Ringrazio il dottor Alan O. Perantoni (NIH/NCI/CDBL) per sostenere la presentazione di questo manoscritto. Ringrazio anche il Dr. Michael Hall (NIH/NCI/CDBL) e Nirmala Sharma (NIH/NCI/CDBL) per la modifica di questo manoscritto. Sono grato a Lai Thang (SAIC) per il suo allevamento eccellente mouse. Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di salute, National Cancer Institute e centro per la ricerca sul cancro.

topi (Wnt5a flox / flox topi (Wnt5a tm1.1Tpy) e Dll1Cre linea, modello murino UVJO) 7 erano gestiti secondo le linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio Studiò con un protocollo approvato dal comitato di uso e NCI-Frederick Animal Care.
 1. preparazione della soluzione di colorante blu di metilene <ol><li>misura 0,1 g di blu di metilene polvere.</li>
	<li>Sciogliere completamente il blu di metilene in salino normale 10 mL o 1 x tamponato fosfato salino (PBS) nel Vortex.</li>
	<li>Filtrare la soluzione di blu di metilene 10 mg/mL con un siringa filtro (dimensione dei pori di membrana 0.45µm) per eliminare l'intasamento durante l'iniezione.</li>
	<li>Montare un sterile del cuoio capelluto vena set (27GX3/4 &#8243;) con una siringa monouso da 3 mL e riempire la siringa con 3 mL di filtrato soluzione di blu di metilene. 
	Nota: Per evitare successive tintura flusso e pressione idrostatica, posizionare la punta dell'ago sopra la siringa riempita con soluzione di blu di metilene.</li>
</ol> 2. Dissezione di embrioni prenatale <ol><li>pulito di dissezione Forbici e pinze con etanolo al 70%.</li>
	<li>Per raccogliere embrioni perinatali a E18.5 o e 19.5, eutanasia topi incinti prima mediante inalazione di CO 2 e quindi eseguire dislocazione cervicale secondo linee guida NIH. 
	Nota: Il mouse femmina incinto solitamente dà vita a partire da E18.5, tuttavia, i reni più grandi sono più facili da manipolare. Di conseguenza, reni a e 19.5 più vicino alla nascita sono più facili da eseguire questa analisi su. Tuttavia, cuccioli con bilaterale delle vie urinarie ostruzioni muoiono dopo la nascita. A seconda delle caratteristiche di topi sperimentali, una raccolta appropriata giorno e ora dovrebbe essere determinata empiricamente.</li>
	<li>Spray etanolo al 70% sulla superficie addominale ventrale e quindi aprire la cavità addominale ventrale utilizzando pinze e forbici per dissezione.</li>
	<li>Sollevare l'intero utero e separarla dal corpo di taglio con forbici alle punte dei corni uterini di dissezione.</li>
	<li>Sciacquare l'intero utero con PBS 1X in una capsula Petri.</li>
	<li>Tagliare l'utero segmentally con forbici di dissezione e rimuovere placenta decidua con forcipe per esporre gli embrioni nei sac di tuorlo di dissezione.</li>
	<li>Rimuovere il sacco vitellino prima e poi rimuovere la membrana amniotic con forcipe per liberare gli embrioni perinatali di dissezione.</li>
	<li>Decapitare un embrione con forbici di dissezione. Pulire il sangue in eccesso con compresse di garza sterile. L'embrione pin con la sua superficie ventrale up in un microscopio per dissezione equipaggiato con una fotocamera digitale per l'imaging. Raccogliere la sua coda per genotipizzazione se necessario. 
	Nota: Eseguire un embrione iniezioni alla volta.</li>
	<li>Aprire con cautela la cavità addominale di un embrione con forcipe strappando la pelle. Quindi, rimuovere con delicatezza in eccesso organi e tessuti quali fegato, stomaco e intestino con forcipe tagliandoli o tirarle fuori per esporre i reni, ureteri e vescica che sono situati dorsalmente ( Figura 1A). Assorbire il sangue in eccesso dall'embrione dissecata con compresse di garza sterile se necessario. 
	Nota: Il sangue in eccesso interferisce con identificazione della pelvi renale per l'iniezione di colorante.</li>
</ol> 3. Iniezione di colorante blu di metilene nella pelvi renale e monitoraggio del flusso di tintura <ol><li>Rimuovi bolle nell'ago e la tubazione espellendo soluzione di blu di metilene dalla punta dell'ago dalla pressione idrostatica. Sollevare la siringa contenente la soluzione di colorante sopra il livello della punta dell'ago per avviare il flusso e quindi abbassare la siringa per interrompere il flusso.</li>
	<li>Inserire l'ago nella pelvi renale vicino l'uretere prossimale, facendo attenzione a non per disturbare una volta posizionati. Eseguire l'iniezione della tintura in un rene per determinare la sua ostruzione dell'apparato urinario. 
	Nota: Eseguire la tintura prima iniezione in qualsiasi renale anormale 7 seguendo allo stesso modo per determinare la sua ostruzione dell'apparato urinario.</li>
	<li>Sollevare la siringa fino a circa 20 cm per fornire pressione idrostatica e lasciare 15 µ l - 60 µ l del flusso di soluzione del colorante. La portata sarà circa 3 µ l/s se la siringa è aumentata a questa altezza sopra l'embrione.</li>
	<li>Monitorare il colore blu della tintura a partire prima nella pelvi renale, poi nella lunghezza dell'uretere e infine nel lume della vescica. 
	Nota: Si impiegano circa 5 s per vedere un colore tintura debole emergono all'interno del lumen della vescica se l'uretere è correttamente inserito nella vescica. Consentire il colorante ad accumularsi nel sito bloccato circa 15 s se nessun colore tintura compare nel lume della vescica.</li>
	<li>Posizionare la siringa fino a fermata tintura flusso e rimuovere l'ago dal rene.</li>
	<li>Foto per scattare foto di rene, uretere e vescica tracciata con soluzione colorante con la fotocamera e programma di imaging collegato a uno stereomicroscopio.</li>
	<li>Fare un record di idronefrosi del rene, hydroureter e la posizione finale della soluzione colorante in un quaderno di laboratorio.</li>
	<li>Eseguire l'iniezione di rene controlaterale come descritto nelle sezioni 3.1) a 3.5) e consentire il flusso di tintura circa 20 s in totale. 
	Nota: Il lume della vescica sarà riempito di soluzione colorante, indicata da un colore blu forte, se l'uretere è inserito correttamente nel lume della vescica. Dopo la valutazione dell'ostruzione della giunzione delle vie urinarie, ureteri e vescica può essere fissate per sezionamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rasouly, H. M., Lu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+urinary+tract+development+and+disease.">Lower urinary tract development and disease.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).</li><li>Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Box+Genes+in+the+Kidney+and+Urinary+Tract.">T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract.</a> Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).</li><li>Bohnenpoll, T., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureter+growth+and+differentiation.">Ureter growth and differentiation.</a> Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).</li><li>Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic,+environmental,+and+epigenetic+factors+involved+in+CAKUT.">Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).</li><li>Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+canonical+Smad+signaling+in+ureteral+and+bladder+mesenchyme+causes+ureteropelvic+junction+obstruction.">Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id2+haploinsufficiency+in+mice+leads+to+congenital+hydronephrosis+resembling+that+in+humans.">Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans.</a> Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).</li><li>Yun, K., Perantoni, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydronephrosis+in+the+Wnt5a-ablated+kidney+is+caused+by+an+abnormal+ureter-bladder+connection.">Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection.</a> Differentiation. 94, 1-7 (2017).</li><li>Uetani, N., Bouchard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plumbing+in+the+embryo:+developmental+defects+of+the+urinary+tracts.">Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts.</a> Clin Genet. 75, 307-317 (2009).</li><li>Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+urinary+tract+defects+in+mice:+methods+to+detect+the+presence+of+vesicoureteric+reflux+and+urinary+tract+obstruction.">Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction.</a> Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).</li><li>Weiss, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephric+duct+insertion+requires+EphA4/EphA7+signaling+from+the+pericloacal+mesenchyme.">Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme.</a> Development. 141, 3420-3430 (2014).</li></ol>

L'autore non ha nulla di divulgare.

I reni mouse sono inizio funzionale alle E16.5 e una prova di iniezione della tintura è teoricamente possibile da questo punto di tempo. Tuttavia, il rene è troppo piccolo per essere iniettato con la soluzione colorante e fenotipi quali idronefrosi e hydroureter non si osservano chiaramente dal momento che questi fenotipi sono un effetto secondario di urina accumulato a causa del trasporto delle urine anormali. Questi fenotipi, da ostruzioni quali UPJO o UVJO, sono evidenti alle E18.5 di dilatato reni e ureteri. Reni più grandi degli embrioni e 19.5 o cuccioli neonatali sono più facili da manipolare rispetto a quelle degli embrioni a E18.5 o più giovani. Tuttavia, cuccioli con bilaterale delle vie urinarie ostruzioni muoiono dopo la nascita. Pertanto, eseguire esperimenti per convalidare fenotipi CAKUT scegliendo opportunamente gli embrioni perinatali o cuccioli a seconda delle caratteristiche sperimentale del topo.
Sezionare con cura per mantenere un sistema urinario intatto prima di eseguire l'iniezione della tintura per esaminare potenziali difetti. Questo è essenzialmente importante per anormale hydronephrotic reni e ureteri, che sono molto dilatato e facilmente danneggiati durante la rimozione del tessuto supplementare per esporre i reni e vie urinarie. Danneggiare questi organi durante la dissezione impedirà una determinazione completa dei difetti reali. Ad esempio, la figura 2 Mostra la dilatazione distinta di un uretere, ma la perdita della tintura non riesce a mostrare il punto terminale del hydroureter distale.
Sempre essere sicuri di rimuovere le bolle d'aria dalla tubazione e l'ago prima dell'iniezione, come queste bolle si bloccheranno il flusso corretto. Dopo la dissezione del successo, il passaggio fondamentale per esaminare l'ostruzione delle vie urinarie è inserimento della punta dell'ago nella pelvi renale. L'inserimento dell'ago nella metà superiore del rene, vicino l'uretere prossimale, è utile per dirigere la punta dell'ago nella pelvi renale. La punta dell'ago deve puntare verso l'uretere prossimale. Poiché i vasi sanguigni renali si trovano vicino l'uretere prossimale, la tintura può essere flusso lungo i vasi sanguigni renali a meno che la punta dell'ago rivolta verso l'uretere prossimale. In questo caso, la punta dell'ago deve essere regolata nella pelvi renale verso l'uretere prossimale. Ulteriormente, può passare l'ago attraverso il rene se inserito troppo in profondità, causando la tintura a fuoriuscire fuori del rene e nella cavità del corpo. Attenzione inserimento della punta dell'ago nella pelvi renale e la punta dell'ago all'interno della pelvi renale di monitoraggio può aiutare a evitare questo errore. A volte, l'ago verrà bloccata dal tessuto del rene durante l'iniezione se non è inserita nella pelvi renale. In questo caso, rimuovere il tessuto dall'ago, reimpostare tintura flusso riavviando pressione idrostatica e reindirizzare la punta dell'ago verso la pelvi renale. Inoltre, fenotipi associati con CAKUT possono essere unilaterali o bilaterali. Pertanto, assicurarsi che l'iniezione viene eseguita separatamente per sistemi di sinistro e destra delle vie urinari. In modo ottimale, eseguire l'iniezione prima con un rene ovviamente anormale per verificare se il UVJO è unilaterale.
Immagine immediatamente dopo la prova di iniezione poiché il colorante passa dalla pelvi renale attraverso l'uretere rapidamente. È difficile vedere il colore durante la formazione immagine di un uretere normale perché un uretere normale è un tubo sottile, anche se il flusso di tintura può essere monitorato sotto il microscopio per dissezione. Come alternativa a blu di metilene, 1% veloce verde in PBS 1X può anche essere usato e apparirà come un colore verde scuro9. Oltre a iniezione della tintura, le sezioni istologiche dei reni e ureteri seguendo H &#38; E macchiatura confermerà i difetti all'interno del reni e ureteri. Inoltre, imaging delle sezioni con un reporter specifico dell'uretere è un altro modo per confermare UVJO7. Tuttavia, queste sezioni devono essere intatte e sezionamento seriale è necessaria per evitare falsi positivi. Rispetto ai tradizionali basati su sezione analisi di sistemi urinario, questo protocollo di iniezione di tintura è un modo immediato per osservare l'integrità del rene e dell'uretere brevetto e visualizzare ostruzioni quali UPJO o UVJO.
Questo protocollo fornisce un semplice e semplice metodo ognimodello visualizzare struttura delle vie urinarie in tarda fase di sviluppo del mouse, che permette l'analisi dello sviluppo delle vie urinarie. Il metodo qui descritto può essere utilizzato per valutare le mutazioni che causano i difetti inerenti allo sviluppo delle vie urinarie, come mezzo di identificazione delle modifiche nello sviluppo di maturazione o uretere del tratto urinario.

Il sistema urinario è costituito da una coppia di reni e ureteri e un comune della vescica e dell'uretra. La funzione principale del sistema urinario è di mantenere l'omeostasi corporea gestendo l'equilibrio di acqua ed elettroliti del sangue. I reni filtrano il sangue per controllo di concentrazione di elettroliti e l'equilibrio acido-base e producono urina per espellere l'acqua in eccesso e rifiuti tra cui soluti e metaboliti. Urina viene quindi trasportato attraverso l'uretere dalla pelvi renale del rene per la bladderin un modo unidirezionale dove viene immagazzinata e infine eliminata attraverso l' uretra1.
Gli ureteri sono tubi dritti che proviene dal dotto nephric. Dopo in erba dal dotto nephric al giorno embrionale 10.5 (e 10.5) nel topo, il gambo di uretere si allunga e differenzia in una struttura multistrata denominata urothelium che è impermeabile tra mouse 12.5 ed E16.5. Le cellule mesenchimali che circondano il gambo dell'uretere sono anche differenziate in tre strati composto da cellule stromali interne, cellule di muscolo liscio spessore intermedio e fibroblasti adventitial esterni. Le onde peristaltiche ureterale avvio nella pelvi renale vengono propagate attraverso lo strato di muscolo liscio della parete dell'uretere alla vescica per il trasporto di urine2,3, che è prodotto a partire da E16.5 in mouse1.
Anomalie congenite del rene e delle vie urinarie (CAKUT) sono tra le più frequenti malattie genetiche, presente in circa 1% dei feti umani1,4e composto di una varietà di fenotipi compreso idronefrosi e hydroureter. L'abnorme accumulo di urina nel rene e uretere provoca hydronephrotic del rene e hydroureter formazione. Una causa di formazione di idronefrosi e/o hydroureter è un'ostruzione delle vie urinarie. Ureteropelvic della giunzione (UPJO) è causato dal flusso di urina aberrante a causa di un blocco tra l'uretere prossimale e la pelvi renale, con conseguente idronefrosi e prossimale hydroureter restringimento con angolazione o persistente pieghevole5, 6. Inoltre, l'inserimento ectopica dell'uretere distale nella parete della vescica o del tratto riproduttivo viene chiamato ostruzione giunzione ureterovesical (UVJO). UVJO può anche indurre l'idronefrosi e hydromegaureter formazione7,8. Un difetto di giunzione (UVJ) ulteriori ureterovesical è reflusso vesicoureteric (RVU). VUR è caratterizzata da flusso retrogrado dell'urina dalla vescica verso il rene presso UVJ. Rispetto al UVJO, perinatali embrioni con VUR non distintamente mostrano un rene hydronephrotic dilatato o grave hydroureter fenotipo9.
Nel topo di laboratorio, il flusso di urina può essere esaminato tramite l'iniezione di un colorante, come il blu di metilene, nel bacino renale9. La soluzione di injectedmethylene blu si traccia la traiettoria di urina dalla pelvi renale attraverso l'uretere e la vescica. Idronefrosi possono essere riconosciuto da un'espansione del colorante nel rene. UPJO può essere rilevato come un blocco del flusso di tintura all'uretere prossimale con pelvi renale dilatata5. Qualsiasi dilatazione dell'uretere indicato da un diametro allargato di seguito viene illustrato un esempio di hydroureter. Infine, accumulo di colorante alla parete della vescica o presso il sito del tratto riproduttivo indica UVJO con rene hydronephrotic dilatato e dilatato hydromegaureter7,10. Per rilevare VUR, la soluzione colorante viene iniettata nella vescica e conseguente flusso retrogrado è monitorato nel rene9.
Qui, un protocollo per l'iniezione di colorante blu di metilene nella pelvi renale di un embrione perinatale è presentato. Questo protocollo permette l'analisi del flusso di urina dalla pelvi renale attraverso l'uretere e la vescica e verifica potenziali ostacoli di giunzione delle vie urinarie come UPJO o UVJO.

<table width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:295px;height:21px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">M9140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:295px;height:42px;">Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML</td>
			<td style="width:197px;">Fisherscientific</td>
			<td>50-983-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:295px;height:42px;">3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:295px;height:42px;">Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane</td>
			<td style="width:197px;">Pall corporation</td>
			<td style="width:127px;">4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:295px;height:42px;">Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4&#34; 12&#34;&#160;</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td style="width:127px;">26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate Operating Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:295px;height:21px;">Micro Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:295px;height:21px;">Dumont Tweezers; Pattern #5</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:295px;height:21px;">BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2&#34;</td>
			<td style="width:197px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing urinary tract junction obstruction defects by methylene blue dye injection

Difetti di ostruzione delle vie urinarie giunzione sono anomalie congenite inducendo idronefrosi e hydroureter. Difetti di ostruzione giunzione murino delle vie urinarie possono essere valutati da monitorando il flusso di colorante blu di metilene all'interno del sistema urinario. Blu di metilene colorante viene iniettato nella pelvi renale dei reni embrionali perinatale e flusso di tintura è monitorato dalla pelvi renale del rene attraverso l'uretere e nel lume della vescica dopo l'applicazione di pressione idrostatica. Accumulo di colorante sarà evidente nel lume della vescica dell'apparato urinario perinatale normale, ma sarà vincolata tra pelvi renale e il punto finale di un uretere anormale, in caso di ostruzioni delle vie urinarie. Questo metodo facilita la conferma delle ostruzioni di giunzione delle vie urinarie e visualizzazione di idronefrosi e hydroureter. Questo manoscritto descrive un protocollo per l'iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale per confermare ostruzioni di giunzione delle vie urinarie.

I reni e il sistema urinario inferiore si trovano dorsale alla maggior parte degli altri organi interni come il fegato ed intestino. Dopo la rimozione di questi altri organi interni, una coppia di reni e ureteri e vescica una singola sono visibili (Figura 1A). Al momento di successo dissezione, il colorante iniettato nella pelvi renale fluirà dal rene nella vescica tramite l'uretere. La pelvi renale è la parte prossimale dilatata imbuto dell'uretere nel rene. Pertanto, il punto di iniezione del colorante è vicino l'uretere prossimale visibile collegato con il rene come indicato con frecce nere (Figura 1B-1C). Dopo l'iniezione con soluzione colorante blu di metilene in un rene, il colorante scorre dalla pelvi renale attraverso l'uretere e nella vescica causando una colorazione blu visibile nel lume dell'uretere e della vescica, se non sono presenti ostruzioni delle vie urinarie (Figura 1B ). La soluzione colorante di solito scomparirà in un uretere normale rapidamente anche prima di formazione immagine e il colore della tintura nell'uretere è debole perché l'uretere normale è un tubo sottile. Tuttavia, flusso di tintura nell'uretere può essere osservata con un microscopio per dissezione. Un forte colore blu nel lume della vescica appare come il risultato di un flusso più lungo di circa 20 s in totale dopo l'iniezione di entrambi i reni con la soluzione di colorante (Figura 1). Accumulo di colorante nella vescica dopo l'iniezione controlaterale indica che il secondo sistema urinario non dispone di alcuna ostruzione della giunzione delle vie urinarie.
È ragionevole iniettare un rene ovviamente anormale prima per confermare eventuali ostruzioni di giunzione delle vie urinarie. Reni hydronephrotic anormali possono essere riconosciuti dai loro più grande la dimensione o la superficie sottile trasparente con un esteso bacino renale. Un rene hydronephrotic dilatato di esempio e un hydroureter anormalmente dilatate sono raffigurati nella Figura 2A. Un hydroureter dilatata provoca solitamente una visualizzazione molto più forte perché il suo volume espanso conserva soluzione colorante molto di più rispetto a un normale, sottile dell'uretere. Se i reni e/o gli ureteri sono danneggiati durante la dissezione, l'esame delle ostruzioni di giunzione delle vie urinarie è impossibile perché il colorante colerà aberrante al sito danneggiato. Ad esempio, il hydroureter anormale nella Figura 2A è stato danneggiato nel suo centro e, di conseguenza, la posizione finale della soluzione colorante è chiara e UVJO non può essere verificato nonostante l'assenza del colorante nel lume della vescica (Figura 2A). Tuttavia, questo sistema urinario perinatale con hydroureter dilatata e rene hydronephrotic dilatato può avere UVJO come l'uretere è allargato lungo la sua lunghezza e il rene è dilatato distintamente. Il sistema urinario controlaterale appare normale ha un uretere sottile ed il colorante entra successivamente il lume della vescica (Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56247/56247fig1.jpg"> 
Figura 1. Esempi di iniezione della tintura del blu di metilene in un normale sistema urinario. (A) un'immagine tipica del sistema urinario da un embrione perinatale (e 19.5) dopo la rimozione del tessuto in eccesso. Due reni, due ureteri e vescica sono visti con gli organi riproduttivi, qui testicoli (B) un esempio di inserimento del tracciante in un rene normale. Un punto di iniezione nella pelvi renale del rene (freccia nera) può essere visto. Un colore tintura debole è visibile nell'uretere e il lume della vescica dopo consentendo la tintura a fluire per 5 s. accumulo di colorante (C) nel lume della vescica dopo l'iniezione di entrambi i reni normali. Il colore diventa forte dall'accumulazione della soluzione colorante nel lume della vescica dopo consentendo la tintura di fluire per 20 s. La pelvi renale è anche visibile con il colore della tintura debole nel rene. B: vescica, t: testicolo, k: rene, uretere u:. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56247/56247fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56247/56247fig2.jpg"> 
Figura 2. Esempi di blu di metilene tingono iniezione in un sistema urinario con unilaterale hydroureter. (A) un esempio di inserimento del tracciante in un sistema urinario con un hydroureter e un rene hydronephrotic di un cucciolo femmina neonatale con flusso di tintura di 15 s. Il rene hydronephrotic è chiaramente più grande di rene controlaterale. L'uretere corrispondente è dilatata e il colore della tintura è fortemente riconoscibile ma il hydroureter è chiaramente danneggiato come osservato da fuoriuscite di soluzione colorante nella cavità del corpo. (B) l'iniezione della tintura nel rene controlaterale di un sistema urinario con unilaterale hydroureter con flusso di tintura di 20 s. soluzione colorante iniettato in rene normale si accumula nel lume della vescica che conferma che l'anomalia è unilaterale. B: vescica, HK: rene hydronephrotic, HU: hydroureter k: rene, uretere u:, Ut: corno uterino. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56247/56247fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale facilita la valutazione dei difetti di ostruzione delle vie urinarie giunzione durante lo sviluppo embrionale dell'apparato urinario del mouse. Qui, un protocollo per l'iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale è descritto.

Valutazione difetti di ostruzione delle vie urinarie Junction iniettando colorante blu di metilene

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...

assessing-urinary-tract-junction-obstruction-defects-methylene-blue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K Views.  National Institutes of Health. Iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale facilita la valutazione dei difetti di ostruzione delle vie urinarie giunzione durante lo sviluppo embrionale dell'apparato urinario del mouse. Qui, un protocollo per l'iniezione della tintura del blu di metilene nella pelvi renale è descritto.

Video: Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

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Biologia

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafish Cervello iniezione ventricolo

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

L&#39;impianto di Ferumoxides etichetta cellule staminali mesenchimali in difetti della cartilagine

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

L&#39;interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Un modello murino di ostruzione intestinale parziale

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and pathological roles, there is need of high-throughput screening (HTS) assays to identify GJ modulators in drug discovery and toxicology assays. A novel iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication (I-YFP-GJIC) assay fulfills this need. It is a cell-based assay including acceptor and donor cells that are engineered to stably express a yellow fluorescent protein (YFP) variant, whose fluorescence is sensitively quenched by iodide, or SLC26A4, an iodide transporter, respectively. When iodide is added to a mixed culture of the two cell types, they enter the donor cells via the SLC26A4 transporter and diffuse to the adjacent acceptor cells via GJs where they quench the YFP fluorescence. YFP fluorescence is measured well by well in a kinetic mode. The YFP quenching rate reflects GJ activity. The assay is reliable and rapid enough to be used for HTS. The protocol for the I-YFP-GJIC assay using the LN215 cells, human glioma cells, is described.

Here, we present a protocol for a novel gap junction intercellular communication assay designed for the high-throughput screening of gap junction-modulating chemicals for drug discovery and toxicological assessment.

Un saggio di comunicazione intercellulare Junction ioduro-giallo fluorescente proteina-Gap

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

Metodo Ex Vivo per valutare la motilità spontanea del tratto riproduttivo del mouse e un algoritmo di tracciamento del movimento uterico basato su MATLAB per l'analisi dei dati

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

Valutazione difetti di ostruzione delle vie urinarie Junction iniettando colorante blu di metilene

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