L'attuale progetto è stato finanziato dalla prova dell'Università del Kansas di fondo di concetto. Vorremmo ringraziare il personale infermieristico a KUMC (Kansas City, KS) per aiutarci a ottenere cordoni ombelicali umani e David Jorgensen per assistere con culture di coclee.

Tutte le procedure, tra cui l'eutanasia degli animali, sono state condotte secondo il protocollo approvato del istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) (Coppa #2014-2234) presso l'University of Kansas Medical Center (KUMC).
Nota: HWJCs sono state isolate da cordone ombelicale umani che sono stati donati dai pazienti che ha fornito il consenso informato e gli esemplari sono stati utilizzati secondo i protocolli approvati dal comitato di soggetti umani di Università del Kansas (KU-IRB #15402).
1. osso temporale raccolto e coclea isolamento
<ol>
	<li>Decapita un mouse in modo appropriato eutanasizzato, 15-settimana-vecchio di taglio tra il cranio e la prima vertebra cervicale con un paio di forbici chirurgiche, quindi spruzzare giù la testa con etanolo al 70% per disinfettare (Figura 1A).</li>
	<li>Bisecare il cranio in un piano sagittale utilizzando lo stesso paio di forbici chirurgiche (Figura 1B- C, le linee tratteggiate).</li>
	<li>Rimuovere il tessuto di cervello dal cranio usando un paio di pinze (Figura 1, punta di freccia).</li>
	<li>Identificare l'osso temporale attraverso la presenza di uditivo e le radici del nervo vestibolare (Figura 1E-F, punte di freccia) all'interno del cranio e il condotto uditivo dall'esterno (Figura 1F, freccia). Accuratamente tagliato attraverso il cranio per isolare l'osso temporale dal resto del cranio (Figura 1). Nota: In alcuni casi, è possibile fare leva delicatamente le ossa circostanti del cranio dall'osso temporale senza la necessità di taglio.</li>
	<li>Inserire il forcipe fine nell'apertura del condotto uditivo circa 5 mm (Figura 1 H), in modo che le punte non si rischiano di perforare della coclea. Delicatamente, rompere l'osso della bulla (Figura 1 H, top rosso zona ombreggiata) così fratture (lineaFigura 1I, rosso punteggiato). Nota: Se necessario, un microscopio di dissezione può essere di aiuto in questo processo per assicurare un posizionamento preciso e manipolazione degli strumenti.</li>
	<li>Utilizzando una pinzetta, leva via il resto della bulla dall'osso temporale, esponendo il labirinto ossuto della coclea (Figura 1J, staffe rossi).</li>
	<li>Inserire una capsula di Petri sufficientemente grande da contenere l'osso temporale (ad esempio, 30 mm o maggiore) sotto la dissezione di campo di ambito e riempirlo con abbastanza Phosphate Buffered Saline (PBS) per coprire l'osso temporale (ad esempio, 0,5-1 mL).</li>
	<li>Immergere l'osso temporale con la bulla rimossa in PBS con le finestre ovale e rotonde della coclea rivolto verso l'alto. Nota: La rimozione del sistema vestibolare dalla coclea non è necessario, come il sistema vestibolare serve anche come un handle per il maneggiamento e orientando le caratteristiche della coclea (Figura 1I e Figura 2B).</li>
	<li>Utilizzando un ultra-sottile paio di pinze, rimuovere l'arteria stapediali, che passa attraverso lo stapes.</li>
	<li>Inserire una punta delle pinze ultra fine attraverso l'arco dello stapes dove l'arteria è attraversato e sollevare delicatamente lo stapes. Stapes disarticolate dovrebbe sollevare fuori la finestra ovale.</li>
	<li>Utilizzando una punta delle pinze ultra-sottile, l'ovale di puntura e finestre rotonde.</li>
	<li>Utilizzando un PBS 1X preriempita 28,5-manometro con tubo (diametro interno 0,28 mm, diametro esterno 0,61 mm) fissato, posizionare il tubo sopra la finestra ovale (Figura 2A -B). Nota: L'apertura del tubo può essere manipolato con forcipe ultra-fine, contribuendo a garantire un posizionamento preciso.<ol>
		<li>Utilizzare una siringa fresco e tubi per ogni coclea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Irrorare di 2 mL di 10% antibiotico antimicotico (anti-anti) e 10% penicillina-streptomicina (penna-strep) in PBS tramite coclea oltre 5 min per rimuovere perilymph. Che irrora troppo veloce con troppa pressione danneggia le strutture fini all'interno della coclea. Nota: Guida manualmente la siringa a mano per irrorare il fluido attraverso la coclea è efficace, anche se una pompa di perfusione potrebbe essere utilizzata come alternativa.<ol>
		<li>Se manualmente che irrora, usare un paio di belle, dichiusura forcipe per stabilizzare la coclea (Figura 2A) durante l'aspersione afferrando la parte vestibolare dell'osso temporale. Nota: Anche se non richiesto, questo lascia entrambe le mani libere maneggiare gli strumenti; una mano può guidare la siringa (Figura 2A) mentre l'altro può posizionare il tubo in modo appropriato (Figura 2B).</li>
		<li>Da questo punto in avanti, prendersi cura per evitare di esporre la coclea inutilmente all'aria. L'introduzione di bolle d'aria negli spazi fluidi bloccherà la circolazione dei fluidi, e ulteriore essiccazione danneggia le strutture fini all'interno della coclea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rimuovere ed eliminare eventuali rimanenti frammenti di ossa e dei tessuti dei muscolo utilizzando una pinzetta.</li>
	<li>Se necessario, è possibile memorizzare isolati coclee a 4 ° C in anti-anti 10% e 10% soluzione di penna-strep in PBS per fino a sette giorni con cambi regolari di soluzione antibiotica ogni 48 h.</li>
</ol>
2. coclea elaborazione
<ol>
	<li>Decellularizzazione
	<ol>
		<li>Per ogni coclea, riempire una fiala di scintillazione di vetro da 20 mL con un 1% sodio dodecil solfato soluzione (SDS) in acqua deionizzata (DI), che viene utilizzato per decellularize la coclea.</li>
		<li>Tagliare la punta fuori di una pipetta di plastica 7-mL trasferimento utilizzando una lama di rasoio in modo che l'apertura è abbastanza grande per una coclea di passare attraverso.</li>
		<li>Usando la pipetta, delicatamente redigere la coclea nella pipetta modo passa solo il bordo di taglio di pochi millimetri.</li>
		<li>Espellere la coclea nella fiala di scintillazione riempito di soluzione di 1% SDS.</li>
		<li>Circolare 2 mL di SDS 1% in acqua deionizzata (DI) attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
		<li>Collocare il flaconcino di scintillazione in un rotatore e lasciare riposare il flaconcino scintillazione ruotare a 10 giri per 72 h a temperatura ambiente.<ol>
			<li>Cambiare 1% SDS soluzione ogni 24 ore, per un periodo di 72 h. Fare attenzione quando si cambia SDS per non esporre mai la coclea all'aria.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Lavare la coclea tre volte per 30 minuti ciascuno, con dell'acqua distillata.</li></ol></li></ol>Eseguire i lavaggi del flaconcino di scintillazione stesso utilizzato per le spese di SDS; in questa fase, la coclea è decellularized.
	
	
	<li>Decalcificazione
	<ol>
		<li>Rimuovere l'acqua residua DI dal flaconcino di scintillazione, lasciando appena sufficiente per mantenere la coclea sommersa.</li>
		<li>Per iniziare la decalcificazione, aggiungere 5 mL di 10% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,02 M) in acqua distillata nel flaconcino di scintillazione contenente la coclea.</li>
		<li>Circolare 2 mL di EDTA 10% DI acqua attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
		<li>Collocare il flaconcino di scintillazione indietro nel rotatore e lasciare riposare il flaconcino scintillazione ruotare a 10 giri per 72 h a temperatura ambiente. Cambiare la soluzione di EDTA 10% ogni 24 ore, per un periodo di 72 ore. Fare attenzione quando si cambia soluzioni in modo che la coclea non è esposto all'aria.</li>
		<li>Sciacquare la coclea 3 volte per 2 h ciascuna con PBS 1X; in questa fase, la coclea è decalcificata.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deposito
	<ol>
		<li>Memorizzare le coclee per fino a 72 h in un'anti-anti, 10% penna-strep soluzione al 10% in PBS a 4 ° C. Nota: Più lunghi periodi di stoccaggio possono essere possibili con cambi regolari di soluzione antibiotica; Tuttavia, stoccaggio prolungato di coclee trasformati non è stato convalidato in questo protocollo.</li>
	</ol>
	</li>

3. appalti pubblici e l'espansione di hWJCs
<ol>
	<li>Isolare il hWJCs secondo protocolli precedentemente pubblicati22. Brevemente, segmento cordoni ombelicali in sezioni di 3 cm.</li>
	<li>Attentamente fare un'incisione superficiale con un bisturi longitudinalmente su ciascun segmento di cavo ombelicale per srotolare ed esporre gelatina di Wharton del cordone ombelicale. Utilizzare pinze per rimuovere i vasi sanguigni.</li>
	<li>Lavare cordone ombelicale segmenti due volte con abbastanza PBS (ad es., 40 mL in una capsula di Petri di 60 mm) per immergere il tessuto. Tritare finemente i segmenti di tessuto con un bisturi. Digerire il tessuto in un 100mm Petri con 50 mL di mezzo di digestione (collagenasi tipo 2 0,2%, 1% penicillina-streptomicina, in basso-glucosio Medium (DMEM dell'Aquila per volta di Dulbecco)).</li>
	<li>Posto del tessuto nella digestione medio su agitatore orbitale a 50 rpm durante la notte in un 5% CO2, incubatore 37 ° C. Il giorno seguente, diluire mezzo di digestione con un rapporto di 01:16 in 2% antibiotico antimicotico in PBS e pellet di cellule mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) per 10 min. Discard surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in Mesenchymal Stem Cell crescita medio (MSCGM) e ricombinare le cellule. Piastra le cellule ad una densità di 7 x 103 cellule/cm2 nella coltura del tessuto trattate boccette di T-75. HWJCs in MSCGM della cultura ed espandere al passaggio 5 per esperimenti. Nota: HWJCs può essere sub-coltivate in T-palloni più grandi (ad es., T-150, T-300) quando passaggio per aumentare la resa di hWJCs per gli esperimenti.</li>
</ol>
4. infusione di hWJCs in Decellularized coclee
<ol>
	<li>Preparare decellularizzati coclee
	<ol>
		<li>Utilizzando una tecnica asettica, lavare coclee stored in PBS 1X tre volte per 30 minuti ciascuno.</li>
		<li>Coclee di trasferimento in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 1 mL di 37 ° C pre-riscaldati MSCGM.</li>
		<li>Incubare le coclee in un 5% CO2, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C per un minimo di 1 h prima dell'infusione delle cellule.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissociare hWJCs e risospendere
	<ol>
		<li>HWJCs di lavaggio con 37 ° C pre-riscaldati 1X PBS due volte.</li>
		<li>Aggiungere sufficiente 37 ° C pre-riscaldati tripsina con EDTA 0,5% per coprire la superficie del vaso di cella.</li>
		<li>Incubare hWJCs per fino a 5 min in un 5% CO2, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C.<ol>
			<li>Verificare che il 90% delle cellule staccato dalla superficie di coltura delle cellule visualizzando le cellule al microscopio invertito. Nota: Le cellule che si muovono quando la nave di cultura delicatamente è sfruttata, staccato. Le cellule che rimangono fisse, non siano staccate.</li>
			<li>Picchiettare delicatamente i lati del pallone per sloggiare ulteriormente cellule allegate.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utilizzando una tecnica asettica, hWJCs trasferimento dal recipiente di coltura in una provetta conica da 50 mL contenente un volume equivalente di MSCGM al volume di tripsina utilizzato per dissociare le cellule.</li>
		<li>A pellet il hWJCs mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) per 5 min.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e risospendere hWJCs in MSCGM ad una concentrazione di 500.000 cellule/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Irrorare le coclee
	<ol>
		<li>Coclee di trasferimento ad una nuova piastra 24 pozzetti usando una pipetta di trasferimento.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di MSCGM per ogni coclea per impedire qualsiasi coclea asciugarsi.</li>
		<li>Delicatamente e orientare la coclea utilizzando forcipe ultra-fine, in modo che le finestre ovali e rotonde sono rivolto verso l'alto. Nota: La estrema attenzione direttamente ogni coclea come la coclea è danneggiata facilmente.</li>
		<li>Usando una siringa sterile 28,5-calibro insulina con tubi collegati, redigere 0,2 mL risospese hWJCs (100.000 cellule).</li>
		<li>Con una pinzetta sterilizzata, posizionate tubi finestra ovale.</li>
		<li>Delicatamente e lentamente irrorare la coclea con 0,2 mL di sedimento hWJCs utilizzando una siringa da insulina 28,5-manometro collegata al tubo in polietilene (diametro esterno: 0,61 mm, diametro interno: 0,28 mm) sopra circa 5 min.</li>
		<li>Dopo aspersione, aggiungere 0,8 mL di 37 ° C pre-riscaldati MSCGM al bene contenente la coclea per portare il volume totale nel pozzo a 1 mL.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 4.3.3-4.3.7 per ogni coclea, usando una siringa fresca e tubi ogni volta.</li>
		<li>Posto irrorati coclee in un cambiamento supporti tre volte alla settimana, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C e 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. conservazione e raccolto coclea
Nota: Coclee possono essere coltivate e raccolgono in qualsiasi momento post-l'aspersione fino a 30 giorni.
<ol>
	<li>Per conservare le coclee, difficoltà in paraformaldeide al 4% in PBS 1X durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a dondolo.</li>
	<li>Dopo la fissazione, lavare coclee con PBS 1X tre volte per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Gradualmente disidratare coclea con etanolo e chiaro con un solvente idrocarburo alifatico prima di incorporare in paraffina.</li>
	<li>Sezione campioni ad uno spessore di 10 µm utilizzando un microtomo e montare su vetrini. Nota: I campioni sono pronti per l'istologico o immunohistochemical elaborazione utilizzando protocolli standard.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo dimostrato con successo che le cellule cocleari native possono essere rimosso dalla coclea tramite un processo di decellularizzazione, che consente l'utilizzo della coclea come un'impalcatura di tessuto intricato, tridimensionale. Santi et al. 15 ha sviluppato il metodo iniziale per coclee decellularizing e hanno valutato esattamente i volumi di molte strutture cocleari attraverso con l'aiuto del foglio leggero microscopia23. Questi primi lavori servito come una solida base per l'ingegneria dei tessuti e tecniche di coltura cellulare presentati qui. Coclea decellularizzato con successo può essere infusa con le cellule e quindi coltivate per un periodo prolungato di tempo. Coclee da una vasta gamma di animali teoricamente potrebbero essere utilizzate in combinazione con una gamma altrettanto vasta di tipi di cellule. Queste combinazioni permettono le tecniche qui presentate per essere utilizzata in numerosi disegni sperimentali possibili, ad esempio applicazioni che esaminare epitelio sensoriale sviluppo14, test di nuovi agenti farmaceutici droga di ingegneria tissutale 24, e lo sviluppo del cocleare riparazione modelli-25. Tuttavia, nonostante l'ampia applicabilità di queste tecniche non sono senza limitazioni.
Uno dei limiti della tecnica attuale è che la perfusione è variabile basata sull'individuo. Lo sviluppo di un supporto, per la coclea e usando una pompa a siringa per condurre le aspersioni può aumentare la precisione e il successo del processo. Inoltre, dimostrando definitivamente successo decellularizzazione potenzialmente potrebbe essere realizzato attraverso diversi metodi. Abbiamo impiegato DAPI colorazione utilizzata per quantificare i restanti nuclei delle cellule, e abbiamo non osservato nessun nuclei residui post-decellularizzati. Inoltre, le analisi di quantificazione del DNA standard utilizzano il reagente, colorante verde rilevare quantità picogrammo di DNA, per identificare i resti di acido nucleico, che possono essere più sensibili di DAPI visivamente per individuare la presenza di piccoli frammenti di acido nucleico acidi in tessuti decellularizzati26. Indipendentemente da quali tecniche vengono utilizzate per convalidare successo decellularizzazione, potrebbe risultare possibile mostrare decellularizzazione completa di una coclea individuo prima che utilizzano come impalcatura. Tuttavia, abbiamo trovato il processo di decellularizzazione per avere successo e robusto.
L'isolamento e la manipolazione delle coclee e la perfusione delle coclee sono due fasi più critiche del protocollo corrente. Grande cura deve essere preso quando la coclea è inizialmente isolata, come la coclea è delicata e fragile. Se troppa forza viene applicata durante la manipolazione della coclea con il forcipe, potrebbe frammentare la coclea. Pertanto, è imperativo per gestire ogni coclea delicatamente prima di decellularizzazione e decalcificazione. Il sistema vestibolare, se lasciato intatto, serve come una grande maniglia per afferrare il complesso dell'orecchio interno con il forcipe e orientare la coclea. Allo stesso modo, quando che irrora la coclea con le cellule, la pressione dietro la perfusione non deve essere troppo grande, altrimenti le cellule non possono sopravvivere la perfusione. Come indicato nel protocollo attuale, fissaggio della tubazione fino alla fine di una siringa da insulina 1 mL consente per una maggiore maneggevolezza della coclea con una sola mano e una maggiore precisione in che irrora le cellule attraverso la coclea con l'altra mano.
Come prossimo passo, sarebbe naturale per valutare marcatori funzionali e di sviluppo per determinare se l'ECM coclea è induzione della differenziazione delle cellule staminali, e se così, quali componenti ECM specifici nella coclea sono indurre cambiamenti nelle cellule. Che irrora di diversi tipi di cellule (per esempio, cellule staminali, neuroprogenitors, fibroblasti, ecc.) attraverso la coclea per differenziazione cellulare monitor e comportamento sarebbe un'altra affascinante indagine di follow-up. Inoltre, le cellule che sono state geneticamente modificate o sono esposti a un protocollo di differenziazione di fattore di crescita possono fornire nuove intuizioni come il ECM cocleare supporta lo sviluppo neurosensoriale e forse anche funzione in udienza. Così, l'attuale protocollo è un primo passo significativo nell'uso di ECM cocleare per studiare sviluppo neurosensoriale dell'orecchio interno e manutenzione, che un giorno potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie per ripristinare la perdita dell'udito.

La coclea è una struttura a spirale intricato trovata nell'osso temporale. Esso è composto da un labirinto osseo esterno e un labirinto membranoso concentrici, interno1. Il labirinto membranoso è costituito da tre spazi fluidi: vestibuli di scala, Scala media e tympani di Scala1. I mezzi di scala ospita l'epitelio sensoriale, che è composto da una moltitudine di tipi di cellule, ma le cellule ciliate sensoriali (HC), che trasducono energia meccanica in onde sonore in impulsi nervosi2, sono di particolare interesse. L'esposizione al trauma acustico3,4,5, farmaco6, malattia7,8e9 di invecchiamento può provocare di alterata funzione uditiva tramite morte HC. Perdita di capelli cellulare nei mammiferi è permanente, a differenza di aviaria HCs, che può rigenerare dopo lesioni10.
Una varietà di sforzi di ricerca contemporanea hanno cercato di ripristinare perso HCs, anche se gli approcci sperimentali specifici variano. Manipolazione dell'espressione genica in epitelio sensoriale e l'impianto di cellule staminali differenziate all'esterno del corpo sono approcci dominanti nel campo, anche se i metodi di induzione che cercano di differenziare le cellule staminali in organoids cocleari sono stati ha tentato di11,12,13. Ciascuno di questi approcci sia reliant direttamente su cellule staminali, o i segnali dello sviluppo utilizzati dalle cellule staminali; Tuttavia, un secondo ha condiviso, e potenzialmente critici, elemento è l'ECM della coclea stessa14,15.
L'ECM non solo fornisce supporto fisico per cellule e tessuti, che comprende una superficie di adesione delle cellule, proliferazione, sopravvivenza e migrazione, ma svolge anche il ruolo critico nello sviluppo di HCs e la spirale del ganglio15,16 ,17. Naturalmente che si verificano ECM fornisce segnali induttivi che possono guidare la determinazione del fenotipo cellulare e/o di adesione, proliferazione e sopravvivenza cellulare18. Di conseguenza, l'uso di decellularizzazione coclea in combinazione con hWJCs coltivate offrono un'occasione unica per esplorare il ruolo della rigenerazione ECM e HC. HWJCs sono un tipo di cellula prontamente disponibili, non controverso isolato dal cordone ombelicale umani che si comportano come cellule staminali mesenchimali19. HWJCs hanno dimostrato la capacità di differenziarsi verso il basso delle cellule neurosensoriali lignaggi20,21. Così, l'attuale protocollo dettagli l'isolamento, decellularizzazione e perfusione delle coclee da carcasse del mouse C57BL con hWJCs per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno.

<table><tbody><tr><td>Allegra X-14R Centrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Semi-Rigid Tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>50-mL Conical Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Insulin Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation Vial</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 Culture Flask</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 Culture Flask</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 Culture Flask</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% SDS Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for decellularizing mouse cochleae for inner ear tissue engineering

Nei mammiferi, le cellule ciliate che mechanosensory che facilitano la mancanza dell'udito la capacità di rigenerare, che ha limitato i trattamenti per la perdita dell'udito. Attuali strategie di medicina rigenerativa sono concentrati sul trapianto di cellule staminali o la manipolazione genetica delle cellule di supporto nell'orecchio interno per incoraggiare la sostituzione delle cellule danneggiate di staminali per correggere la perdita della capacità uditiva circostanti. Ancora, la matrice extracellulare (ECM) può svolgere un ruolo vitale nell'induzione e mantenimento della funzione delle cellule ciliate e non è stato ben studiata. Utilizzando il cocleare ECM come impalcatura per crescere le cellule staminali adulte possono fornire intuizioni uniche come la composizione e l'architettura dell'ambiente extracellulare aiuta le cellule nel sostenere la funzione uditiva. Qui presentiamo un metodo per isolare e decellularizing coclee da topi da utilizzare come scaffold accettando irrorato le cellule staminali adulte. Nel protocollo attuale, coclee sono isolate da topi eutanasizzati, decellularized e decalcificati. In seguito, cellule di gelatina di Wharton umana (hWJCs) che sono state isolate da cordone ombelicale sono state irrorate con attenzione in ogni coclea. Le coclee sono stati usati come bioreattori, e le cellule sono state coltivate per 30 giorni prima in fase di elaborazione per l'analisi. Coclee decellularizzati mantenuto strutture extracellulari identificabili, ma non hanno rivelato la presenza di cellule o notevoli frammenti di DNA. Cellule irrorate nella coclea invasero la maggior parte dell'interno ed esterno della coclea ed è cresciuta senza incidenti nel corso di una durata di 30 giorni. Così, il metodo corrente può essere utilizzato per studiare come cocleare ECM colpisce cellule sviluppo e comportamento.

Utilizzando i metodi presentati qui, successo decellularizzazione di coclee è stata valutata esaminando la presenza o l'assenza di DNA attraverso 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Coclee sono stati considerati pienamente decellularizzati se il DNA non è stato identificato all'interno della coclea decellularizzata. Una coclea nativa da un esperimento precedente che non subissero decellularizzati o decalcificazione è stata utilizzata come controllo positivo per illustrare le strutture e le cellule che si trovano tradizionalmente in una coclea di mouse C57BL. Coclea decellularized-decalcificati, che non ha avuto alcun hWJCs infuso, è stata utilizzata come controllo negativo. Non quantificabili nuclei cellulari DAPI macchiati sono stati osservati in qualsiasi regione della sezione di tessuto (Figura 3). Due coclee erano decellularized e decalcificate e poi infuso con hWJCs per il progetto corrente. Le coclee decellularized-decalcificate sono stati irrorati con hWJCs sono stati osservati per avere numerosi DAPI macchiato nuclei all'interno della coclea e cresce su shell ossuta all'esterno della coclea (tabella 1). Totale stimato di densità delle cellule per la cella infuso prima coclea erano 113.759 cellule/coclea dopo 30 giorni di cultura (Figura 4 e Figura 5) e per la seconda coclea erano 118.732 cellule/coclea dopo 30 giorni di cultura (Figura 6 e Figura 7). Queste stime di densità cellulare includono il tympani di Scala mezzi di Scala e Scala vestibolo e volumi di strutture che si trovano all'interno di tre spazi fluidi, ma queste stime escluso qualsiasi del labirinto ossuto rimanente. Inoltre, i campioni da ogni coclea sono stati macchiati con ematossilina ed eosina (H &#38; E) per mostrare la presenza di cellule e caratteristiche anatomiche all'interno ogni coclea (Figura 8). L'anatomia lorda di microstrutture cocleare rimasta prevalentemente immutata nel corso di tutte le sezioni macchiate; Tuttavia, le celle non erano identificabili nella sezione decellularized-decalcificate (Figura 8B). L'identificazione dei nuclei delle cellule era drammaticamente differente fra la coclea nativa (Figura 8A) e le coclee decellularized-decalcificate infusi con cellule (Figura 8–D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig1.jpg"> 
Figura 1: Mouse osso temporale isolamento. Una volta che il mouse è stata eutanasia in modo appropriato, decapitare l'animale di taglio tra la base del cranio e la prima vertebra cervicale e la testa di spruzzo con etanolo per disinfettare (A). Bisecare il cranio in un piano sagittale della sezione (B–C) utilizzando un paio di forbici chirurgiche, taglio attraverso il tessuto cerebrale e l'osso. La testa del mouse bisecato (D, mandibola inferiore rimosso per lavoro sperimentale non correlati) deve quindi avere il tessuto di cervello rimosso per rivelare l'osso temporale. I due orifizi attraverso cui il pass uditivo e nervi vestibolari (punte di frecciaE, rosso) sono utili spunti per identificare correttamente l'osso temporale. Togliere la carne dal cranio (F). Il condotto uditivo esterno (F, freccia, pannello superiore) fornisce un'utile indicazione esterna pure. Accuratamente tagliare via l'osso in eccesso, lasciando solo l'osso temporale isolato (G). Bulla (H, pannello superiore, rosso area evidenziata) deve quindi essere rimosso delicatamente utilizzando una pinzetta (H, pannello inferiore). La bulla è osso sottile e può essere facilmente scheggiata via (io) fino a quando il labirinto ossuto della coclea è rivelata (staffeJ, rosso). Barre della scala su tutte le immagini sono di 1 mm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig2.jpg"> 
Figura 2: perfusione cocleare. Una volta che l'osso temporale è stato isolato e la bulla è stato rimosso, la coclea può quindi impostare per aspersione al microscopio. Quando che irrora usando una siringa manualmente guidata con tubazione collegata (A, linea punteggiata) può essere utile stabilizzare la coclea usando un paio di pinze di chiusura automatica. Delicatamente collegare le pinze alla parte vestibolare dell'osso temporale (B) e riposare il forcipe contro il labbro di Petri (A). Questo lascia entrambe le mani libere manipolare strumenti durante l'aspersione. Da un lato quindi possibile manipolare la siringa, controllo della portata del fluido, mentre l'altra mano può posizionare il tubo sopra la finestra ovale utilizzando un secondo paio di pinze (B). L'estremità libera del tubo di taglio ad angolo permette per un più facile posizionamento, permettendo il tubo essere posizionata correttamente senza bloccare il campo visivo. Barra della scala è di 1 mm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig3.jpg"> 
Figura 3: sezione di tessuto di una coclea del mouse decellularizzati. Un microscopio dritto di epi-fluorescente è stato utilizzato per immagine campioni ad un ingrandimento di 200x (oculare 10x e obiettivo X 20). Immagini erano cuciti insieme per creare circa un montaggio di 4 x 5. DAPI mostrando assenza di cellule di macchiatura nucleare è mostrato nel Pannello utilizzando un insieme di filtro comune DAPI (350 nm eccitazione, 470 nm emissione) e una sovraesposta, scala di grigi del autofluorescence utilizzando un filtro comune di fluoresceina isotiocianato (FITC) set (490 nm eccitazione, 525 nm emissione), che fornisce punti di riferimento anatomici, è mostrato nel pannello B. I conteggi delle cellule automatizzati sono stati effettuati in tre regioni di interesse, che sono delineati su entrambi i pannelli A e B. Conta delle cellule totali sono stati calcolati per l'intero tessuto sezione (1, solida linea bianca) e la coclea (2, linea tratteggiata). Questi due numeri sono stati utilizzati per calcolare il numero di cellule in strutture ossee di fuori della coclea, ma all'interno i bordi esterni, ossuti della sezione di tessuto (3, spazio tra la linea tratteggiata e la linea tratteggiata). Barre della scala su tutte le immagini sono 500 µm.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig4.jpg"> 
Figura 4: una vicino-modiolar sezione della coclea del mouse decellularizzati 1 infuso con hWJCs. Macchiatura nucleare DAPI è mostrata nel pannello A sovrapposta su un'autofluorescenza sovraesposti, in scala di grigi dal canale verde, che fornisce punti di riferimento anatomici. Automatizzata delle cellule conteggi sono stati effettuati in tre regioni di interesse, che sono delineati nel pannello A. Conta delle cellule totali sono stati calcolati per l'intero tessuto sezione (1, solida linea bianca) e la coclea (2, linea tratteggiata). Questi due numeri sono stati utilizzati per calcolare il numero di cellule in strutture ossee di fuori della coclea, ma all'interno i bordi esterni, ossuti della sezione di tessuto (3, spazio tra la linea tratteggiata e la linea tratteggiata). La colorazione DAPI isolato è mostrato nel pannello B, e la soglia della colorazione DAPI utilizzato durante la quantificazione automatica viene visualizzata nel pannello di C. Barre della scala su tutte le immagini sono 500 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig5.jpg"> 
Figura 5: vista ad alto ingrandimento di una sezione vicino-modiolar della coclea del mouse decellularizzati 1 infuso con hWJCs. Macchiatura nucleare DAPI è mostrata nel pannello A sovrapposta su un'immagine in scala di grigi sovraesposti, del autofluorescence dal canale verde, che fornisce punti di riferimento anatomici. La colorazione DAPI isolato è mostrato nel pannello B, e l'immagine di soglia utilizzata durante la conta cellulare automatizzata è mostrato nel pannello C. Gli spazi fluidi e microstrutture più fini, ospitate all'interno della coclea sono ben conservate durante la decellularizzazione e delle cellule di fasi di cultura dell'esperimento. Vestibuli di scala (SV), Tympani di Scala (SM), membrana basilare (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), canale (RC) di Rosenthal, Modiolus (M), legamento a spirale (SL) e vascularis dello stria (*). Membrana di Reissner non era chiaramente definita nelle sezioni del tessuto, e di conseguenza la Scala Media non è stato chiaramente definito. Barre della scala su tutte le immagini sono 250 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig6.jpg"> 
Figura 6: una sezione vicino-modiolar della coclea del mouse decellularizzati 2 che è stato infuso con hWJCs. Macchiatura nucleare DAPI è mostrata nel pannello A, sovrapposto sul autofluorescence in scala di grigi dal canale verde, che fornisce punti di riferimento anatomici. Automatizzata delle cellule conteggi sono stati effettuati in tre regioni di interesse, che sono delineati nel pannello A. Conta delle cellule totali sono stati calcolati per l'intero tessuto sezione (1, solida linea bianca) e la coclea (2, linea tratteggiata). Questi due numeri sono stati utilizzati per calcolare il numero di cellule in strutture ossee di fuori della coclea, ma all'interno i bordi esterni, ossuti della sezione di tessuto (3, spazio tra la linea tratteggiata e linee tratteggiate). La colorazione DAPI isolato è mostrato nel pannello B, e la soglia della colorazione DAPI utilizzato durante la quantificazione automatica viene visualizzata nel pannello di C. Barre della scala su tutte le immagini sono 500 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig7.jpg"> 
Figura 7: vista ad alto ingrandimento di una sezione vicino-modiolar della coclea del mouse decellularizzati 2 che è stato infuso con hWJCs. Macchiatura nucleare DAPI è mostrata nel pannello A, sovrapposto sul autofluorescence in scala di grigi dal canale verde, che fornisce punti di riferimento anatomici. La colorazione DAPI isolato è mostrato nel pannello B, e l'immagine di soglia utilizzata durante la conta cellulare automatizzata è mostrato nel pannello C. Gli spazi fluidi e microstrutture più fini, ospitate all'interno del cocleare vengono conservate durante le fasi di cultura decellularizzazione e cella dell'esperimento. Vestibuli di scala (SV), Tympani di Scala (SM), membrana basilare (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), canale (RC) di Rosenthal, Modiolus (M), legamento a spirale (SL) e vascularis dello stria (*). Membrana di Reissner non era chiaramente definita nelle sezioni del tessuto, e di conseguenza la Scala Media non è stato chiaramente definito. Barre della scala su tutte le immagini sono 250 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig8.jpg"> 
Figura 8: eosina e colorazione di controllo e trattati coclee. Ematossilina ed eosina macchiato sezioni visualizzati da una coclea tipica con cellule native presenti è mostrato nel pannello A. Pannello B contiene le stesse strutture come pannello A, ma è da una coclea completamente decellularizzata, che lascia dietro di sé la matrice extracellulare. Le due coclee precedentemente illustrati infusi con hWJCs sono visti in pannelli C e D. L'anatomia lorda coclea invariato principalmente attraverso la decellularizzazione e processi di coltura delle cellule, anche se le popolazioni di cellule specifiche e le posizioni sono alterati drammaticamente. Vestibuli di scala (SV), Tympani di Scala (SM), membrana basilare (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), canale (RC) di Rosenthal, Modiolus (M), legamento a spirale (SL) e vascularis dello stria (*). Barre della scala su tutte le immagini sono 250 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>A1 Coclea cellule +</td>
			<td>A2 Coclea cellule +</td>
			<td>B2 neg.</td></tr></tbody></table>Controllo coclea
		
		<tr>
			<td>Labirinto osseo esterno</td>
			<td>3.758</td>
			<td>549</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osso spazi esterni di coclea</td>
			<td>248</td>
			<td>586</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All'interno della coclea</td>
			<td>518</td>
			<td>701</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellule totali</td>
			<td>4.524</td>
			<td>1.836</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sezione Volume (μl)</td>
			<td>0.0077</td>
			<td>0.0100</td>
			<td>0.0147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Per cento del Volume di coclea</td>
			<td>0.46%</td>
			<td>0,59%</td>
			<td>0.87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcola la densità delle cellule all'interno della coclea</td>
			<td>113.759</td>
			<td>118.732</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	

Tabella 1: conta delle cellule. DAPI cocleare sezioni macchiate erano con soglia e quantificati utilizzando strumenti di conteggio automatici di ImageJ in 3 regioni non sovrapposti di interesse (di fuori del labirinto osseo, osso temporale di fuori del cocleari spazi fluidi e all'interno della coclea). Area della sezione trasversale coclea inoltre è stata misurata in ImageJ, e questo valore è stato utilizzato per calcolare il volume di sezione in combinazione con spessore di sezione (10 µm). Utilizzando una stima del volume totale di cochlear pubblicato da Santi et al. 23, il volume relativo coclea di una determinata sezione è stata calcolata. La densità delle cellule della coclea intera è stata stimata utilizzando il relativo volume coclea di una determinata sezione in combinazione con il conteggio delle cellule accoppiati.

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A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l'utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

a-protocol-for-decellularizing-mouse-cochleae-for-inner-ear-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Views.  University of Kansas Medical Center. L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l'utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

Video: A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neuroscienze

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

L&#39;approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicina

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

Etichette e acquisizioni Dextran nelle cellule dei capelli Murine Cochlear dal vivo e funzionali

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Bioingegneria

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Espianti cocleari neonatali interi come modello in vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

Uno studio comparato Drug metodi di consegna mirate per l&#39;orecchio interno mouse: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; Iniezione transtimpanica

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Biologia

Extracting the Cochlea from a Human Temporal Bone: A Cadaveric Protocol

The extraction of the cochlea from a cadaver human temporal bone may be required for different studies of the inner ear. For histological evaluations, the inner ear must be extracted from the temporal bone to facilitate histologic processing; likewise, some micro-computed tomography devices are too small to accommodate the complete temporal bones; additionally, the image quality can be enhanced when the cochlea is isolated.
The inner ear is located within the petrous part of the temporal bone. The inner ear can be divided into the osseous labyrinth or otic capsule and the membranous labyrinth inside the otic capsule. Furthermore, the inner ear can be divided into the vestibular system (the semicircular canals and the vestibule) and the cochlea. The appreciation of the location and orientation of the cochlea within the temporal bone is difficult, as it is embedded within bony structures and thus cannot be directly visualized. Nevertheless, there are distinct anatomical structures that can help guide the process to allow a reliable drill-out of the cochlea. The landmarks in the posterior parts of the cochlea are the facial nerve, semicircular canals, and the vestibule. In the middle, the inferior borders of the cochlea are identified by the round window and the basal turn of the cochlea. In the anterior border, one encounters the carotid artery; the landmark for the superior border is the genicular ganglion (GG) of the facial nerve. The medial structures are determined by the locations of the internal auditory canal, the superior semicircular canal, and the canal of the internal carotid artery.
In this article, we present a method for extracting the cochlea reliably out of the temporal bone by drill-out while following several anatomical landmarks.

This article presents a reliable method for extracting the human cochlea from the cadaver temporal bone by drill-out while following distinct anatomical landmarks.

The extraction of the cochlea from a cadaver human temporal bone may be required for different studies of the inner ear. For histological evaluations, the ...

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

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