Si ringrazia il Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo l'unità di Imaging di cella del centro di ricerca per la loro assistenza tecnica. M.-é. Huot è un Junior 1 Research Scholar del Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Questo lavoro è stato supportato dal canadese istituti di salute ricerca (grant numero CIHR, MOP-286437 a M.-É. Huot).

1. determinazione delle condizioni di Puromycilation Nota: questa tecnica viene descritto il metodo utilizzato per valutare la versione localizzata durante il processo di MRC-5 cella adesione 5. Come puromycilation può essere fatto in qualsiasi cella, è importante ottimizzare le condizioni di puromycilation per le linee cellulari specifiche da utilizzare, poiché le condizioni di trattamento non sono identiche per ogni linea cellulare in termini di concentrazione con puromicina e la desiderata tempo di incubazione. Per mostrare come queste condizioni sono definite, tre linee cellulari di esempio (vale a dire, HeLa, MRC-5 e Huh-7) sono stati trattati con aumento delle concentrazioni di con puromicina per tempi diversi di incubazione ( Figura 1).
<ol><li>Grow identico numero di cellule in una piastra a 24 pozzetti in 0,5 mL di appropriato completa terreno di coltura 16 h prima del test. Cellule MRC-5 semi 30.000, 50.000 cellule HeLa o 50.000 HuH-7 cellule per pozzetto. Assicurarsi che evitare di superare la confluenza di 60-70% (Figura 1A).</li>
	<li>Preparare 6 tubi con 1,5 mL di terreno di coltura cellulare completo con aumento delle concentrazioni di con puromicina (0, 5, 10, 15, 20 e 30 µ g/mL). Pre-riscaldare a 37 ° C.</li>
	<li>Per ogni concentrazione con puromicina terreno (preparato in passaggio 1.2), di trasferire 0,5 mL da ciascuna tube in 6 nuovi tubi e aggiungere cicloesimmide ad una concentrazione finale di 50 µ g/mL per tutti i 6 nuovi tubi. Pre-riscaldare a 37 ° C.</li>
	<li>Cambiare il mezzo con 0,5 mL di terreno di coltura completa (riga 1 e 2). Per la terza riga, aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura completa addizionata di 50 µ g/mL di cicloesimmide ( Figura 1B). 
	Nota: Il trattamento del cicloesimmide è stato stabilito come il miglior controllo negativo per proteina puromycilation grazie alla sua capacità di bloccare l'allungamento di traduzione. Poiché l'incorporazione con puromicina richiede allungamento di traduzione, il trattamento del cicloesimmide conduce ad una perdita di puromycilated proteina segnali 5 , 18.</li>
	<li>Incubare per 15 min a 37 ° C (5% CO 2).</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di terreno con puromicina preparato al punto 1.2 alla seconda riga per ottenere le concentrazioni finali di 0, 2,5, 5, 7.5, 10 e 15 µ g/mL, rispettivamente, nelle colonne A, B, C, D, E e F. Allo stesso tempo, aggiungere 0,5 mL di con puromicina al medium cicloesimmide-completati (punto 1.3) nella terza riga ( Figura 1).</li>
	<li>Incubare per 5 min a 37 ° C (5% CO 2).</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di terreno con puromicina preparato al punto 1.2 alla prima riga per ottenere le concentrazioni finali di 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 e 15 µ g/mL ( Figura 1).</li>
	<li>Incubare per 5 min a 37 ° C (5% CO 2).</li>
	<li>Lavare ogni bene dal salino righe 1-3 con 1 mL di gelida 1x tamponata fosfato (PBS) 5 min dopo l'aggiunta di con puromicina pozzetti della prima riga (lavare due volte). Aggiungere 75 µ l di tampone X Laemmli 1 (4% sodio dodecil solfato (SDS), 4% 2-mercaptoetanolo, 0.120 M Tris-HCl pH 6.8, 0,004% blu di bromofenolo e 10% glicerolo) per ottenere lisati di cellule intere per ogni condizione.</li>
	Elettroforesi del gel di <li>Esegui 10% SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) con 1/3 dei campioni preparati per valutare incorporazione con puromicina.
	<ol><li>Determinare il livello di incorporazione con puromicina mediante Western blot usando un anticorpo anti-con puromicina (12 D 10) diluito in un rapporto di 1: 25 000 in tampone di incubazione anticorpo primario (2% albumina di siero bovino (BSA)), 430 mM NaCl, Tris 10 mM pH 7.4 e 0,01% sodio azide). 
		Nota: Immagini rappresentative, corrispondenti a differenti delle cellule linea estratti completati descritto nel passaggio 1 sono mostrati come esempi in Figura 2.</li>
	</ol></li></ol> 2. In Cellulo Localizzato visualizzazione traduzione Nota: la tecnica qui descritta è stata utilizzata per valutare la versione localizzata all'interno di SICs in cellule MRC-5 durante il processo di adesione 5. Anche se le cellule MRC-5 sono usate qui, altre linee cellulari possono essere utilizzati con la stessa metodologia descritta nel passaggio 2.1.
<ol><li>Preparazione di cell.
	<ol><li>Staccare MRC-5 celle utilizzando 0,25% tripsina/2,21 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in Hank &#39; s soluzione salina bilanciata (HBSS). Agglomerare le cellule mediante centrifugazione (5 min a 200 x g) in una provetta conica per centrifuga 15 mL e sospenderle in Dulbecco &#39; Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) a 40.000 cellule/mL dopo che conta con una camera di conteggio di s.</li>
		<li>Incubare le cellule sospese a 37 ° C in delicata rotazione utilizzando un rotatore tubo per 20 min per essere mantenute in sospensione. 
		Nota: Questo passaggio è fondamentale per consentire la completa dissociazione dei complessi di adesione focale.</li>
		<li>Piastra 2 mL di cellule MRC-5 sospese (40.000 cellule/mL) in due piatti di 35mm con fondo di vetro. Utilizzare il primo piatto di 35 mm con fondo di vetro per il dosaggio di puromycilation (Vedi punto 2.1.5) e utilizzare la seconda come controllo negativo (Vedi punto 2.1.6).</li>
		<li>Mantenere le cellule a 37 ° C (5% CO 2) per 55 min consentire adesione cellulare e formazione di SIC.</li>
		<li>Con puromicina. Aggiungi al mezzo nei piatti con fondo di vetro 35mm (saggio) usando la concentrazione precedentemente definita nella sezione 1. Per il trattamento di cellule MRC-5, utilizzare con puromicina. 10 µ g/mL per 5 min a 37 ° C (5% CO 2).</li>
		<li>Come controllo negativo, aggiungere cicloesimmide al secondo 35 mm con fondo di vetro piatto 40 min dopo la semina le cellule per pre-trattare con cicloesimmide di 50 µ g/mL ( Figura 2B). 15 min dopo l'aggiunta del cicloesimmide, aggiungere quindi con puromicina al mezzo utilizzando la stessa concentrazione e incubazione data come descritto al punto 2.1.5 (ad es., uso 10 µ g/mL di con puromicina per 5 min a 37 ° C (5% CO 2) per MRC-5).</li>
		<li>Lavare ogni piatto due volte con 2 mL di gelida 1 X PBS e fissare le cellule con 1 mL di formaldeide al 4% (diluito in 1X PBS) per 15 min a temperatura ambiente (TA). 
		Attenzione: Paraformaldeide deve essere utilizzato unicamente in una cappa chimica.</li>
	</ol></li> <li>Immunostaining.
	<ol><li>Dopo la fissazione del paraformaldeide, lavare tre volte con 2 mL di 1X PBS e incubare in 500 µ l di PBS-TritonX-100 (0,5%) per 20 min a RT per permeabilize le cellule.</li>
		<li>Per impedire il legame non specifico anticorpo, bloccare il campione con 500 µ l PBS &#8211; BSA (1%) per 20 min a RT.</li>
		<li>Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e incubare con 300 µ l di 1:12,500 con anti-puromicina anticorpo (12 D 10) diluito in 1X PBS per 1h a RT.</li>
		<li>Lavare 3 volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e incubare con 300 µ l di anti-topo IgG coniugato ad un fluoroforo (qui, 488 nm) diluito in PBS per visualizzare puromycilated polipeptidi e con falloidina coniugata a un altro fluoroforo (qui, 555 nm) per visualizzare F-actina. Incubare per 1 h a RT.</li>
		<li>Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e poi incubare per 5 min a RT a 300 µ l di PBS-Tween20 (0,1%) completati con 1 µ g/mL 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e poi lavare con 2 mL di 1X PBS. Impedire alle cellule di essiccazione mantenendo il campione in 2 mL di 1X PBS durante acquisizione immagine.</li>
	</ol></li></ol> 3. Acquisizione di immagini di immunofluorescente Nota: la seguente metodologia può essere utilizzata con qualsiasi sistema di imaging confocale commercialmente disponibile.
<ol><li>Determinare le appropriate impostazioni per ogni fluoroforo per massimizzare la gamma dinamica per quantificazione. 
	Nota: Quantificazione rappresentativa può essere ottenuto solo se viene evitata la saturazione di pixel e la soglia di segnale è regolata correttamente. Queste impostazioni possono essere raggiunti regolando accuratamente la potenza del laser, ad alta tensione (HV), guadagno, e l'offset.
	Fattore di <ol><li>regolare lo zoom (5x) e il numero di pixel (512x512) per ottimizzare le dimensioni dei pixel. 
		Nota: Questo dovrebbe essere almeno 2.3 - volte più piccolo rispetto alla risoluzione ottica, secondo il teorema di Nyquist.</li>
		<li>Diminuire la velocità di scansione (12,5-20 µs/pixel) e utilizzare una media (2 - 3 volte) per migliorare il rapporto segnale-rumore secondo le impostazioni di cui sopra.</li>
	</ol></li> <li>Manualmente determinare alto appropriato e inferiore piani focali lungo l'asse z con la dimensione ottimale passaggio (0,4 µm/fetta). 
	Nota: Il piano di dimensioni di passaggio è determinato dalla risoluzione assiale divisa da 2.3, secondo il teorema di Nyquist. In genere, 20-25 strati sono necessari per coprire la profondità intera cella delle celle aderenti.</li>
	<li>Acquisire un'immagine confocale di un'intera cella singola con un obiettivo a immersione in olio (apertura numerica 1,42) X piano Apo 60.</li>
</ol> 4. Quantificazione di immagine immunofluorescente <ol><li>determinazione di arricchimento.
	<ol><li>Aprire un'immagine corrispondente al layer di z-aereo di interesse dal file di dati di acquistato delle cellule usando il software ImageJ (freeware disponibile presso http://fiji.sc).</li>
		<li>Disegnare una linea utilizzando lo strumento di disegno a tratteggio (barra degli strumenti &#8594; dritto) attraverso le regioni della cellula dove quantificazione è desiderato. Modificare lo spessore della linea facendo doppio clic su &#34; dritto; &#34; i valori di intensità saranno mediati attraverso la larghezza della linea (fissato a 8 nella Figura 3). 
		Nota: Una linea più sottile è preferita per evitare la sovrapposizione di segnale da diverse strutture.</li>
		Profilo di <li>dopo la riga è impostata correttamente, la densità del segnale lungo l'asse determinato (barra dei menu &#8594; Analyze &#8594; tracciare il profilo). 
		Nota: Una nuova finestra si aprirà che mostra un profilo corrispondente all'intensita di segnale per ogni pixel del canale selezionato (specifico fluoroforo) lungo la linea per la sezione selezionata del piano z.
		<ol><li>Ripetere il processo per ogni canale corrispondente il fluoroforo utilizzato (vale a dire una quantificazione per 488, uno per 568 e uno per 405). 
			Nota: Il valore di intensità del segnale sempre verrà ordinato seguendo l'orientamento della linea disegnata.</li>
		</ol></li> <li>Per ottenere i valori numerici in scala di grigi per ogni pixel del profilo corrispondente per la quantificazioni di livello z-aereo selezionato, copiare i dati del profilo (barra dei menu nella finestra immagine &#8594; copia) e incollarlo in qualsiasi software di foglio di calcolo.</li>
		4.1.1-4.1.4 <li>ripetere i passaggi per ogni sezione del piano z dell'immagine acquisita confocale ed ogni canale dove è voluto quantificazione. 
		Nota: La quantificazione dei diversi strati di z-aereo possa essere riunita per ottenere una valutazione generale dell'arricchimento speciale del segnale calcolando il valore della somma di ogni pixel lungo la linea per ogni strato di z-plane. Questo tipo di pool può essere raggiunto solo se la linea tracciata è identica per ogni strato di z-aereo incluso nei valori medi.</li>
		<li>Come metodo alternativo per la quantificazione di cellule intere di canali diversi con un gran numero di strati, utilizzare la macro denominata StackprofileData (vedere il File supplementare). 
		Nota: Questa macro è accessibile liberamente a https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt e può essere utilizzata come segue: <ol><li>incollare la macro in un file di testo e salvare esso.</li>
			<li>Aprire il file di immagine che include tutti i livelli confocale della cellula.</li>
			<li>Disegnare una linea, come descritto al punto 4.1.2, aprire una nuova finestra per importare la macro (barra dei menu &#8594; plugin &#8594; macro &#8594; eseguire), scegliere il file di testo salvato in precedenza corrispondente alla macro StackprofileData e fare clic su &#34; Open. &#34; 
			Nota: A seguito di importazione di macro, una nuova finestra denominata &#34; risultati &#34; si aprirà e tutti la quantificazione lungo l'asse determinato saranno elencati per ogni strato di z-plane e canale presenti nei file immagine.</li>
			<li>Copiare i dati per ogni canale (barra dei menu &#8594; modificare &#8594; copia) per ottenere la rappresentazione grafica del profilo corrispondente per la quantificazioni di segnale. Incollarlo in qualsiasi software di foglio di calcolo. Calcolare il valore della somma di ogni canale per ogni pixel lungo la linea per ogni strato di z-plane. Utilizzare questi valori per creare una rappresentazione grafica simile a quello presentato nella Figura 3.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Quantificazione del segnale in un volume o designata zona cellulare.
	<ol><li>Aprire il file di immagine con software ImageJ.</li>
		<li>Disegnare un'area per indicare l'area di interesse utilizzando la funzione di forma geometrica (barra degli strumenti &#8594; &#34; rettangolo, &#34; &#34; ovale, &#34; o &#34; poligono &#34;). 
		Nota: Il valore di quantificazione sarà determinato per l'area corrispondente alla forma disegnata.</li>
		<li>Regolare il livello di soglia per evitare qualsiasi segnale di fondo (barra dei menu &#8594; immagine regolare &#8594; soglia); una nuova finestra apparirà per rappresentare le intensità di pixel in forma di istogramma. Modificare i valori per includere o escludere pixel nella quantificazione utilizzando il dispositivo di scorrimento. Selezionare una soglia che Elimina pixel rossi all'esterno della cellula, come evidenziato in rosso pixel sarà incluso nella quantificazione.</li>
		<li>Definire i parametri di misurazione per quantificare il segnale di pixel all'interno dell'area selezionata, senza segnale di fondo (barra dei menu &#8594; Analyze &#8594; impostare misure) e assicuratevi di controllare il &#34; limite di soglia &#34; e il &#34; densità integrata &#34; scatole.</li>
		<li>Misurare i valori quantitativi per l'area selezionata (barra dei menu &#8594; Analyze &#8594; misura). 
		Nota: Quantificazione di intensità del segnale sarà presentato in una nuova finestra sotto il &#34; IntDen &#34; identificazione, che rappresenta il prodotto dei valori medi di grigio e il numero di pixel all'interno dell'area selezionata.</li>
		<li>Disegnare un'area che include l'intera cella utilizzando una forma geometrica (barra degli strumenti &#8594; &#34; rettangolo, &#34; &#34; ovale, &#34; o &#34; poligono &#34;) e procedere con la procedura 4.2.3-4.2.5 per ottenere un valore corrispondente al segnale totale. Calcolare il rapporto del segnale all'interno dell'area selezionata sopra l'intero segnale per ottenere la percentuale del segnale all'interno dell'area di interesse.</li>
		<li>Ripetere passaggi 4.2.2-4.2.6 per ottenere la quantificazione del volume di cella per ogni z-plane. Adattare la forma geometrica come necessario.</li>
		<li>Copiare/incollare i dati ottenuti dalla &#34; risultati &#34; windows per ogni strato di z-aereo in un foglio di calcolo per la rappresentazione grafica e per trovare un valore medio.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I recenti progressi tecnologici hanno consentito una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nel upregulation traslazionale o la repressione di specifici mRNA in processi biologici, quali lo sviluppo neuronale, risposta ai farmaci e metastasi. La metodologia conveniente qui descritta consente traduzione eventi possano essere visualizzati nelle celle per studiare come le proteine RNA-leganti regolano processi metastatici, come adesione cellulare, migrazione e invasione.
Anche se sono stati sviluppati numerosi metodi per valutare la traduzione di proteine de novo , tutti condividono la stessa strategia, in cui il polipeptide prolungando incorpora amminoacidi modificati taggati con una frazione rilevabile. Il primo di questi metodi si basa su 35incorporazione S-radioattivi arginina la proteina tradotta. Anche se è efficiente per confrontare i tassi generali di traduzione sotto specifiche condizioni, l'uso di aminoacidi radiomarcati rende questo metodo poco attraente per la maggior parte delle squadre di ricerca. Quindi, lo sviluppo del romanzo metodi utilizzando etichette non radioattivo, come SunSET, Click-it, o l'approccio di trucco, offerto nuove opportunità per valutare e osservare in vivo traduzione eventi. Anche se geniale, la maggior parte di questi metodi permettono solo per la valutazione degli eventi di traduzione che seguono trattamento farmacologico o eventi cellulari specifici utilizzando un cDNA esogeno specifico costruire di obiettivi specifici, limitando gli esperimenti agli obiettivi già identificati . Questo è vero per il trucco approccio4, che consente la regolazione traduzionale di un singolo bersaglio mRNA esogenicamente espressa da valutare. Anche se consente la convalida dell'attivazione traslazionale dei mRNAs endogeno, il tempo di incubazione minimo di metodo "Click-IT" per l'incorporazione di AHA è almeno 1 h13, che è considerato troppo a lungo per i meccanismi di traduzione più acute.
Mentre estremamente versatile e facile da configurare, il metodo qui descritto richiede che i punti critici da seguire nella fase iniziale del protocollo. Come mostrato nei risultati rappresentativi, diverse linee cellulari avranno cinetica di incorporazione con puromicina diverso, che potrebbe semplicemente essere dovuto il tasso metabolico di ogni linea cellulare, come sembra essere il caso per le cellule MRC-55,21. Infatti, le cellule non trasformate non sono come proliferative come HeLa, e pertanto, rinnovamento massa della proteina è meno robusto rispetto a cellule trasformate. Questo dovrebbe tenere conto quando si utilizza il protocollo. Di conseguenza, la prima parte del protocollo è fondamentale per il resto del metodo. Determinare accuratamente la concentrazione di con puromicina e il tempo d'incubazione consentirà una migliore valutazione della traduzione che si verificano durante l'esperimento. Come accennato in precedenza, il trattamento con una quantità eccessiva di con puromicina aumenta il rapporto del puromycilated piccoli polipeptidi e sembra stimolare la proteolisi, che potrebbero facilmente portare a un'errata interpretazione della norma che si verificano eventi traslazionali19 . Come regola generale, più il tempo di incubazione, il meno con puromicina è necessaria, considerando che un tempo di incubazione più breve richiede una maggiore concentrazione di con puromicina. La concentrazione e l'ora può essere adattata a particolari limitazioni sperimentali.
I metodi presentati qui sono altamente adattabili e possono essere facilmente modificati secondo il trattamento applicato o il biologico processo studiato. Incorporazione con puromicina permette la valutazione rapida delle modifiche nella cinetica di traduzione per un breve periodo di tempo, mentre il metodo di quantificazione fornisce immagini altamente informativi degli eventi cellulari. Anche se potente, questi metodi presentano limitazioni che devono essere considerati. Con puromicina sarà inserito in proteine appena sintetizzate da tutti i mRNAs che attivamente sono stati tradotti. Per questo motivo, il metodo di puromycilation qui descritto potrebbe non essere adatto per lo studio di specifici target (cioè, singolo mRNA), ma è l'ideale per ottenere una panoramica generale delle attività traduzionale all'interno di una singola cella o una popolazione delle cellule. Come accennato in precedenza, con puromicina eccessiva comporta gravi inconvenienti, e con puromicina dosaggi e tempi di trattamento dovrebbero essere definiti con cura, come proposto nel protocollo. Infatti, come mostrato nella Figura 2, disponibilità eccessiva con puromicina provocherà la formazione di piccoli polipeptidi puromycilated che diffondono più rapidamente nella cellula, che conduce ai dati imprecisa localizzazione subcellulare. Inoltre, aumentata proteolisi sono conosciuto per accadere dopo con puromicina eccessivo trattamento19, un effetto che potrebbe comportare una perdita completa del segnale.
Anche se non più specifici come i metodi di trucco o Click-it, l'approccio qui proposto è molto accessibile e consente la rapida valutazione delle modifiche generali nella cinetica di traduzione. Anche se altri metodi sono più adatti per applicazioni specifiche, con puromicina incorporazione analisi possono essere eseguite come un controllo supplementare. Infatti, se l'esperimento ha bisogno di dimostrare che un determinato target di mRNA è l'unico colpito in una particolare condizione, è necessario mostrare che questo non è causato da un aumento generale nella traduzione. Come tale, incorporazione con puromicina negativo potrebbe fornire la prova per questo caso. Inoltre, questo metodo è adatto per osservare i cambiamenti generali a tariffe di traduzione. Quindi, può essere utilizzato per mostrare un meccanismo di repressione della traduzione, come nel caso di stress granello formazione9, o per convalidare se il trattamento del cicloesimmide utilizzato nella fase iniziale di frazionamento di complesso traslazionale sta bloccando in modo efficiente allungamento22. È anche importante ricordare che, sebbene i metodi di quantificazione descritti nelle sezioni 2.3 e 2.4 riguardano esperimenti concentrandosi sulla macchiatura con puromicina, potrebbero essere applicate a qualsiasi tipo di compartimenti che macchia usando vari tipi di fluorofori. Infatti, questi metodi di quantificazione potrebbero essere utilizzati per quantificare la distribuzione cellulare di una molecola o di proteine e anche possono convalidare la localizzazione di un bersaglio in un apposito comparto subcellulare.

La regolazione della traduzione di diverse funzioni cellulari ha spinto molti gruppi di ricerca per sviluppare nuovi strumenti e metodi per determinare la localizzazione subcellulare di traduzione del mRNA e proteina regolamentato sintesi1,2 ,3,4. Questi recenti progressi tecnologici consentono una migliore comprensione dei meccanismi che coinvolgono il upregulation di traduzione o la repressione di specifici mRNA durante i processi biologici, quali lo sviluppo neuronale, la risposta ai farmaci e metastasi5 ,6,7,8. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi richiedono costosi o pericolosi reagenti e attrezzature specifiche che potrebbero non essere disponibili per la maggior parte dei laboratori. Come tale, un metodo conveniente per consentire la rapida valutazione degli eventi di traduzione è stato sviluppato per eludere specificamente questi potenziali problemi. Questo metodo rileva acute modulazioni traslazionale che si verificano durante specifici processi cellulari e permette anche per la localizzazione di traduzione usando la microscopia confocal.
I metodi descritti qui sono stati utilizzati per monitorare la versione localizzata all'interno di compartimenti subcellulari chiamato diffusione iniziazione centri (SIC)5. SICs è transitori strutture si trovano in celle teste di serie che sono localizzate in cima a complessi di adesione nascente. Anche se SICs e complessi di adesione sono distinti, i loro destini sono strettamente collegati. Infatti, SICs è noto per gradualmente svaniscono con la maturazione di complessi di adesione focale in un sito di adesione durante la fase iniziale di adesione. Abbiamo scoperto che le proteine RNA-leganti notoriamente per controllare in modo specifico la traduzione del mRNA (ad es., Sam68, FMRP e G3BP1) e poliadenilazione RNAs sono stati arricchiti all'interno di queste strutture5. Utilizzando i metodi descritti qui, abbiamo mostrato che il regolamento di SIC-collegata mRNA traduzione agisce come un checkpoint che consente seminato cellule per consolidare l'adesione delle cellule. Questo metodo, basato sull'incorporazione con puromicina, potrebbe essere considerato una versione adattata del rilevamento del superficie di analisi di traduzione (tramonto). Originariamente sviluppato per misurare il tasso di sintesi proteica globale utilizzando un aminoacido non-radioattivo identificato, proteina puromycilation offre un modo efficiente per visualizzare proteine de novo sintesi9. Questo metodo si basa sul comportamento intrinseco del con puromicina, un antibiotico che blocca la traduzione attraverso termine chain prematuro nel ribosoma10. Infatti, con puromicina è strutturalmente analoga alla tyrosyl-tRNA, che consente per l'incorporazione nell'allungamento catene peptidiche attraverso la formazione di un legame peptidico. Tuttavia, associazione con puromicina ad una catena crescente del peptide impedisce un nuovo legame peptidico in formazione con successivo aminoacyl-tRNA, poiché con puromicina ha un legame di ammide non idrolizzabili invece di legame estere idrolizzabile trovato nel tRNA. Così, l'incorporazione di con puromicina allungando polipeptidi provoca il rilascio prematuro di numerosi polipeptidi troncato puromycilated corrispondente al attivamente tradotta mRNA9,11,12 .
Utilizzando questo metodo, è stato possibile valutare traduzione attiva all'interno di una vedova di breve periodo di tempo (ad es., 5 min) durante l'adesione cellulare, utilizzando un anticorpo specifico diretto contro con puromicina sulle cellule che sono stati completati con l'antibiotico per periodi di 5-min in diversi momenti durante il processo di adesione delle cellule5. La precisione di questo test si basa su altamente specifici anticorpi diretti contro la frazione di puromycilated. Immunofluorescente rilevamento del polipeptide puromycilated fornisce una ripartizione subcellulare generale del mRNA appena tradotta, che può anche essere quantificata con grande precisione utilizzando sistemi di imaging confocale.
Quindi, questo metodo offre un'opzione pertinente per un gran numero di laboratori di studiare i meccanismi di regolazione traduzionale coinvolti in processi come un neurone granulazione6,13,14, 15, morfogeno mRNA localizzazione e traduzione durante lo sviluppo16,17. È anche adatto per studiare traduzione localizzata o compartimenti durante rapidi eventi biologici, come ad esempio la migrazione cellulare, adesione o invasione, o semplicemente valutare trattamenti farmacologici che possano indurre cambiamenti traslazionale5, 7 , 18. nel complesso, questo metodo consente la visualizzazione degli eventi di traduzione localizzata o controllata in modo rapido, preciso e conveniente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>wisent</td>
			<td>325-043 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puroycin antibody 12D10</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>western blot dilution 1:25000 
			Immunofluoresence dilution 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>western blot dilution 1:8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>4408</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF568 Phalloidin</td>
			<td>biotium</td>
			<td>00044</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexmide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1988-1G</td>
			<td>50&#181;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>final concentration 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PJ593</td>
			<td>2.5&#181;g/ml to 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-Dish 35 mm, high, ibiTreat</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh-7 cells</td>
			<td colspan="2">from Dr. Mazroui (Universit&#233; Laval)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fv1000</td>
			<td>olympus</td>
			<td></td>
			<td>confocal imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% Solution</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>C5300-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>TB0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP9702-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence to measure global localized translation

I meccanismi che regolano la traduzione del mRNA sono coinvolti in diversi processi biologici, quali sviluppo di linea del germe, differenziazione cellulare e organogenesi, così come nelle malattie multiple. Numerose pubblicazioni hanno dimostrato in modo convincente che i meccanismi specifici regolano strettamente traduzione degli mRNA. Crescente interesse nella regolazione dell'espressione della proteina indotta da traduzione ha portato allo sviluppo di nuovi metodi per studiare e seguire de novo proteina sintesi in cellulo. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono complessa, che li rende costosi e spesso limitando il numero di mRNA bersaglio che possono essere studiate. Questo manoscritto propone un metodo che richiede solo reagenti di base e un sistema di imaging di fluorescenza confocale per misurare e visualizzare le modifiche nella traduzione di mRNA che si verificano in qualsiasi linea cellulare in varie condizioni. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per mostrare la versione localizzata nelle strutture subcellulari delle cellule aderenti in un breve periodo di tempo, offrendo così la possibilità di visualizzare la traduzione del de novo per un breve periodo durante una varietà di biologico processi o di convalida delle modifiche in attività traduzionale in risposta a stimoli specifici.

Per osservare con precisione gli eventi di traduzione mediante incorporazione con puromicina, è fondamentale per determinare le condizioni ottimali per ogni linea cellulare perché ognuno Mostra diversi con puromicina incorporazione cinetica (Figura 1)9,11 ,12,18. Quindi, per convalidare l'incorporazione con puromicina, è necessario trattare la linea cellulare desiderato con uno spettro standardizzato di aumento delle concentrazioni di con puromicina (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 e 15.0 µ g/mL) per diversi periodi di tempo (5 e 10 min). Per valutare la versione localizzata o una risposta iniziale al trattamento farmacologico, un più breve tempo di incubazione è preferito (ad esempio, meno di 5 minuti), in quanto permette la valutazione diretta degli eventi traslazionale direttamente seguendo un trattamento specifico. Idealmente, il segnale con puromicina dovrebbe essere facilmente rilevabile ma dovrebbe anche evitare il punto di saturazione (Figura 2). Come raffigurato in Figura 2 (pannelli a sinistra), una concentrazione accettabile con puromicina è 7.5-10.0 µ g/mL per MRC-5 e HeLa, mentre 5.0-7.5 µ g/mL di con puromicina è suggerito per Huh-7. Ottimizzazione dei parametri sperimentali è cruciale perché l'obiettivo di questo metodo è di non inibire completamente tutti i allungamento traslazionale nel momento dell'iniziazione, ma Tag recentemente sintetizzato le catene polipeptidiche durante la traduzione di rilevare acuta variazioni nella traduzione. Questa fase iniziale nel protocollo non dovrebbe essere trascurato, come eccessivo con puromicina disponibilità e tempo di trattamento esteso causerà gravi conseguenze indesiderate. Come osservato in Figura 2 (pannelli di destra), cellule trattate per 10 min con una concentrazione elevata con puromicina genererà principalmente più piccoli polipeptidi puromycilated (ad es., Huh-7, 7,5 µ g/mL o più per 10 min). Questi più piccoli polipeptidi diffonderanno più rapidamente nella cellula, che potrebbe interferire con la localizzazione subcellulare di valutare con precisione. Un altro problema è quello proteolisi aumentata si verifica al momento con puromicina eccessivo trattamento19. Questo risultato è stato osservato in cellule MRC-5 e HeLa trattate per 10 min, che ha mostrato l'intensità di segnale in diminuzione in presenza di 10 o 15 µ g/mL di con puromicina. Entrambi questi fenomeni sono fuorvianti se incorporazione con puromicina è valutata dall'immunofluorescenza poiché diffusione aumentata impedisce la visualizzazione accurata di traduzione, localizzazione, mentre degradazione indotta da con puromicina diminuisce notevolmente sensibilità di rilevazione. Queste conseguenze indesiderate sono facilmente evitabili definendo correttamente le condizioni sperimentali ottimali, come descritto nella sezione 1 del protocollo.
Durante la visualizzazione di incorporazione con puromicina, è anche importante effettuare controlli adeguati. Come mostrato in Figura 3A, incorporazione con puromicina può essere bloccato in modo efficiente con l'aggiunta di cicloesimmide di 50 µ g/mL, un composto noto per inibire la traduzione allungamento20 e così incorporazione con puromicina. Questo comportamento è illustrato nella Figura 3B, che dimostra che il trattamento del cicloesimmide impedito in modo efficiente la maggior parte del segnale corrispondente alla incorporazione con puromicina in cellule aderenti MRC-5. Infatti, mentre puromycilated peptidi possono essere visualizzati in cellule trattate con solo con puromicina, viene rilevato un segnale debole in cellule che sono state trattate con cicloesimmide colorazione in condizioni identiche. In alternativa, un altro antibiotico (anisomycin) può essere utilizzato anche come controllo negativo, come ha la capacità di bloccare peptidil transferasi attività5 e ha dimostrato di essere efficace come cicloesimmide a bloccare incorporazione con puromicina.5 ,18
A seguito di acquisizione immagine immunofluorescente, è possibile valutare la localizzazione generale dei polipeptidi di puromycilated corrispondente al recentemente sintetizzato proteine (Figura 4). Livelli delle immagini vengono selezionati a diverse profondità all'interno delle cellule aderenti, permettendo l'intensità del segnale in compartimenti subcellulari da valutarsi in piani differenti delle cellule. Come tale, è possibile confrontare la reazione di puromycilation localizzata nella parte inferiore della cella (Figura 4A), al centro della cella (Figura 4B), o la parte superiore della cella (Figura 4). Situato leggermente sopra le strutture di adesione nascente e maturato, SICs è principalmente osservata al centro della cella. Come previsto, puromycilation intenso viene rilevato in SICs, suggerendo che la traduzione degli mRNA è isolato a queste strutture subcellulari. Come accennato in precedenza, è possibile confrontare l'intensità del segnale lungo l'asse desiderato. Questo confronto è possibile solo se le immagini acquisite non includono saturi pixel, che appaiono in rosso nell'immagine in scala di grigi (secondo pannelli dall'alto) ottenute mediante il microscopio software operativo. Queste immagini possono essere importate nel software ImageJ per quantificazione e l'analisi dell'intensità pixel lungo un asse indicato. La quantificazione di pixel può essere rappresentata graficamente (pannello centrale) per illustrare l'intensità di pixel relativo all'area posizioni lungo l'asse. Guardiamo più da vicino l'inserto in pannelli superiori Mostra i confini di SIC-actina (in rosso) e un segnale verde all'interno della struttura che corrisponde agli eventi di traduzione altamente attiva, che si sono arricchiti all'interno di queste strutture (sezione inferiore). Anche se questo metodo di quantificazione non è il modo migliore per determinare la percentuale esatta della traduzione totale che si verificano in queste strutture, è visivamente informativo, consentendo una rapida valutazione dell'intensità del segnale ed è una buona approssimazione della distribuzione del segnale in tutta la cellula.
Per ottenere una distribuzione quantitativa del segnale in tutta la cellula intera, deve essere utilizzato un altro metodo. Come illustrato nella Figura 5, uno dei passaggi chiave è per indicare le aree di interesse che devono essere quantificati per ogni z-plane che compongono i file immagine confocale. Questa assegnazione può essere raggiunto utilizzando uno strumento di disegno differente trovato in ImageJ. Utilizzando questo metodo, è possibile quantificare una singola zona o le zone multiple, che possono poi essere confrontate, sottratto o anche compilate. Le difficoltà principali sono per: (i) trovare l'imaging ottimo condizioni che evitare saturazione di pixel e il segnale di fondo, che potrebbe distorcere il valore quantitativo del segnale ottenuto e (ii) stabilire una calibrazione ottimale della soglia in ImageJ. Supponendo che entrambe le condizioni sono ottimale, questo metodo di quantificazione è altamente riproducibile pur rimanendo facile da eseguire. Prima dell'acquisizione di immagini, è anche importante determinare accuratamente i limiti inferiori e superiori del z-aerei la cella selezionata per la quantificazione. Nel caso presentato nella Figura 4, la sezione inferiore corrisponde al limite di risoluzione dell'obiettivo, che spesso include contaminando fluorescenza evanescente, che può fare diminuire il rapporto di segnale del corpo SIC/cella. Come precedentemente accennato, SICs è coinvolti nella formazione del sito di adesione e maturazione; di conseguenza, SIC strutture si trovano leggermente sopra appena formando complessi di adesione, che esclude la fluorescenza evanescente dagli strati più in basso. Così, il segnale di puromycilation associato a SIC è a malapena visibile nelle sezioni inferiore, mentre possiamo chiaramente obsErve è nella sezione centrale, spiegando il rapporto aumentato di corpo SIC/cellulare segnale nella regione centrale rispetto ai piani inferiori o superiori.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig1.jpg"> 
Figura 1. Rappresentazione sperimentale dell'ottimizzazione del trattamento con puromicina descritto nella sezione 1. (A) una rappresentazione 24 pozzetti delle cellule essendo testa di serie per l'esperimento (punto 1.1). (B) rappresentazione schematica del passo 1.4 mostrando il cambiamento medio nelle righe 1 e 2 della piastra 24 pozzetti e l'aggiunta di cicloesimmide (CHX) in ciascun pozzetto della terza fila per una concentrazione finale di 50 µ g/mL. (C) rappresentazione schematica di un trattamento con puromicina. la seconda e terza fila (passo 1.6) 15 min dopo passo 1.4. (D) rappresentazione schematica di un trattamento con puromicina. la prima riga (passo 1,8) 5 min dopo passo 1.6. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig2.jpg"> 
Nella figura 2. Determinazione delle condizioni ottimali per incorporazione con puromicina. L'analisi Western blot della intero-cellula estrarre da MRC-5 (A), (B) Huh-7 e (C) le cellule HeLa, incubate con aumento delle concentrazioni di con puromicina (0, 2,5, 5, 7.5, 10 e 15 µ g/mL) per un periodo di 5 min (pannelli a sinistra) o 10 min (a destra pannelli). Puromycilated peptidi sono stati rilevati usando un anticorpo contro con puromicina. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig3.jpg"> 
Nella figura 3. Inibizione di puromycilation utilizzando cicloesimmide. (A) Western blot che mostrano l'effetto del cicloesimmide su un dosaggio di 5-min puromycilation. Efficienza di incorporazione in MRC-5, Huh-7 e le cellule HeLa seguito mock (PBS 1X) o il trattamento del cicloesimmide. (B) confocale immagine mostra l'effetto del cicloesimmide sull'incorporazione con puromicina. Cellule MRC-5 sono stati pre-trattate con PBS (finto) o cicloesimmide per 15 min e poi completate con 10 µ g/mL di con puromicina + PBS 1X (pannello sinistro) o 10 µ g/mL di con puromicina + 50 µ g/mL di cicloesimmide (pannello di destra) per 5 min Puromycilated proteine sono stati individuati usando un anticorpo contro con puromicina (verde). F-actina è stata rilevata mediante falloidina (rosso), e il nucleo è stato macchiato con DAPI (blu). Inserti a destra corrispondono a un ingrandimento 2.5 x della scatola bianca. Bar = 10 μm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig4.jpg"> 
Nella figura 4. Quantificazione dell'attività traslazionale in SICs in cellule aderenti MRC-5. (A-C) Immagine rappresentativa confocal di cellule MRC-5 aderenti trattati con con puromicina. 10 µ g/mL per 5 min. Le immagini presentate corrispondono per il fondo (A), intermedio (B)e superiore (C) porzioni della cella. Pannelli superiori mostrano le proteine puromycilated rilevate usando un anticorpo contro con puromicina (verde). F-actina è stata rilevata mediante falloidina (rosso), e il nucleo è stato macchiato con DAPI (blu). Inserti a destra corrispondono a un ingrandimento di 2x della scatola bianca. Bar = 10 μm. I pannelli mostrano l'assenza di pixel saturi, che sarebbe sono stati evidenziati in rosso. I pannelli inferiori mostrano una rappresentazione grafica di arricchimento della proteina puromycilated in una cella di MRC-5 aderente confrontando l'intensità del segnale per con puromicina (verde), F-actina (rosso), e DAPI (blu) lungo l'asse di cella indicato dalla freccia bianca. (D-F) Le immagini presentate corrispondono alla 4.4 x inserto di ingrandimento di SICs presentato in (A-C). La quantificazione indica il confine SIC (picchi rossi: actina), così come versione localizzata all'interno del SICs (verde picchi: con puromicina) nel più basso (D), mezzo (E), e le regioni superiori (F) della cella. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig5.jpg"> 
Nella figura 5. Quantificazione della intero-cellula segnale di puromycilated di proteine in cellule aderenti MRC-5. (A) determinazione del segnale all'interno di diverse aree dello strato inferiore piano z di un aderente delle cellule MRC-5. (Pannello di sinistra) Selezione dell'area (I) che copre la totalità della cella per ottenere un valore quantitativo corrispondente al segnale cellulare totale per questo strato di z-plane. (Pannello centrale) Selezione dell'area cellulare corrispondente al nucleo e la porzione citoplasmatica che non include SIC (II). (Pannello di destra) Visualizzazione della zona corrispondente al SICs (III) sottraendo il valore ottenuto dall'area II dal valore ottenuto per l'intera cellula (zona I). Bar = 10 μm. (B) i valori dei pixel quantitativa per ogni area sono elencati nella tabella per l'immagine che raffigura la selezione dell'area in (A), seguita da un grafico che mostra la percentuale (%) del segnale trovato in SICs. (C) determinazione del segnale all'interno di diverse aree dello strato piano z metà di un aderente delle cellule MRC-5. (Pannello di sinistra) Selezione dell'area (I) che copre la totalità della cella per ottenere un valore quantitativo corrispondente al segnale cellulare totale per questo strato di z-plane. (Pannello centrale) Selezione dell'area cella corrispondente al nucleo e la porzione citoplasmatica che non include SIC (II). (Pannello di destra) Visualizzazione della zona corrispondente al SICs (III) sottraendo il valore ottenuto per area II dal valore ottenuto per l'intera cellula (zona I). (D) i valori dei pixel quantitativa per ogni area sono elencati nella tabella per l'immagine che raffigura la selezione di zona (c), seguita da un grafico che mostra la percentuale (%) del segnale trovato in SICs. (E) determinazione del segnale all'interno di diverse aree dello strato superiore piano z di un aderente delle cellule MRC-5. (Pannello di sinistra) Selezione dell'area (I) che copre la totalità della cella per ottenere un valore quantitativo corrispondente al segnale totale delle cellule di questo strato di z-plane. (Pannello centrale) selezione di area di cella corrispondente al nucleo e la porzione citoplasmatica che non include SICs (II). (Pannello di destra) Visualizzazione della zona corrispondente al SICs (III) sottraendo il valore ottenuto per area II dal valore ottenuto per l'intera cellula (zona I). (F) i valori dei pixel quantitativa per ogni area sono elencati nella tabella per l'immagine che raffigura la selezione dell'area (e), seguita da un grafico che mostra la percentuale (%) del segnale trovato in SICs. (G) quantificazione valori per tutti i livelli di piano z dalla cella presentato sopra, tra cui uno calcolati per z-aereo presentato nell'A (z = 1), C (z = 9) ed E (z = 19), che sono evidenziate in rosso sul tavolo. (H) rappresentazione grafica della percentuale di segnale trovato in SICs in tutto il volume dell'intera cella. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

quantitative-immunofluorescence-to-measure-global-localized

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.8K Views.  Université Laval. Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Video: Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

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Biochimica

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting analisi di traduzione Iniziazione formazione complessa su mRNAs mammiferi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method for structural biologists to determine high-resolution structures of a wide variety of macromolecules. Multiple software suites are available to new and expert users for image processing and structure calculation, which streamline the same basic workflow: movies acquired by the microscope detectors undergo correction for beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) estimation. Next, particle images are selected and extracted from averaged movie frames for iterative 2D and 3D classification, followed by 3D reconstruction, refinement, and validation. Because various software packages employ different algorithms and require varying levels of expertise to operate, the 3D maps they generate often differ in quality and resolution. Thus, users regularly transfer data between a variety of programs for optimal results. This paper provides a guide for users to navigate a workflow across the popular software packages: cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3 to obtain a near-atomic resolution structure of the adeno-associated virus (AAV). We first detail an image processing pipeline with cryoSPARC v3, as its efficient algorithms and easy-to-use GUI allow users to quickly arrive at a 3D map. In the next step, we use PyEM and in-house scripts to convert and transfer particle coordinates from the best quality 3D reconstruction obtained in cryoSPARC v3 to RELION-3 and Scipion 3 and recalculate 3D maps. Finally, we outline steps for further refinement and validation of the resultant structures by integrating algorithms from RELION-3 and Scipion 3. In this article, we describe how to effectively utilize three processing platforms to create a single and robust workflow applicable to a variety of data sets for high-resolution structure determination.

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

This article describes how to effectively utilize three cryo-EM processing platforms, i.e., cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3, to create a single and robust workflow applicable to a variety of single-particle data sets for high-resolution structure determination.

Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...