Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Max Planck.

1. Preparazione delle cellule V. parahaemolyticus elettrocompatibili e elettroporazione del DNA plasmidico nelle cellule nuotatori NOTA: La seguente sezione del protocollo consente la preparazione di celle elettro-competenti e la successiva elettroporazione del plasmide DNA in cellule nuotatori. Questo passo è importante se le proteine ​​fluorescenti vengono espresse ectopicamente da un plasmide. <ol><li> Sradicare le cellule V. parahaemolyticus da una riserva di glicerolo da -80 ° C su una piastra di LB agar fresca contenente 100 μg / mL di ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C. </li><li> Il giorno seguente, inoculare 200 ml di mezzo LB con una singola colonia di V. parahaemolyticus e incubare a 37 ° C in condizioni di agitazione fino a raggiungere un OD 600 di 1,0. Richiede solitamente 5-6 h di incubazione per la coltura cellulare per raggiungere la densità ottica desiderata. </li><li> Trasferire immediatamente le celle su ghiaccio e perfTutte le ulteriori tappe su ghiaccio e in centrifughe pre-raffreddate a 4 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule a 4 ° C per 10 minuti a 2.000 x g. </li><li> Scartare il surnatante decantando e ri-sospendere il pellet cellulare in 25 ml di soluzione fredda di saccarosio 273 mM (pH 7.4, tamponata con KOH). </li><li> Raccogli le cellule di nuovo a 4 ° C per 10 minuti a 2000 x g. Ripetere due ulteriori volte. </li><li> Riassemblare il pellet di cellule lavate in 400 μl di soluzione fredda di 273 mM di saccarosio. Successivamente aggiungere il glicerolo ad una concentrazione finale del 15% vol / vol. Le cellule sono pronte per l&#39;elettroporazione, ma possono anche essere congelate in aliquote di 70 μl a -80 ° C per un uso successivo. </li><li> Per l&#39;elettroporazione, mescolare una aliquota di elettrocompatibili da 70 μl con 100-1000 ng di DNA plasmidico e trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione ghiacciata (intervallo di elettrodo 0,2 cm). Effettuare l&#39;elettroporazione con le seguenti impostazioni: 25 μF, 2400 V e 200 Ω. </li><li> Sospendi laLe cellule nella cuvetta di elettroporazione in 600 μL di brodo LB, trasferire in un tubo da 2 ml e incubare agitando a 37 ° C per 3 ore. </li><li> Spin giù le cellule a 2.000 xg per 5 min e ri-sospendere il pellet in 100 μL di brodo LB. Distribuire la sospensione cellulare su piastrine selettive di agar LB contenenti gli antibiotici necessari e incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Il giorno seguente, controllare le piastre per la formazione della colonia. Le colonie che crescono portano il gene di resistenza antibiotica corretta codificato sul plasmide e ora può essere utilizzato per ulteriori esperimenti. </li></ol> 2. Induzione della differenziazione delle cellule Swarmer NOTA: Le seguenti fasi descrivono come indurre la differenziazione del V. parahaemolyticus nel suo ciclo vitale della cellula swarmer e come stimolare la proliferazione sulle superfici solide. <ol><li> Sospendere 4 g di agar cuore infusione (HI) in 100 mL ddH 2 O per preparare le piastre di swarming. </li><li>Mescolare accuratamente la soluzione agar HI nel forno a microonde e scuotere la bottiglia di tanto in tanto finché la polvere non viene sciolta. Autoclave a 121 ° C per 20 min. </li><li> Dopo l&#39;autoclave, raffreddare l&#39;agar HI a 60-65 ° C. Aggiungere 2,2&#39;-Bipyridyl ad una concentrazione finale di 50 μM (soluzione di riserva di 50 mM in etanolo al 100%). Aggiungere CaCl 2 ad una concentrazione finale di 4 mM (soluzione di riserva di 4 M in ddH2O). Se necessario, aggiungete gli antibiotici nella soluzione per mantenere i plasmidi. NOTA: Se si prevede di utilizzare un plasmide inducibile, aggiungere agente induttivo alla sua concentrazione finale. ATTENZIONE: 2,2&#39;-Bipyridyl: tossicità acuta (orale, dermico, inalazione). Usare guanti e occhiali di protezione durante la manipolazione di questa sostanza chimica. </li><li> Versare 30 - 35 ml della soluzione finale agar HI in un piatto rotondo da 150 mm di Petri e lasciare che l&#39;agar si solidifichi. </li><li> Prima di individuare la coltura cellulare, asciugare la piastra agar a 37 ° C per almeno 10 minuti (o fino a quando nessun residuo liquidoSi avvicinò, ma non più) a destra con un coperchio aperto. NOTA: I tempi di essiccazione dipendono fortemente dall&#39;incubatrice utilizzata e le piastre asciutte non consentono lo scoramento di V. parahaemolyticus . (Questo passo è molto importante!) Le piastre devono essere utilizzate fresche e non devono essere più vecchie di 2 - 3 ore. Le vecchie lastre saranno troppo asciutte per stimolare lo swarming. </li><li> Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C fino a raggiungere OD 600 = 0.8, richiede solitamente circa 2-3 ore. Successivamente, le cellule sono pronte per essere individuate sulle piastre agar HI swarming. </li><li> Posizionare 1 μl di coltura cellulare al centro di una piastra di brigatura agar HI ( Figura 1A ). </li><li> Lasciare asciugare il punto ( Figura 1B ). </li><li> Sigillare la piastra con un nastro di plastica trasparente e assicurarsi che sia saldamente attaccato, altrimenti potrebbe staccarsi durante l&#39;incubazione durante la notte ( Figura 1C ). NOTA: ÈMolto importante che il sigillo sia perfetto. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria e pieghe al nastro quando viene applicata. </li><li> Incubare la piastra a 24 ° C per una notte. Ciò comporterà la formazione di una colonia di V. parahaemolyticus con fasci di razza che si estendono dalla periferia della colonia ( Figura 2 ). </li></ol> 3. Preparazione delle cellule Swarmer V. parahaemolyticus per la microscopia a fluorescenza NOTA: Il seguente protocollo descrive come preparare le diapositive di agarosio a microscopia e la successiva imprinting di flaresci di swarming su un tampone di agarosio per ottenere singole cellule swarmer per la microscopia. <ol><li> Per preparare le diapositive agarose per microscopia aggiungere 1 g di agarosio a 100 ml di un 20% vol / vol PBS e 10% vol / vol LB broth solution. Mescolare accuratamente la soluzione nel forno a microonde per sciogliere l&#39;agarosio e lasciarlo raffreddare a 65-70 ° C mentre si mescola con un agitatore magnetico. </li><li> Luogo acScivolare il microscopio magro su una sezione perfettamente livellata di una panchina di lavoro. Coprire entrambe le estremità dello scivolo con due strati di nastro adesivo di laboratorio di uso generale, fissando la slitta alla panca di lavoro. La distanza tra i due pezzi di nastro dovrebbe essere di circa 3 cm. NOTA: i due strati di nastro creano una elevazione molto piccola, che determinerà l&#39;altezza del rilievo agarosio. È importante che lo spazio di lavoro sia livello per assicurarsi che le celle saranno nello stesso piano per l&#39;analisi microscopica. </li><li> Pipettare ~ 250 μL della soluzione di agarosio preparata in precedenza sulla superficie di vetro non coperta. </li><li> Ora posizionare una seconda scivola a microscopio nello stesso orientamento del fondo in alto e premere leggermente verso il basso in modo che l&#39;agarosio residuo possa scorrere verso i lati. </li><li> Lasciare che l&#39;agarosio si solidifichi per 1-2 min e poi tirare lentamente la scaletta di vetro superiore dal basso in un movimento orizzontale. </li><li> Utilizzando un bisturi, tagliare qualsiasi agarosio residuo che è attaccato alI lati dello scivolo del microscopio e rimuovere lentamente il nastro dalle estremità del vetrino del microscopio. NOTA: La scocca di agarosso è pronta e deve essere utilizzata il più presto possibile in quanto si inizia lentamente a seccare. </li><li> Per eseguire la microscopia su cellule swarmer, tagliare un pezzo di agarro da 3 mm x 10 mm dal bordo più esterno di una colonia di scorrimento ( Figura 1D ). E &#39;molto importante non rompere la guarnizione a nastro della piastra a scoppio fino immediatamente prima del trasferimento di cellule swarmer al vetrino del microscopio. Una volta che il nastro viene rimosso, le cellule V. parahaemolyticus innescano la differenziazione in cellule nuotatori. NOTA: Assicurarsi di indirizzare i tagli dall&#39;esterno del bordo della colonia di scorrimento verso l&#39;interno della colonia ( Figura 1D ). In questo modo è possibile impedire la &quot;contaminazione del nuotatore&quot; nel bordo della colonia di swarming. </li><li> Trasferire il pezzo di agar di scorrimento su un microscopio scivolo agaroso con le cellule affacciate sul agarosio paD ( figura 1E ). Questo imprime le cellule swarming sul tampone agarosio. </li><li> Dopo aver aspettato ~ 30 s, rimuovere attentamente il pezzo agar dal tampone agarosio ( Figura 1F ). </li><li> Mettere un coperchio di vetro sul tampone di agarosio dove le cellule sono state imprintate. Le cellule sono pronte per la microscopia. NOTA: è importante immaginare immediatamente le cellule swarmer, poiché le cellule swarmer iniziano lentamente la differenziazione allo stato nuotatore. </li></ol> 4. Preparazione di V. parahaemolyticus Swimmer Cell-cultures per microscopia a fluorescenza NOTA: Questa sezione del protocollo descrive come preparare una coltura di V. parahaemolyticus per eseguire la microscopia a fluorescenza sul tipo di nuotatore. <ol><li> Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C per 1 ora o fino a quando la leggera crescita cellulare diventa visibile. </li><li> AQuesta fase, se necessario, aggiungerà agente induttivo per l&#39;espressione di proteine ​​di interesse. In questo esempio, L-arabinosi è stata aggiunta ad una concentrazione finale dello 0,2% (w / vol) per indurre l&#39;espressione di YFP-CheW 9 . </li><li> Incubare la coltura agitando per altri 2 h a 37 ° C. </li><li> Seguire le fasi 3.1-3.7 per preparare le diapositive a microscopio agarosio. </li><li> Spot 1 μL di coltura cellulare al centro del tampone agarosio e lasciare incubare il punto fino a secco. </li><li> Posizionare una copertura in vetro sul rilievo di agarosio dove le cellule sono state individuate. Le cellule sono ora pronte per essere riprese sotto il microscopio a fluorescenza. </li></ol> 5. Analisi delle immagini Questa parte del protocollo descrive un flusso di lavoro per l&#39;analisi delle immagini, in particolare come estrarre i dati di fluorescenza delle singole celle per l&#39;analisi demografica. <ol><li> Prima di iniziare l&#39;analisi delle immagini assicurarsi che tutte le immagini di microscopia vengano salvate in formato TIF a 16 bit. </li><li> Caricare il DIC (o il contrasto di fase) e le corrispondenti immagini del canale fluorescente nel software. </li><li> Genera un&#39;immagine di sovrapposizione di entrambi i canali selezionando &quot;Mostra / Sovrapposizione immagini&quot;. Impostare il numero di immagini (&quot;# Immagini:&quot;) a due e selezionare l&#39;immagine DIC nel primo canale e l&#39;immagine fluorescente nel secondo canale. </li><li> Selezionare lo strumento &quot;Multi-Line&quot; dalla barra degli strumenti e contrassegnare le celle da un polo all&#39;altro attraverso la metà della cella. Per ottenere un elenco di tutte le linee generate (oggetti di linea), aprire &quot;Measure / Region Measurements&quot;. Configurare le misure della regione per visualizzare solo l&#39;etichetta della regione, la distanza e l&#39;intensità media. </li><li> Calibrare la dimensione dei pixel sotto &quot;Misura / calibrazione delle distanze&quot; alla dimensione del pixel specificata per la configurazione del microscopio e fare clic su &quot;Applica a tutte le immagini aperte&quot;. </li><li> Trasferisci tutte le regioni (oggetti di linea) all&#39;immagine del canale fluorescente. Sotto &quot;Regioni / TrasfEr Regions &quot;selezionare l&#39;immagine di origine (l&#39;immagine di sovrapposizione) e l&#39;immagine di destinazione (l&#39;immagine del canale fluorescente). Selezionare&quot; Tutte le regioni &quot;e premere&quot; OK &quot;. NOTA: Per riuscire a riprodurre le righe esatte (oggetti di linea, regioni, ROI), aprire &quot;Regioni / Salva regioni&quot; e salvare le regioni. </li><li> Esportare le misurazioni di tutte le regioni in un foglio di calcolo aprendo &quot;Measure / Measurements Region&quot; e premendo &quot;Open Log&quot;. Confermare di aprire ed esportare i dati. Una volta aperto il foglio di calcolo in background, esportare i dati premendo &quot;F9: Log Data&quot;. </li><li> Per determinare la posizione dei foci fluorescenti lungo la cella, aprire &quot;Measure / Linescan&quot;. Impostare &quot;Linescan Width&quot; in un valore in modo che l&#39;intera larghezza di una cella sia coperta dalla regione creata in precedenza. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico di scansione di linea e selezionare &quot;Mostra dati grafico&quot;. Cliccando con il tasto sinistro e trascinando il cursore del mouse lungo la linea di scansione sullo schermoPunto di interesse, la finestra &quot;Grafico dati&quot; visualizzerà la corrispondente pixel / distanza tra i due punti. Selezionare la riga evidenziata blu e quindi copiare il contenuto. NOTA: L&#39;intero profilo di intensità della scansione di linea può essere registrato in un foglio di calcolo premendo &quot;Log Data&quot; nella finestra &quot;Linescan&quot;. I dati estratti possono ora essere utilizzati per la visualizzazione in grafici o ulteriori analisi statistiche. I modelli di localizzazione del ciclo cellulare possono essere facilmente visualizzati in una rappresentazione demografica della lunghezza delle cellule e delle intensità fluorescenti lungo il corpo cellulare. Queste rappresentazioni possono essere ottenute utilizzando lo stesso ROI precedentemente selezionato. Le seguenti fasi forniranno un esempio di come generare demografia simile a quelle riportate nelle figure 3C e 4C . <ol><li> Nelle mappe di regione di caricamento di Figi / ImageJ (.rgn) precedentemente create nel software (passo 5.6) utilizzando il &quot;importatore di file Metamorph nd &amp; ROI&quot;;. In alternativa, le regioni di interesse (ROI) delle cellule da analizzare possono essere create direttamente in Figi / ImageJ utilizzando lo strumento &quot;Segmented Line&quot;. </li><li> Apri &quot;Analizza / Strumenti / Gestione ROI&quot; e segnala tutte le voci di elenco attivo &quot;. </li><li> Successivamente, fare clic su &quot;Altro / Multiplot&quot; e selezionare &quot;Elenco&quot; nella nuova finestra &quot;Multi Plot&quot;. Fare clic su una voce di tabella, quindi selezionare e &quot;copiare tutto&quot;. Successivamente, incollare in un nuovo foglio di lavoro. NOTA: Assicurarsi che i dati della cella più lunga (due colonne X e Y corrispondenti con il maggior numero di righe) siano l&#39;ultima a destra nel foglio di calcolo. </li><li> Salva il foglio di calcolo come &quot;CSV (delimitato da virgole) (* .csv)&quot;. </li><li> Scaricare gli script R qui da &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; 10. Gli script gestiscono le celle per lunghezza e normalizzano i profili di intensità fluorescenti di tutte le celle come una media della fluorescenza di ciascuna cellae. </li><li> Esegui l&#39;intero script &quot;profili di cella function.R&quot; in R [versione 3.0.1; 11 ]. </li><li> Modificare lo script &quot;example plots.R&quot; nella riga 30 in modo tale che il percorso del file si riferisca alla cartella in cui viene salvato il file .csv generato in precedenza. Inoltre, modificare il nome del file &quot;profile.csv&quot; nella riga 31 al nome del file scelto per il file .csv generato nel passaggio 5.9.4. Successivamente, eseguire &quot;esempio plots.R&quot; e seguire la documentazione da &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; nonché i commenti del file di script per generare l&#39;analisi demografica. </li></ol></li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Questo documento descrive un metodo per l&#39;imaging microscopico delle cellule swarmer V. parahaemolyticus seguito da analisi a valle destinate a risolvere e quantificare la localizzazione subcellulare e altre caratteristiche delle proteine ​​studiate fluorescenti. Sebbene esistano diversi strumenti per l&#39;elaborazione e l&#39;analisi di immagini microscopiche 14 , 15 , 16 , <sup class="xre...

I batteri sperimentano costantemente cambiamenti nel loro ambiente esterno e hanno sviluppato diverse tecniche per modificare e adattare il loro comportamento di conseguenza. Uno di questi meccanismi comporta la differenziazione in tipi cellulari distinti che meglio integrano l&#39;ambiente alterato. La differenziazione comporta spesso importanti cambiamenti nella regolazione del ciclo cellulare, nella morfologia delle cellule e nell&#39;organizzazione spaziale delle cellule. Un organismo che può subire la differenziazione è Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartiene alla Vibrionaceae , che è una famiglia di proteobatteri che abitano abitualmente acqua fresca o salata. Vibrionaceae sono ampiamente distribuite nell&#39;ambiente e includono diverse specie che causano infezioni del tratto intestinale nell&#39;uomo, incluso anche Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus è un organismo dimorfico ed è in grado di differenziarsi in due distinti tipi di cellule come risposta per accogliere i cambiamentiAmbiente esterno. In ambienti acquosi, esiste come una breve cella da nuoto a forma di bastoncello con un singolo flagello polare posizionato all&#39;antico palo di cella. A contatto con la superficie, viene attivata la differenziazione in una cellula swarmer. La differenziazione delle cellule swarmer comporta due importanti cambiamenti: la morfogenesi delle cellule swarmer attraverso l&#39;inibizione della divisione cellulare e l&#39;induzione di un secondo sistema flagella. Ciò determina la formazione di una cellula swarmer a forma di forma a forma di forma e molto allungata, che può continuare lo stile di vita swarmer, dove gli eventi di divisione producono cellule swarmer di progenie o alternativamente si differenziano in cellule nuotatori. Sono stati riportati diversi fattori per indurre o influenzare la differenziazione del swarmer. Lo stimolo primario sembra essere guidato da meccanosensing dove V. parahaemolyticus utilizza il flagello polare come un sensore tattile che rileva l&#39;inibizione della rotazione sul contatto di superficie, ma sono coinvolti diversi altri fattoriBene 1 . Nel laboratorio, la rotazione del flagello polare può essere inibita artificialmente mediante l&#39;aggiunta di fenamil, che blocca la rotazione flagellare guidata dal canale sodico, inducendo così la differenziazione swarmer 2 . Inoltre, in uno studio precedente , Vibrio alginolyticus è stato indotto a sciogliersi su supporti solidi quando le cellule sono state propagate su un mezzo di crescita in un piatto di Petri sigillato con chiaro nastro di plastica. La carta filtrante satura alcalina impediva lo swarming in queste condizioni, suggerendo pertanto che uno o più acidi volatili potrebbero essere coinvolti nell&#39;induzione dello swarming. Così, sigillare il piatto di Petri con nastro di plastica probabilmente consentito per l&#39;accumulo di acidi volatili, formati come sottoprodotti di metabolismo cellulare, all&#39;interno dello spazio testa della piastra. Lo stesso effetto è stato raggiunto quando H2O2 è stato aggiunto al mezzo di crescita in piatti Petri non sigillati per produrre artificialmente acidi volatili idrolizzando i componenti mediali <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . Tuttavia, l&#39;identità di tali acidi volatili rimane sconosciuta. Inoltre, è stato dimostrato che l&#39;eccesso di disponibilità del calcio 6 e della limitazione di ferro 7 aumentano entrambe la differenziazione e la proliferazione di swarmer sulle superfici solide. Le cellule possono essere affamate per il ferro aggiungendo il composto 2,2&#39;-Bipyridyl al mezzo di crescita, che ha dimostrato di influenzare la differenziazione del swarmer 8 . I fattori noti per la regolazione della differenziazione sono ora implementati nella progettazione di un protocollo che riproducibilmente induce la differenziazione di V. parahaemolyticus in cellule swarmer e la loro proliferazione sulle superfici agariche solide. V. la differenziazione del parahaemolyticus comporta grandi cambiamenti nella regolazione della divisione cellulare, nella morfologia cellulare e nel posizionamento di macchine macromolecolari come flagellA e chemiotassi - processi che richiedono la localizzazione specifica delle proteine ​​secondo il ciclo cellulare. Così, la capacità di studiare la localizzazione intracellulare di tali proteine ​​è essenziale per la comprensione dei suddetti processi cellulari. Per eseguire tali studi è necessaria la microscopia a fluorescenza sulle singole cellule. Ciò può essere particolarmente impegnativo quando le cellule di immagini che esistono all&#39;interno di popolazioni batteriche densi, come avviene per le cellule swarmer. Ci sono stati tentativi di indurre una differenziazione di swarmer in supporti liquidi, che potenzialmente potrebbero generare singole cellule per studi di microscopia. E sebbene su un livello trascrizionale queste cellule hanno in parte indotto il programma di differenziazione swarmer, non subiscono gli stessi cambiamenti morfologici distinti, come le cellule swarmer completamente differenziate coltivate su un mezzo solido 8 . Questo documento offre un protocollo robusto e riproducibile di un metodo per indurre swarmer ceLl differenziazione su una superficie di agar. Il protocollo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili prontamente disponibili per la microscopia a cellule singole e successive analisi. Inoltre, il protocollo consente di localizzare studi di proteine ​​etichettate con fluorescenza in entrambi i tipi di nuoto e swarmer (sezioni 1, 2, 3, 4). Inoltre, il protocollo descrive il flusso di lavoro successivo su come elaborare e analizzare i dati generati dagli esperimenti di microscopia a fluorescenza, che consente l&#39;analisi demografica delle società batteriche (sezione 5).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar, granulated</td>
			<td>BD</td>
			<td>214510</td>
			<td>For preparation of LB agar with LB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Heart Infusion Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>244400</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose NEEO, ultra quality</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2267.3</td>
			<td>For preparation of microscopy agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5118.3</td>
			<td>Used to induce pBAD derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2`-Bipyridyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D216305-25G</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.1</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Standard recipe for Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) Sucrose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For preparation of electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.5</td>
			<td>For preparation of electrocompetent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 150x20mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>For preparation of HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kelvitron t (B 6420)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for drying HI agar swarming plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652662</td>
			<td>Used for elctroporation of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for microscopy image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for microscopy data analsis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells

La capacità di studiare la localizzazione intracellulare delle proteine ​​è essenziale per la comprensione di molti processi cellulari. A sua volta, questo richiede la possibilità di ottenere singole celle per la microscopia a fluorescenza, che può essere particolarmente impegnativa quando le cellule di immagini che esistono all&#39;interno delle comunità batteriche. Ad esempio, il patogeno umano Vibrio parahaemolyticus esiste come brevi cellule nuotatori a forma di bastoncino in condizioni liquide che, al contatto con la superficie, si differenziano in una sottopopolazione di cellule swarmer altamente allungate specializzate per la crescita su superfici solide. Questo articolo presenta un metodo per eseguire un&#39;analisi microscopica di una singola cellula di V. parahaemolyticus nei suoi due stati differenziali. Questo protocollo produce molto riproducibilmente la differenziazione del V. parahaemolyticus in un ciclo vitale della cellula swarmer e facilita la loro proliferazione su superfici solide. Il metodo produce fasci di cellule swarmer differenziate che si estendono da tÈ il bordo della colonia. Notevolmente, alla punta delle bruciature di swarm, le cellule swarmer esistono in un unico strato di cellule, che consente loro facile trasferimento a una diapositiva del microscopio e successiva microscopia a fluorescenza di singole cellule. Inoltre, viene presentato il flusso di lavoro dell&#39;analisi delle immagini per la rappresentazione demografica delle società batteriche. Come prova del principio, è descritta l&#39;analisi della localizzazione intracellulare delle matrici di segnalazione chimotassie in nuotatori e cellule swarmer di V. parahaemolyticus.

Induzione della differenziazione e della generazione di colonie di brulicante La figura 1 fornisce uno schema delle fasi importanti per la produzione di colonie di V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Una cultura del nuotatore è stata individuata su agar aghi e incubata a 24 ° C, inducendo una differenziazione e una proliferazione del swarmer sulla superficie del solido agar...

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Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l&#39;analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l&#39;induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l&#39;analisi delle immagini.

Induzione della differenziazione cellulare e dell&#39;immagine delle cellule singole di<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Nuotatore e cellule Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

9.3K Views.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology.  Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l'analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l'induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l'analisi delle immagini. 

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni intracellulari di Neisseria meningitidis E umano α-actinina da Imaging confocale

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

La colonizzazione delle Euprymna scolopes Squid da Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; E Altro<em&gt; Vibrio</em&gt; Specie

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Molto multiplo, la risoluzione super-risoluzione delle celle T utilizzando la madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression of proteins known to respond to metabolic stress was measured in brain-nuclei isolates using Western blotting. This was done to assess whether metabolic stress-induced nutrient insufficiency in the body triggered neuronal stress. We have previously demonstrated that nutrient insufficiency in neonates elicits metabolic stress in the gut. Furthermore, colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi prior to and after first feed. Signaling protein markers associated with the endoplasmic reticulum stress [ER chaperone binding immunoglobulin protein (BiP), eukaryotic translation initiation factor 2A (eIF2a), and eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], as well as two inflammation-signaling proteins [nuclear factor-&#954;B (NF-kB) and inhibitor &#954;B (IkB)], were measured in newborn brain nuclei [nucleus of the solitary tract (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum nuclei (STR), and medial preoptic nucleus (MPO)] before the first feed (unprimed by colostrum) and after the start of nursing (primed by colostrum). Expression of BiP/GRP78 and p-eIF2a were upregulated in unprimed and downregulated in primed NTS tissue. NF-kB was retained (high) in the CX, STR, and MPO cytoplasm, whereas NF-kB was lower and unchanged in NTS, PVN, and SON in both conditions. The collective BiP and p-eIF2 findings are consistent with a stress response. eIf2a was phosphorylated by dsRNA dependent kinase (p-PKR) in the SON, CX, STR, and MPO. However, in the NTS (and to a lesser extent in PVN), eIf2a was phosphorylated by another kinase, general control nonderepressible-2 kinase (GCN2). The stress-modulating mechanisms previously observed in newborn gut enterocytes appear to be mirrored in some OTR-rich brain regions. The NTS and PVN may utilize a different phosphorylation mechanism (under nutrient deficiency) from other regions and be refractory to the impact of nutrient insufficiency. Collectively, this data suggests that brain responses to nutrient insufficiency stress are offset by signaling from colostrum-primed enterocytes.

Here, we present a protocol to isolate brain nuclei in the neonatal rat brain in conjunction with first colostrum feeding. This technique allows the study of nutrient insufficiency stress in the brain as modulated by enterocyte signaling.

Valutazione Stress cellulare e l'infiammazione nei Nuclei di cervello che secerne l'ossitocina discreti nel ratto neonatale prima e dopo la prima poppata di colostro

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Induzione della differenziazione cellulare e dell'immagine delle cellule singole di

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