MS salts</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">M5524</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">parrafin</td>
			<td style="width:164px;">any</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">centrigfuge</td>
			<td style="width:164px;">any scientific company</td>
			<td style="width:125px;">N/A</td>
			<td style="width:299px;">to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:164px;">any scientific company</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">micrometer</td>
			<td style="width:164px;">ACCU-SCOPE Accessories</td>
			<td style="width:125px;">A3145</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Sedgwick-rafter counting cell</td>
			<td style="width:164px;">Hauser Scientific</td>
			<td style="width:125px;">HS3800</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">probe-clip press-seal incubatin chamber</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">Z359483</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">rifampicin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">R3501</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">naladixic acid</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">n8878</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:143px;">Live/dead stain</td>
			<td style="width:164px;">In Vitrogen Molecular Bioprobes</td>
			<td style="width:125px;">L7007</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

Questo manoscritto descrive un metodo per misurare l'associazione batterica alle superfici axeniche pianta al microscopio ottico e attraverso l'utilizzo di conteggi delle cellule vitali. Materiali vegetali utilizzati includono radici, germogli, foglie e tagliare la frutta. I metodi descritti sono poco costoso, facile e adatto per campioni di piccole dimensioni. Il legame è misurato in laboratorio e una varietà di media di incubazione e condizioni può essere utilizzata. L'effetto degli inibitori può essere determinato. Possono essere valutati anche situazioni che promuovono e inibiscono il grippaggio. In alcuni casi è possibile distinguere se varie condizioni alterano associazione principalmente dovuto i loro effetti sulla pianta o sui batteri.

A. tumefaciens colonizza superfici radicolari. Al fine di determinare se la produzione batterica di cellulosa svolge un ruolo nella colonizzazione della radice, gli effetti delle mutazioni batteriche che impediscono la sintesi di cellulosa sono stati esaminati16. Le tecniche descritte nei passaggi 1.3 e 7.1 sono state usate. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua sterile. Quando le radici erano lunghi circa 2 cm erano immersi in una sospensione di 105 batteri / mL e piantati nel terreno pastorizzato in contenitori. Le piante sono state coltivate per 14 giorni a 25 ° C su un ciclo di 12 h luce/12 h scuro. Dopo l'indicato volte le piante sono stati rimossi dai contenitori. Le radici sono state lavate e sonicate in un sonicatore vasca per rimuovere i batteri associati. Numeri batterici sono stati determinati utilizzando i conteggi delle cellule vitali. La figura 2 Mostra l'effetto di due mutazioni differenti di cellulosa-meno la capacità dei batteri di colonizzare le radici di pomodoro. Anche se le deviazioni standard di alcune misurazioni erano alti come 0,9 log10 (un problema comune con questo tipo di misura) la riduzione nell'associazione dei mutanti cellulosa-meno è chiaramente evidente e possiamo concludere che la produzione batterica di cellulosa aiuta i batteri nella colonizzazione delle radici di pomodoro.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figura 2 : Root colonizzazione da wild-type e mutanti di cellulosa-meno di a. tumefaciens. Numero totale di log10 dei batteri per cm lunghezza della radice ha recuperato dalle radici di pomodoro inoculati con wild-type a. tumefaciens strain C58 e mutanti di cellulosa-meno C58:1 e C58:A60. I numeri indicati sono il mezzo da un minimo di quattro esperimenti separati. Le barre indicano le deviazioni standard dei mezzi. Le radici sono state inoculate immergendoli in una sospensione di 105 batteri / mL per un minuto. Le piante sono state coltivate in contenitori e i batteri senza bloccare aderenti sono stati rimossi lavando le radici in buffer in un flaconcino di vetro di lavaggio. Strettamente aderenti batteri sono stati rimossi usando un sonicatore vasca e la sospensione risultante placcato per determinare cellule vitali conta16. Questa figura è stata modificata da Matthysse e McMahan. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il ruolo di esopolisaccaridi nell'associazione di e. coli e altri batteri di germogli di erba medica è stato esaminato. Alcuni focolai di malattia diarroica dovuto Escherichia coli O157: H7 sono stati rintracciati a germogli contaminati. Associazione dei batteri wild type e mutanti in grado di fare vari esopolisaccaridi è stata misurata utilizzando i metodi descritti ai punti 1.1, 5.1 e 7.2. Germogli di erba medica sono stati superficie sterilizzato e germinato per un giorno in acqua sterile a 25 ° C al buio. Quattro germogli con annesso tegumenti sono stati collocati in piatti di plastica sterili contenente 5 mL di acqua. I batteri cresciuti in brodo di Luria sono stati aggiunti a una concentrazione finale di circa 5 x 103 millilitri. I germogli inoculati sono stati incubati a 25 ° C al buio per 3 giorni. I germogli sono stati lavati due volte in 5 mL di acqua sterile in un flaconcino di vigorosa inversione e omogeneizzati in buffer utilizzando un omogeneizzatore di vetro Teflon a motore di lavaggio. Precedenti esperimenti utilizzando batteri contrassegnato con un plasmide che trasporta il gene GFP ha mostrato nessun batteri interiorizzato anche batteri dalla superficie facilmente sono stati osservati. I risultati sono mostrati nella tabella 1. Sono stati esaminati due ceppi di e. coli O157: H7. In entrambe le razze la produzione di acid(PGA) Poli-β-1,6-glucuronico è apparso per rendere il più grande contributo all'associazione di patogeni di Escherichia coli per piantare le superfici. Acido colico ha anche svolto un ruolo significativo nell'associazione. Mentre la riduzione nell'associazione in cellulosa-minus mutanti era significativa non era grande come quella per gli altri due polisaccaridi.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Effetti delle mutazioni nei geni di produzione di esopolisaccaridi sull'associazione di E. coli O157: H7 per germogli e aperti tegumenti</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ceppo batterico</td>
			<td rowspan="2">Mutazione o genotipo (fenotipo pertinente)</td>
			<td colspan="2">10 numero di batteri associati al germoglio o tegumento log</td>
		</tr>
<tr>
<td>Germogli di erba medicab
</td>
			<td>Aperti tegumenti</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Nessuno (wild type)</td>
			<td>4,7 ± 0.6</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (cellulosa-minus)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (meno acido colico)</td>
			<td>1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
pgaC (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Nessuno (wild type)</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
			<td>6,1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (cellulosa-minus)</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4,1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (meno acido colico)</td>
			<td>3,9 ± 0.5c
</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">media ± deviazione standard di un minimo di tre misure del numero (registro10) di batteri associati dopo 3 giorni.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Germogli di b sono stati lavati prima misurazione.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativamente differenti dal wild type: P < 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativamente differenti dal wild type: P < 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: effetti delle mutazioni nei geni di produzione di esopolisaccaridi sul legame di Escherichia coli O157: H7 per germogli. Al fine di determinare il ruolo delle varie esopolisaccaridi e lipopolisaccaride nell'associazione di patogeni Escherichia coli O157: H7 ceppi di germogli di erba medica, l'associazione di un insieme di mutanti per i germogli e aperti tegumenti è stato esaminato usando i metodi descritto nel passaggio 6. I risultati hanno mostrato che poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) sembra essere essenziale per l'associazione di germogli e che l'acido sia cellulosa e colanic sono necessari per legame massimo di e. coli O157. Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
Al fine di determinare se la produzione di PGA è sufficiente per causare associazione batterica piantare le superfici, un plasmide (pMM11) che trasportano l'operone clonato codifica i geni richiesti per PGA produzione è stato introdotto in due diversi tipi di batteri che non normalmente essere in grado di legarsi al pomodoro radici10. A. tumefaciens A1045 è un mutante del ceppo selvaggio tipo C58 che non riesce a rendere ciclico-β-1,2 glucano e inoltre non riesce ad associare a piantare superfici29. Sinorhizobium meliloti 1021 che forma noduli radice su erba medica non riesce ad associare ai non-legumi tra cui pomodoro12. Le tecniche descritte nei passaggi 1.1, 5.1, 6.3 e 7.1 sono state utilizzate per determinare se la capacità di fare PGA generalmente aumentato associazione batterica a superfici radicolari. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua sterile. Le radici sono state tagliate in segmenti di 1 cm di lunghezza e disposto in acqua sterile e i batteri sono stati inoculati. Come queste due specie di batteri crescono a ritmi diversi, associazione è stata misurata in momenti diversi per consentire all'incirca uguali quantità di crescita batterica. La presenza del plasmide pMM11 causato un simile aumento significativo del numero di batteri associati di entrambi di specie (tabella 2)10. Un aumento significativo nell'associazione è stato anche visto al microscopio ottico, ma l'associazione è stata molto diversa per le due specie (Figura 3). A. tumefaciens A1045 associato come singoli batteri per la superficie della radice. S. meliloti rilegato in cluster di grandi dimensioni in cui solo alcuni dei batteri fossero collegati direttamente alla radice e la maggior parte dei batteri sono stata fissata ad altri batteri. Questo esempio mostra che semplicemente analizzando il numero di batteri associati senza includere le osservazioni al microscopio può dare un'impressione ingannevole dei risultati di un esperimento. Sebbene entrambi i metodi (conta delle cellule vitali e osservazioni al microscopio) mostrano che pMM11 aumentato associazione batterica alle radici di pomodoro, il tipo di associazione causato dalla produzione di PGA era differente per le due specie batteriche10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">L'effetto del plasmide pMM11 sui Binding dei batteri alle radici di pomodoro</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ceppo batterico</td>
			<td>Plasmide</td>
			<td>Numero di batteri associata a lunghezza della radice mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045un
</td>
			<td>nessuno</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vettore)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (sintesi di PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>nessuno</td>
			<td>nessuno rilevato</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vettore)</td>
			<td>nessuno rilevato</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (sintesi di PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">un'associazione batterica è stata misurata dopo 2 ore</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b Associazione batterica era misura dopo 18 ore</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: l'effetto di un plasmide portatori di geni per la sintesi di PGA sul legame di A. tumefaciens A1045 e S. meliloti 1021 a segmenti di radice di pomodoro. Al fine di esaminare la possibilità di poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) per promuovere l'associazione di batteri per piantare radici, l'effetto di un plasmide che attribuisce la capacità di fare PGA (pMM11) l'associazione di due ceppi di batteri pianta-collegato a radici di pomodoro è stato esaminato. Nessun ceppo di batteri ha mostrato significativa associazione alle radici di pomodoro in assenza del plasmide o in presenza del plasmide senza i geni che codificano la sintesi di PGA (pBBR1mcs). L'aggiunta del plasmide portatori di geni di sintesi PGA aumentato associazione di entrambi i tipi di batteri. Perché a. tumefaciens cresce più velocemente di quanto S. meliloti associazione è stata misurata dopo 2 h di incubazione per a. tumefaciens e dopo 18 h per S. meliloti. Le tecniche utilizzate sono quelle descritte nel passaggio 7. Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figura 3 : L'effetto del pMM11 di plasmidi che trasportano i geni di biosintesi di PGA sul legame di a. tumefaciens A1045 e S. meliloti 1021 di peli radicali pomodoro. Associazione di pomodoro di peli radicali della A) a. tumefaciens A1045, B) a. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 e D) S. meliloti 1021 pMM11. Anche se l'aumento nell'associazione delle due specie batteriche è approssimativamente simile i dettagli dell'associazione come visto al microscopio ottico sono molto diversi. Le tecniche utilizzate sono quelle descritte nel passaggio 6. Questa figura è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A volte è possibile utilizzare l'associazione per le superfici non-biologici per aiutare a distinguere il contributo dei batteri e della pianta in un'interazione specifica. Il polysaccharide(UPP) unipolare di a. tumefaciens ha dimostrato di essere in grado di mediare associazione batterica ad una varietà di entrambe le superfici biologiche e non biologiche30. Calcio è stato osservato per inibire il legame di a. tumefaciens piantare superfici mediate dal UPP28. Al fine di determinare se l'inibizione di ioni del calcio di associazione batterica per piantare le superfici è dovuta ad un effetto sui batteri o sulla superficie della pianta, l'associazione dei batteri a fili di nylon è stata esaminata. Le tecniche vengono descritti nel passaggio 8.2 sono stati usati. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua come descritto nel passaggio 1. I batteri sono stati coltivati in terreno minimo con saccarosio e aggiunto al pomodoro radici o fili di nylon ad una concentrazione finale di circa 105/ml come descritto al punto 5.1. L'effetto di aggiunta CaCl2 sull'associazione batterica alle radici di pomodoro e fili di nylon è stato esaminato al microscopio. La figura 4 Mostra una simile inibizione di associazione di calcio utilizzando sia superficiale, suggerendo che l'effetto di calcio è principalmente sui batteri10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figura 4 : L'effetto di calcio sul legame di a. tumefaciens al pomodoro di peli radicali e fili di nylon. A. tumefaciens è stato incubato con radici di pomodoro (A e B) o fili di nylon (C e D) per 24 h in un 01:10 diluizione di MS sali e un 01:20 diluizione di terreno minimo di AB, 0,4% di saccarosio (A e C) o in un 01:10 diluizione di MS sali e 01:20 diluizione del terreno minimo AB , 0,4% saccarosio contenente 60 mM CaCl2 (B e D)31. L'aggiunta di CaCl2 ha inibito il grippaggio batterica sia radici e fili di nylon, suggerendo che l'inibizione era principalmente a causa di un effetto sui batteri piuttosto che sulla superficie della pianta. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Un metodo semplice per la misurazione e la caratterizzazione di adesione batterica alle piante, in particolare radici e germogli, è descritto in questo articolo.

Aderenza dei batteri per piantare superfici misurate in laboratorio

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

12.5K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. Un metodo semplice per la misurazione e la caratterizzazione di adesione batterica alle piante, in particolare radici e germogli, è descritto in questo articolo.

Video: Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

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Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran insects account for a number of economically substantial pests of plants that cause damage to crops by feeding on phloem sap. The brown marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) and the Asian citrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) are hemipteran insect pests introduced in North America, where they are an invasive agricultural pest of high-value specialty, row, and staple crops and citrus fruits, as well as a nuisance pest when they aggregate indoors. Insecticide resistance in many species has led to the development of alternate methods of pest management strategies. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism for functional genomic studies that has potential applications as a tool for the management of insect pests. Exogenously synthesized dsRNA or small interfering RNA (siRNA) can trigger highly efficient gene silencing through the degradation of endogenous RNA, which is homologous to that presented. Effective and environmental use of RNAi as molecular biopesticides for biocontrol of hemipteran insects requires the in vivo delivery of dsRNAs through feeding. Here we demonstrate methods for delivery of dsRNA to insects: loading of dsRNA into green beans by immersion, and absorbing of gene-specific dsRNA with oral delivery through ingestion. We have also outlined non-transgenic plant delivery approaches using foliar sprays, root drench, trunk injections as well as clay granules, all of which may be essential for sustained release of dsRNA. Efficient delivery by orally ingested dsRNA was confirmed as an effective dosage to induce a significant decrease in expression of targeted genes, such as juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT) and vitellogenin (Vg). These innovative methods represent strategies for delivery of dsRNA to use in crop protection and overcome environmental challenges for pest management.

This article demonstrates novel techniques developed for oral delivery of double-stranded RNA (dsRNA) through the vascular tissues of plants for RNA interference (RNAi) in phloem sap feeding insects.

Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be critical for microbial energy production and persistence in many subsurface environments, especially those lacking soluble terminal electron acceptors. While EET-capable microbes have been successfully isolated from various environments, the diversity of bacteria capable of EET is still poorly understood, especially in difficult-to-sample, low energy or extreme environments, such as many subsurface ecosystems. Here, we describe an on-site electrochemical system to enrich EET-capable bacteria using an anode as a respiratory terminal electron acceptor. This anode is connected&#160;to a cathode capable of&#160;catalyzing abiotic oxygen reduction. Comparing this approach with electrocultivation methods that use a potentiostat for poising the electrode potential, the two-electrode system does not require an external power source. We present an example of our on-site enrichment utilized in an alkaline pond at the Cedars, a terrestrial serpentinization site in Northern California. Prior attempts to cultivate mineral reducing bacteria were unsuccessful, which is likely due to the low-biomass nature of this site and/or the low relative abundance of metal reducing microbes. Prior to implementing our two-electrode enrichment, we measured the vertical profile of dissolved oxygen concentration. This allowed us to place the carbon felt anode and platinum-electroplated carbon felt cathode at depths that would support anaerobic and aerobic processes, respectively. Following on-site incubation, we further enriched the anodic electrode in the laboratory and confirmed&#160;a distinct microbial community compared to the surface-attached or biofilm communities normally observed at the Cedars. This enrichment subsequently led to the isolation of the first electrogenic microbe from the Cedars. This method of on-site microbial enrichment has the potential to greatly enhance the isolation of EET-capable bacteria from low biomass or difficult to sample habitats.

On-site microbial enrichment or in situ cultivation techniques can facilitate the isolation of difficult-to-culture microbial taxa, especially from low-biomass or geochemically extreme environments. Here, we describe an electrochemical set-up without using an external power source to enrich microbial strains that are capable of extracellular electron transport (EET).

Set-up elettrochimico autoportanti per arricchire i batteri respiring anodo in loco

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

La prova di infezione di pianta: Spray e ferita-mediata di inoculazione con la pianta patogeno Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Un flessibile a basso costo sistema idroponico per valutare le risposte della pianta a piccole molecole in condizioni sterili

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

Un protocollo di Rhizobox ottimizzato per visualizzare la crescita delle radici e tempi di risposta alle sostanze nutrienti localizzate

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...