Questo studio è stato sostenuto dai nazionali di ricerca, sviluppo e innovazione ufficio d'Ungheria (grant 116912 a MÀY), l'ufficio di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE), al programma di borse di Hungaricum Stipendium (grant a ZM) e il nuovo Hungarian National eccellenza Predoctoral Fellowship (grant a EK).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati il diritto ungherese del benessere animale.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Soluzioni di riserva<ol>
<li>Preparare 1 M trealosio aggiungendo 0,378 g di trealosio diidrato in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare 1 M saccarosio aggiungendo 0,342 g di saccarosio in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare 1 M HEPES aggiungendo 0,238 g di HEPES a 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare della collagenosi 20 mg/mL (290 U/mg) con l'aggiunta di 100 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare la tripsina 15mg/mL (~ 10000 U/mg) con l'aggiunta di 75 mg per 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare 1 mg/mL dnasi I (~ 3000 U/mg) con l'aggiunta di 5 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare 0,4% trypan blu aggiungendo 40 mg di trypan blu a 10 mL di PBS. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 1 mL in provette da 1,5 mL.</li>
		<li>Preparare 200 mg/L MS-222 (tricaina solfonato di metano) con l'aggiunta di 200 mg di MS-222 in 1 L di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente. Inoltre, soluzione tampone il MS-222 con bicarbonato di sodio per un pH neutro di 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzioni per la vitrificazione<ol>
<li>Preparare la soluzione di equilibrazione (ES): preparare 2 mL di ES mescolando 121,5 µ l di metanolo (MeOH; 1,5 M), 220 µ l di glicole propilenico (PG; 1,5 M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di soluzione madre HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l di L-15 in un 2 tubo da mL.</li>
		<li>Preparare la soluzione di vitrificazione (VS): preparare 2 mL di VS mescolando 439 µ l di PG (3 M), 426 µ l di solfossido dimetilico (Me2così; 3M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di HEPES stock soluzione (25 mM) e 685 µ l di L-15 in un provetta da 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzioni per il riscaldamento<ol>
<li>Preparare la soluzione di riscaldamento 1 (WS1): preparare 1,5 mL di WS1 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 450 µ l di soluzione madre di saccarosio (3 M) e 900 µ l di L-15.</li>
		<li>Preparare soluzione scaldavivande 2 (WS2): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 150 µ l di soluzione madre di saccarosio (1 M) e 1200 µ l di L-15.</li>
		<li>Preparare la soluzione di riscaldamento 3 (WS3): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL di miscelazione 150 µ l di FBS (10%) e 1350 µ l di L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione di digestione: per ogni campione preparare 500 µ l della soluzione digestione mescolando 50 µ l di soluzione madre di collagenasi (2 mg/mL), 50 µ l di soluzione madre di tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l di dnasi I (20 µ g/mL) e 390 µ l di L-15 in un mL 2 tubo.</li>
	<li>Ottenere strumenti di dissezione: forbici, microforbici, pinzette, Pinzette curve e aghi per agopuntura.</li>
</ol>2. testicoli collezione
<ol><li>Eutanasia il pesce mettendolo in un piatto contenente 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Prima di continuare con la dissezione, assicurarsi che le branchie hanno smesso di muoversi e che almeno 10 minuti sono passati da quel momento per garantire la morte da ipossia.</li>
	<li>Asciugate il pesce da pacche su un tovagliolo di carta e posizionarlo sul lato dorsale su una stuoia di dissezione.<ol>
<li>In primo luogo tagliare le pinne pettorali e pelviche per dissezione più facile.</li>
		<li>Orizzontalmente snip la pelle sul ventre del pesce tra le pinne pettorali e tagliare la pelle e il muscolo di fondo lungo il ventre fino alla pinna anale.</li>
		<li>Aprire la cavità del corpo del pesce e il pin la parete del corpo sinistra e destra al tappeto di dissezione con aghi. Nota: I testicoli si trovano sopra gli organi gastrointestinali su entrambi i lati della vescica natatoria (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per evitare la contaminazione, non estrarre gli organi gastrointestinali, ma delicatamente spingerle verso un lato e rimuovere il testicolo dal lato avversario. Testicoli sono collegati alla parete del corpo quindi rimuoverli con attenzione e tagliare il collegamento peritoneo di microforbici.</li>
	<li>Inoltre, al fine di prevenire la contaminazione, in primo luogo sterilizzare i testicoli da metterli in etanolo al 70% per 2 s e quindi posto loro in L-15 su una piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio. Nota: Se è necessario, testicoli puliti dal tessuto adiposo e grandi vasi precisamente sotto lo stereomicroscopio sanguigni</li>
</ol>3. ultra-rapido raffreddamento del tessuto testicolare
<ol><li>Aghi di Mark con etichette appropriate a seconda del campione digitare e preparano l'equilibrazione (ES) e soluzioni di vitrificazione (VS).</li>
	<li>Trasferire i testicoli in una piastra ben più grande o piatto e perno a due testicoli (o più a seconda delle dimensioni dell'ago) su un ago di agopuntura sterili.<ol>
<li>In primo luogo posizione del testicolo in cima curve pinzette. Mettere la punta dell'ago nel mezzo del testicolo e tirare verso l'alto il testicolo con le pinzette.</li>
		<li>Dopo perforazione del testicolo, tirarlo delicatamente verso l'alto verso la parte superiore dell'ago. Assicurarsi che i testicoli sono separati gli uni dagli altri e che non vengano a cadere o scivolare giù.</li>
		<li>Luogo pieno di aghi con i testicoli appuntati in una provetta da 2 mL con L-15 fino a vetrificazione (a 25 ˚ c; tempo di conservazione non deve superare 1 h). Nota: Pinning i testicoli dell'ago dovrebbe essere fatto velocemente per evitare i testicoli dall'asciugarsi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire l'ago con i testicoli in soluzione di equilibrazione e incubare per 5 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Trasferire l'ago nella soluzione di vitrificazione e incubare per 30 s a 25 ˚ c.</li>
	<li>Rimuovere l'ago dalla soluzione di vitrificazione, rapidamente e delicatamente assorbire la soluzione rimanente dal tessuto di un tovagliolo di carta sterile. Usare cautela per evitare i testicoli che attacca per il tovagliolo di carta o cadere.</li>
	<li>Inserire rapidamente l'ago nell'azoto liquido, posizionato in una scatola di polistirolo. Nota: Fare questo passo rapidamente per evitare l'esposizione del tessuto per il vapore di azoto liquido. Utilizzare volumi bassi di azoto liquido per evitare la contaminazione incrociata dei campioni.</li>
	<li>Tenere l'ago in azoto liquido in una scatola di polistirolo chiusa per 5-10 min.</li>
	<li>Preraffreddare un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA aperto 4,5 mL e il tappo nella stessa casella.</li>
	<li>Dopo 5-10 min, trasferire ogni ago in un separato stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA sotto la superficie dell'azoto liquido e chiudere lo stoccaggio provette criogenia. Attenzione: Utilizzare sempre abbigliamento protettivo (quali guanti isolanti) quando lavorare con azoto liquido come esposizione può portare a gravi congelamenti.</li>
	<li>Posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA su una canna di metallo e posizionarlo nel sebatoio criobanca velocemente come possibile. Conservare i campioni in un deposito di contenitore dewar fino all'ulteriore utilizzo.</li>
</ol>4. procedura di riscaldamento
<ol><li>Riscaldare ogni ago separatamente. Tutte le soluzioni di riscaldamento dovrebbero essere a 25 ° C.</li>
	<li>Staccare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA dalla canna in metallo e immergerlo nell'azoto liquido memorizzato in una scatola di polistirolo.</li>
	<li>Aprire lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA nel vapore di azoto liquido (utilizzando forcipe) e rilasciare l'ago nell'azoto liquido.</li>
	<li>Trasferire l'ago molto veloce nella prima soluzione di riscaldamento e incubare per 1 min (a 25 ° C). Assicurarsi di trasferire l'ago rapidamente per evitare il suo riscaldamento nell'aria durante il trasferimento.</li>
	<li>Trasferire l'ago nella seconda soluzione scaldavivande e incubare per 3 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Trasferire l'ago nella terza soluzione scaldavivande e incubare per 5 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Rilasciare i testicoli dall'ago di facendole scorrere verso il basso con una pinzetta curva. Luogo ogni testicolo riscaldato individualmente in un pozzo separato (piastra a 96 pozzetti) riempito con 250 µ l di L-15 supplementato con 10% FBS. Assicurarsi che i pozzi sono etichettati secondo il campione. Tenere la piastra ben su ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono riscaldati e fino ad ulteriore lavoro.</li>
</ol>5. tessuto digestione
<ol><li>Preparare 500 µ l di soluzione di dissociazione per ciascun campione in provette separate da 2 mL. Etichettare le provette secondo il codice del campione. Incubare la soluzione preparata dissociazione per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere il tessuto riscaldato nella soluzione di digestione e tagliarlo in piccoli pezzi da almeno 30 movimenti di piccole forbici.</li>
	<li>Incubare il tessuto tagliato su una piastra di agitazione per 90 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Interrompere il processo di digestione aggiungendo 400 µ l di L-15 e 100 µ l di FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitare bene la soluzione e incubare per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtrare la soluzione ottenuta attraverso 50 µm filtri in una provetta da 1,5 mL. Etichettare le provette di conseguenza.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione filtrata a 200 × g per 10 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 20 µ l di L15 supplementato con 10% FBS. Agitare manualmente il tubo fino a che il pellet sia completamente disciolta. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio o a 4 ° c fino al successivo utilizzo.</li>
</ol>6. valutazione vitalità e conta cellulare
<ol><li>Mix 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di soluzione di blu di trypan 0,4% in una provetta PCR adeguatamente etichettata 0,2 mL. Se vengono utilizzati diversi volumi, assicurarsi che il rapporto di diluizione di 1:1 rimane.</li>
	<li>Incubare la sospensione per 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Verifica la fattibilità di ogni campione in un emocitometro sotto il microscopio.</li>
	<li>Contare il numero di cellule vive (senza macchia di tripan blu) in 15 campi. Calcolare il numero totale di cellule in 20 µm della sospensione delle cellule. La sospensione è ora pronta per qualsiasi applicazione a valle. Nota: Quando si ottimizza la procedura per le altre specie con corpo più grande, utilizzare frammenti di testicolo di uguale peso. Utilizzare testicoli da un individuo per tutti i gruppi sperimentali al fine di evitare la variabilità individuale nei risultati. Nel caso di zebrafish, abbiamo approfittato del fatto che sinistra e testicolo di destra deve contenere un numero pari (o molto simile) di cellule germinali13 (vedere i risultati di rappresentante). Il testicolo di sinistra è stato mantenuto come controllo mentre il testicolo di destra era vetrificato/riscaldati. Percentuale di redditività è stato calcolato il numero di cellule isolate dal testicolo vetrificato/riscaldato rispetto al numero di cellule isolate dal testicolo fresco.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. 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Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso ultra-rapida procedura di raffreddamento sviluppato per specie di uccelli e mammiferi10,11,12 per la crioconservazione del testicolo di pesce (zebrafish come modello organismo). La maggior parte degli studi precedenti per quanto riguarda la crioconservazione delle risorse genetiche di zebrafish erano principalmente concentrata sulla crioconservazione di zebrafish spermatozoi2,3,4. Tuttavia, non sono stati sviluppati protocolli per la crioconservazione di ovociti maturi ed embrioni ancora, anche se alcuni studi recenti dimostrano che la crioconservazione di ovociti in fase iniziale è plausibile14,15. In questo studio abbiamo dimostrato successo crioconservazione degli spermatogoni di zebrafish che offre nuove possibilità per la conservazione delle preziose risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili5 .
Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo studio è affrontare il raffreddamento ultra-rapido di zebrafish tessuto dal metodo NIV. Simili studi hanno incluso vetrificazione dei testicoli di zebrafish 0,25 mL cannucce di plastica16 e vetrificazione delle ovaie di zebrafish in contenitori metallici chiusi14. Il vantaggio principale di NIV rispetto ai due contenitori accennati è l'esposizione diretta dei testicoli per azoto liquido con volumi minimi di crioprotettori essere attaccati a loro, quindi massimizzare il tasso di raffreddamento10. L'aumento della velocità di raffreddamento riduce la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità. Inoltre, tutti i pezzi di tessuto possono essere esposti al crioprotettori e azoto liquido in modo sincrono. Tuttavia, l'esposizione diretta di azoto liquido potrebbe essere uno svantaggio per quanto riguarda la contaminazione incrociata. È possibile che i batteri o virus sono presenti nell'azoto liquido e che l'esposizione diretta del tessuto può portare alla contaminazione. Pertanto, consigliamo di astenersi dal riutilizzo di azoto liquido quando lo svolgimento di NIV e scartare l'azoto liquido usato dopo il raffreddamento. Proposto contenitori metallici offrono vantaggi a questo proposito14, tuttavia erano personalizzati fatto e non sono facilmente accessibili a tutti i laboratori.
Quando si confrontano raffreddamento ultra-rapido a lento-tasso di congelamento, un vantaggio cruciale di raffreddamento ultra-rapido è l'assenza di spermatozoi dopo la digestione. Metodi di congelamento lento-tasso ha dimostrato in alcune specie di Pesci carpa che protocolli simili rendimento comparabile vitalità di sia le cellule di germe iniziale e spermatozoi17 conseguente numero di spermatozoi elevato dopo digestione del crioconservati tessuto. I nostri risultati in zebrafish (studio presente), carpa comune e pesci rossi (dati non pubblicati) indicano che ci sono pochissimi spermatozoi dopo digestione dei tessuti riscaldati e che essi non sopravvivere questa procedura e ottenere digerito che semplifica a valle applicazioni poiché nessuna procedura ulteriore arricchimento è necessari.
Ci sono diversi passaggi critici all'interno di questo protocollo. Il primo è quello di evitare qualsiasi contaminazione durante il processo di isolamento, dal momento che può portare ad una diminuzione del numero di cellule ottenute e può ostacolare eventuali applicazioni a valle. Uno dei passaggi cruciali è l'asportazione dei testicoli dove la contaminazione batterica può verificarsi da danneggiato budella (quindi è meglio non ferire o rimuovere completamente l'intestino) o dalla pelle se utilizza lo stesso strumento di dissezione per tagliare la pelle e la rimozione del testicoli. In secondo luogo, fare attenzione quando il blocco di testicoli all'ago di agopuntura poiché è possibile che i testicoli cadono o scivolare verso il basso. Attualmente, stiamo testando diversi metodi per impedire che i testicoli scorrevole durante la procedura di vitrificazione (temperatura dell'azoto liquido). In terzo luogo, prestare attenzione al periodo di esposizione per i crioprotettori. L'esposizione dei testicoli (e quindi le cellule) ad alta concentrazione di crioprotettore (soprattutto nella soluzione vitrificazione) per troppo tempo può condurre alla morte delle cellule dovuto la tossicità crioprotettore. Inoltre, prestare attenzione quando immergersi gli aghi in azoto liquido; pulire l'eccesso di VS, dal momento che può influenzare il processo di raffreddamento e immergersi rapidamente gli aghi al fine di evitare l'esposizione al vapore di azoto liquido. Infine, trasferire i testicoli da azoto liquido in media riscaldamento rapidamente al fine di evitare la prematura riscaldamento nell'aria durante il trasferimento.
Nel presente documento presentiamo la procedura per la crioconservazione dei testicoli da cinque ceppi di zebrafish usando MeOH, PG e Me2così come permeando crioprotettori. Il metodo produce risultati affidabili per tutti i ceppi testati zebrafish con una vitalità cellulare di oltre il 50%. È possibile utilizzare questo metodo con modifiche per altre specie, pure. In primo luogo, ogni protocollo di crioconservazione è specie-specifici e differenti crioprotettori producono efficienze diverse nelle diverse specie (cioè il glicole etilenico ha reso la più alta redditività in acipenserids18 mentre io2così ha reso la più alta redditività salmonidi19 e ciprinidi17). Inoltre si dovrebbe prestare attenzione alle concentrazioni utilizzate pure. Lo studio presente e lo studio condotto su trota fario Salmo trutta ovaie15 dimostrano che i risultati migliori si ottengono utilizzando la stessa concentrazione di due crioprotettori, tuttavia questo può variare in altre specie. Infine, zebrafish testicoli sono molto piccole, ed è anche possibile di pin diversi testicoli su un ago. Quando si lavora con specie con i testicoli più grandi, le dimensioni dei pezzi testicolare che vengono utilizzati sono un fattore molto importante. Si consiglia di aumentare i tempi di esposizione per pezzi più grandi di tessuto tenendo conto crioprotettore tossicità e di efficienza.

Nuove tendenze nella scienza e nella biotecnologia hanno portato alla creazione di migliaia di nuove linee mutanti di topo, Drosophila, zebrafish e altre specie utilizzate come organismi modello in biomedica e altre scienze1. Inoltre, come nuove tecnologie vengono sviluppate e diventano disponibili, i numeri di linee mutanti costantemente aumentano2. Questo porta alla necessità per una conservazione sicura delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Come un metodo che consente l'archiviazione sicura delle risorse genetiche per un periodo di tempo indefinito, crioconservazione offre molti vantaggi come estensione della stagione riproduttiva, aggira la necessità per la manutenzione continua dei riproduttori, ed è più costo - e Labor-efficiente2.
Protocolli per la crioconservazione di spermatozoi sviluppato durante il passato parecchi anni2,3,4 offrono la possibilità di successo deposito di materiale genetico maschile di zebrafish. Tuttavia, la crioconservazione degli ovuli o embrioni di pesce non è ancora possibile grazie alla loro struttura complessa e di grandi quantità di materiale di tuorlo. Recentemente, la pratica del trapianto di cellule primordiali germinali (PGC) o cellule staminali spermatogoniali (SSCs) offre un bypass per questa barriera di svilupparsi dopo trapianto5in funzionali degli spermatozoi e uova. Crioconservazione delle CSS offre quindi una nuova frontiera nella conservazione delle risorse genetiche rare e preziose.
Anche se crioconservazione offre molti vantaggi, il processo di congelamento lento-tasso genera diverse condizioni che possono portare a cella danno2. Questi includono la formazione di ghiaccio intracellulare ed extracellulare, disidratazione, tossicità crioprotettore e altri. Ghiaccio intracellulare danneggia le cellule, ghiaccio extracellulare può portare a frantumazione meccanica delle cellule, mentre la diffusione dell'acqua dalle cellule durante il congelamento lento-tasso può condurre a disidratazione6. Recentemente, vetrificazione come una tecnica che impedisce gli effetti negativi della formazione di ghiaccio è stata applicata nella crioconservazione di gameti di pesce7,8,9. Esso presenta una tecnica di raffreddamento ultra-rapida attraverso il quale i mezzi di comunicazione interne ed esterne trasformare in uno stato amorfo/vetroso senza cristallizzazione in ghiaccio7,10. Vetrificazione successo del tessuto testicolare e ovarico è stata provata in specie di uccelli e mammiferi10,11,12, aprendo così la possibilità per la sua applicazione in pesce, pure.
In questo studio, presentiamo la procedura di vitrificazione (NIV) ago immerso per la crioconservazione di zebrafish tutta i testicoli. Dimostriamo un metodo affidabile per l'isolamento di cellule germinali di zebrafish fase iniziale senza contaminazione e un processo di crioconservazione che produce quantità elevate relativamente precoce delle cellule di germe con una bassa presenza di altre cellule, soprattutto gli spermatozoi. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo studio a dimostrare un protocollo dettagliato visualizzato in quel momento per ultra-rapido raffreddamento del tessuto gonadico pesce e cellule germinali zebrafish. Inoltre, è evidenziato la ripetibilità del metodo in cinque differenti zebrafish ceppi: AB wild-type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linea transgenica di Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

Attuali tendenze nella scienza e nella biotecnologia portano alla creazione di migliaia di nuove linee in organismi modello, determinando così la necessità di nuovi metodi per la conservazione delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Crioconservazione delle cellule di germe iniziale di testicoli interi NIV offre possibilità per lo stoccaggio di zebrafish risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili. Testicoli sono stati asportati, appuntato su un ago di agopuntura, equilibrato in due mezzi di Crioprotettivi (soluzione di equilibrazione contenente metanolo di 1,5 M e 1,5 M glicole propilenico; e soluzione di vitrificazione contenente dimetilsolfossido di 3 M e 3 M glicole propilenico) e ' immerso in azoto liquido. I campioni venivano riscaldati in una serie di tre soluzioni di riscaldamento conseguente. I principali vantaggi di questa tecnica sono (1) la mancanza di spermatozoi dopo digestione dei testicoli riscaldati, facilitando così le manipolazioni a valle; (2) ultra-rapido raffreddamento che permette l'esposizione ottima dei tessuti a azoto liquido quindi massimizzare il raffreddamento e ridurre la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità; (3) esposizione sincrono dei testicoli parecchie ai crioprotettori e azoto liquido; e ripetibilità (4) dimostra come ottenere redditività di oltre il 50% in cinque differenti zebrafish ceppi.

In media, il numero delle cellule di germe iniziale isolato da un testicolo singolo zebrafish fresco variava tra 40.000 e 200.000 cellule a seconda delle dimensioni del pesce. Quando nei testicoli di zebrafish fresco in tutti i 5 ceppi di digestione, cellule germinali primi non erano sola cellule presenti nelle sospensioni delle cellule (Figura 2). Al lato delle cellule di germe iniziale, numerosi gli spermatozoi sono stati trovati pure. D'altra parte, c'erano molto meno spermatozoi dopo digestione dei testicoli crioconservati. Questo indicato che gli spermatozoi non sopravvivono questo protocollo di raffreddamento ultra-rapido, e che sono molto probabilmente eliminato durante il processo di digestione, che produce una sospensione molto pulita delle cellule di germe della presto-fase.
Non c'erano differenze significative nel numero di cellule germinali precoce tra i testicoli di sinistra e destra (1 ± 0,5 × 105 vs 1.1 ± 0.7 × 105) di un singolo individuo ha dimostrato digerendo freschi testicoli dei maschi di tre AB zebrafish (One-way ANOVA ; F (1,4) = 0,04, p = 0.85). In tutte le linee di zebrafish utilizzate in questo studio, l'attuale protocollo di raffreddamento ultra-rapido dato i tassi di redditività media superiore al 50% (tabella 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>AB wild-type</td>
			<td>Casper</td>
			<td>Leopardo</td>
			<td>Vasa transgenici</td>
			<td>Tumore di Wilms transgenico</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Numero di cellule vive (10 ×4)</td>
			<td>Testicolo fresco</td>
			<td>14,5 ± 3,9</td>
			<td>9,5 ± 2.3</td>
			<td>12,7 ± 2.4</td>
			<td>14,5 ± 5,6</td>
			<td>4,8 ± 1,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Testicolo vetrificato</td>
			<td>8.7 ± 2.8</td>
			<td>7,2 ± 3.0</td>
			<td>8.8 ± 1.7</td>
			<td>7.6 ± 3,7</td>
			<td>2.4 ± 0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitalità (%)</td>
			<td></td>
			<td>58 ± 9</td>
			<td>72 ± 13</td>
			<td>69 ± 1</td>
			<td>50 ± 6</td>
			<td>53 ± 13</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Numero di cellule vive e le percentuali di redditività (media ± DS) ottenute dal testicolo di zebrafish freschi o vetrificato/riscaldato. I risultati sono presentati per le cinque linee di zebrafish testata: AB wild-type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linea transgenica di Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)].
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56118/56118fig1.jpg"> Figura 1. Zebrafish adulto dissecata dimostrando la posizione delle varie strutture anatomiche. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56118/56118fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56118/56118fig2.jpg"> Nella figura 2. Le cellule di sospensioni preparate dal tessuto testicolare di zebrafish fresco e vetrificate, riscaldato da cinque linee di zebrafish testata (AB wild type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)] linea transgenica) imaged con microscopia di contrasto di fase. Barra della scala: 40 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56118/56118fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  Szent István University. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genetica

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Biologia

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Fare Diploide Zebrafish Gynogenetic di Pressure presto

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Rabbit Embryo Vitrification Using Cryogenic Straw:  An Ultra-Rapid Cooling Technique to Preserve Rabbit Embryos for Long-term Storage

For embryonic vitrification, immerse the embryos in equilibrating solution for 2 minutes, followed by a 1-minute incubation in vitrification solution. At the end of the incubation, load the embryos into a 125-microliter plastic ministraw, and couple the closed end of the straw with an appropriate 1-milliliter microdispenser. Aspirate base medium up to one-third of the straw length, followed by a small air bubble.
Next, use a stereomicroscope to aspirate the embryos in 40 microliters of vitrification solution, followed by another small air bubble in enough base medium to move first liquid fraction up to the cotton end of the ministraw. Then, close the opened end of the ministraw with a straw plug, plunge the ministraw directly into liquid nitrogen to achieve vitrification, and store the ministraw in a liquid nitrogen dewar.

Vitrificazione di embrioni di coniglio con paglia criogenica: una tecnica di raffreddamento ultrarapido per conservare embrioni di coniglio per la conservazione a lungo termine