Questo lavoro è stato supportato dal NSF sotto il premio MCB-1330685. DWM riconosce un sostegno parziale dalla Grant di Formazione Molecolare Biofisica dell&#39;Università Cornell (NIH T32GM0082567).

ATTENZIONE: Prima dell&#39;utilizzo, consultare tutti i fogli di sicurezza relativi ai materiali di sicurezza (MSDS). Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si utilizzano gas compressi, inclusi regolatori e valvole di manipolazione del gas calibrati e tubi approvati del gas. Il contatto con criogenici liquidi può causare gravi lesioni o necrosi. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (scudo a faccia, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse) che devono essere impermeabili all&#39;azoto liquido. Rimanere in piedi e assicurare un percorso di uscita senza ostacoli dall&#39;apparecchio quando si utilizzano criogenici liquidi. Prestare attenzione ai pericoli di asfissia quando si utilizzano gas compressi e criogenici liquidi e lavorano in un&#39;area ben ventilata con aria adeguata (un cappuccio o una stanza ad alta velocità di rotazione dell&#39;aria). 1. Preparazione di soluzioni acquose per misure di densità NOTA: Poiché i pesi sono più facilmente misurati ad un&#39;alta precisione di volUm, le concentrazioni di soluzione sono misurate in unità w / w. Tutte le densità e le temperature di fusione o di ebollizione assumono una pressione atmosferica di ~ 100 kPa. Le seguenti fasi descrivono la preparazione di una soluzione al glicerolo al 35% in peso. La stessa procedura può essere utilizzata per altre concentrazioni e soluti. <ol><li> Per ogni tipo di soluto e concentrazione di interesse, stimare approssimativamente la massa soluta richiesta per ottenere la concentrazione finale desiderata ( es . Fra il 25% w / w e il 100% w / w) per un volume totale di soluzione, V tot = 10 ml di volume di soluzione . Ad esempio, per una soluzione al glicerolo al 35% in peso ( ρ s = 1,26 g / mL), la massa solida, m s è: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq1.jpg" /> Dove x è la frazione di massa soluto (0,35) e ρ w = 1 g / mL è la densità dell&#39;acqua. </li><li> Inserire un tubo di centrifuga da 15 ml (o altro contenitore impermeabile calibrato in volume) sul tegameDi un microbalance analitico. Dispensare la massa desiderata di soluto / crioprotectante ( es . 3,77 g di glicerolo per una soluzione al 35% w / w) nel tubo e registrare la massa soluta effettiva. </li><li> Aggiungere acqua di deionizzazione ad alta purezza (&gt; 18 MΩ) per portare la massa totale fino a 10.0 g </li><li> Vorticare il contenitore per 30 s (per soluti liquidi) o 5 minuti (per solidi solidi), finché la soluzione è otticamente omogenea. </li><li> Misurare e registrare la massa finale della soluzione. Sigillare il contenitore con un tappo a tenuta stagna e conservare a temperatura costante (293-298 K). </li></ol> 2. Preparazione della camera di raffreddamento del campione <ol><li> Posizionare l&#39;apparecchio sperimentale descritto di seguito in un contenitore e scorrere l&#39;aria secca (&gt; 5% di umidità relativa (rh)) nel contenitore. NOTA: L&#39;involucro può essere un semplice telaio in metallo con i suoi tre e tre lati sigillati con foglio di plastica trasparente e con accesso esperimento tramite un quarto lato rivestito con foglio di plastica flessibile. IndossareScudi a faccia e copertura completa per ridurre al minimo l&#39;umidità introdotta dall&#39;esperto. La condensa di umidità e la formazione di ghiaccio possono interferire con le misurazioni della densità di temperatura criogenica in diversi modi e quindi deve essere minimizzata. </li><li> Posizionare un disco di gomma al neoprene sulla base di un pallone di vetro da 4,5 L di Dewar, per proteggere il pallone Dewar da danni. </li><li> Inserire con cautela un&#39;alta camera di rame di conducibilità termica (un cilindro cavo con fondo sigillato) nel pallone fino a quando si appoggia sul disco di gomma. Regolare i supporti che sporgono verso l&#39;esterno dalla camera alle pareti Dewar in modo che la camera sia centrata e non abbia alcuna tendenza alla roccia. NOTA: Il pallone Dewar manterrà l&#39;azoto liquido e la camera di rame di volume molto più piccola avrà una miscela liquida N 2 -Ar. L&#39;azoto liquido fornisce un bagno termico che mantiene la camera di rame ei suoi contenuti ad una temperatura costante di 77 K e riduce le perdite di ebollizione e evaporativi nella camera. La Camera&amp;#Il piccolo diametro impedisce le onde superficiali che possono interferire con le misurazioni della galleggiabilità e aiuta a isolare il liquido all&#39;interno della camera dal gelo e dal ghiaccio formati altrove nell&#39;apparato. </li><li> Inserire l&#39;uscita di un tubo di gas con gas N2 secco che scorre a ~ 2 L / min fino alla parte inferiore della camera di rame e spurgare la camera d&#39;aria umida. </li><li> Versare lentamente l&#39;azoto liquido nel pallone Dewar, al di fuori della camera di rame, lasciando il tempo per l&#39;ebollizione dell&#39;azoto. NOTA: il livello finale di riempimento, dopo la cottura, è interrotto entro circa 4 cm dalla parte superiore della camera di rame. </li><li> Coprire la parte esterna del pallone Dewar con un coperchio isolante in schiuma anulare. Rimuovere il tubo di spurgo del gas N2 secco dalla camera di rame e inserire in un&#39;apertura corrispondente nel coperchio. NOTA: La combinazione del gas N2 dal boil-off nel pallone Dewar e dal flusso di spurgo esclude qualsiasi aria umida e impedisce la condensazione e la cristallizzazione oN superfici fredde. </li><li> Versare lentamente l&#39;azoto liquido nella camera di rame. Il livello finale di riempimento, dopo la bollitura, è interrotto, dovrebbe essere di circa 4 cm dalla parte superiore della camera di rame. </li><li> Posizionare un foglio di plastica sottile e trasparente sull&#39;apertura centrale o sfiato nel coperchio e ridurre la portata di gas N 2 a ~ 0,2 L / min, lasciando una leggera sovrapressione del gas N2 all&#39;interno degli spazi di gas sopra i liquidi criogenici. NOTA: fintanto che i liquidi criogenici sono presenti nel Dewar e nella camera, continuare a regolare il flusso del gas N 2 , come necessario per mantenere questa sovrapressione e impedire l&#39;ingresso dell&#39;acqua nel Dewar e formare ghiaccio. </li></ol> 3. Determinazione del volume e della densità della massa di prova a T = 298 K e T = 77 K <ol><li> Determinare la massa apparente di una massa di prova di PTFE da 1 a 0.4 mL ( Tabella dei materiali ) in aria a T = 298 K, posizionandola sulla padellaDi un microbalance analitico calibrato. </li><li> Determinare il volume V (298 K) della massa di prova a T = 298 K utilizzando un picnometro a gas o per misure dimensionali con caliper. Se si utilizzano misure dimensionali, la massa di prova deve avere una forma semplice e precisa (senza fori o angoli arrotondati) e deve essere determinato il volume del foro passante (per la linea di sospensione). </li><li> Calcolare la massa m della massa di prova correggendo la massa apparente misurata per la forza di galleggiamento esercitata dall&#39;aria secondo quanto segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq2.jpg" /> Dove ρ aria = 1,23 g / L (correzione ~ 0,1%). </li><li> Posizionare il microbalance su una piattaforma stabile circa 10 cm sopra il pallone Dewar e verificarne la taratura. Sospendere la massa di prova usando una linea monofilamento da 2 mil (50 μm) attaccata dal gancio sul lato inferiore del microbalance (progettato per misurare le misure di massa) e lanciareUn foro nella massa di prova. Determinare la massa apparente in aria e confrontare con la misurazione nel punto 3.3, correggendola come necessario per la massa della linea. </li><li> Determinare il volume V (77 K) della massa di prova a T = 77 K misurando la sua massa apparente in azoto liquido puro, m in LN2 . Abbassare la massa di prova nell&#39;azoto liquido all&#39;interno della camera di rame finché non sia completamente sommersa. Quando la bollitura è cessata, misurare la massa apparente. NOTA: Se l&#39;azoto liquido nella camera di rame è fermo e le correnti d&#39;aria tra il microbalance e la superficie liquida sono minime, questa massa può essere misurata con una precisione superiore a ± 0,0002 g. </li><li> Valutare la forza di galleggiamento sulla parte sommersa della linea e verificare che sia piccola rispetto agli errori di misura. </li><li> Calcolare il volume e la densità della massa di prova a 77 K utilizzando la relativa massa m nota e la massa apparente misurata in LN2 a 77 K, m app iN LN2, secondo quanto segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq3.jpg" /> Dove ρ LN2 ( 77 K) = 0.807 g / mL. </li></ol> 4. Preparazione della Miscela Liquida N 2 -Ar iniziale <ol><li> Flusso Ar gas ad una portata di ~ 2 L / min attraverso un tubo avvolto a sua uscita. Posizionare il tubo avvolto sopra le guide superiori che stabilizzano la posizione della camera di rame, appena sopra il livello dell&#39;azoto liquido e sotto la superficie superiore del Dewar. Gas freddi N 2 e Ar si accumuleranno sopra i liquidi criogenici, e la conduzione termica, la convezione e la radiazione raffreddano il tubo e il gas Ar all&#39;interno. </li><li> Dopo aver lasciato raffreddare il tubo avvolto per 5 minuti, posizionare l&#39;uscita del tubo nella camera di rame, almeno 10 cm sotto la superficie dell&#39;azoto liquido. Quindi coprire il Dewar con il coperchio anulare e il foglio trasparente. </li><li> Regolare la portata Ar fino ad aumentare le bolle di ArDalla presa del tubo alla superficie superiore dell&#39;azoto liquido. Quindi ridurre la portata fino a quando le bolle si formano all&#39;uscita, ma si dissolvono o liquefatti appena prima di rompere la superficie dell&#39;azoto liquido. NOTA: Quando aumenta la concentrazione di Ar nella camera di rame, regolare periodicamente la velocità di flusso Ar per mantenere la formazione di bolle. Se la portata Ar è troppo bassa, l&#39;Ar può bloccarsi all&#39;interno del tubo e bloccare il flusso. </li><li> Aggiungere l&#39;azoto liquido come necessario per mantenere il suo livello nel Dewar circostante. Rimuovere il ghiaccio mentre si accumula sulle superfici fredde. </li><li> Mescolare periodicamente il liquido inserendo un sottile foglio di fogli di rame ( ad esempio , 35 micron), circondato da un sottile strato isolante nella camera di rame e spostandolo lentamente verso l&#39;alto e verso il basso come un pistone. Ciò ridurrà i gradienti di concentrazione e la tendenza ad Ar di cristallizzarsi fuori dalla soluzione. </li></ol> 5. Misurazione e regolazione della densità della miscela iniziale N 2 -Artura <ol><li> Calcolare la densità di bersaglio per la miscela N 2 -Ar misurando la densità T = 77 K del campione da misurare, ad esempio , misure a concentrazioni più elevate del componente non acquoso del campione. </li><li> Fissare la massa di prova utilizzando la linea monofilamento al gancio sul lato inferiore della vaschetta di misurazione del microbalance, misurare la sua massa apparente in aria e confermare l&#39;accordo con la misura nel punto 3.1. </li><li> Mescolare la soluzione N 2 -Ar per eliminare gradienti di concentrazione e densità come al punto 4.5. </li><li> Portare la massa di prova a T = 77 K abbassandola nell&#39;azoto liquido al di fuori della camera di rame. Sollevare la massa di prova nello strato freddo di gas azotato sopra l&#39;azoto liquido, aspettare che l&#39;azoto liquido residuo venga evaporato dalla massa di prova e quindi abbassare la massa di prova fredda e secca nella miscela N2 -Ar finché non sia completamente sommersa Entro 2 cm dalla superficie liquida. </li><li&gt; Dopo che le onde di ebollizione e di superficie sono scomparse, misurare la massa apparente della massa di prova. Calcolare la densità della soluzione usando la sua vera massa m e T = 77 K volume V (77K) dal punto 3.7 come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq4.jpg" /></li><li> Aumenta la densità della soluzione scorrendo Ar supplementare fino a ottenere la densità iniziale desiderata. Le gocce di campione che il lavandino possono facilmente essere perse, quindi la densità iniziale dovrebbe essere almeno un paio di percentuale superiore alla densità di campione prevista. Il campione sarà quindi fluttuante, rendendolo più facile da tenere traccia e la densità di miscela N 2 -Ar sarà quindi solo necessaria per essere regolata verso il basso aggiungendo liquido N 2 . </li><li> Rimuovere il tubo avvolgibile di precarica Ar e lasciare che si riscaldi e asciughi prima dell&#39;uso successivo. </li></ol> 6. Gocce di raffreddamento di soluzione campione <ol><li> Immediatamente prima di erogare l&#39;erogazione e raffreddare, ripetere il passo 1.5 a miX il liquido criogenico dell&#39;azoto / argon. Fare attenzione a non introdurre bolle. </li><li> Rimuovere il cappuccio ermetico del tubo di campionamento. Usando una siringa pulita da 1 ml, estrarre fino a 1 ml di soluzione e sostituire il tappo. Fissare un ago da 27 a 33 G sulla siringa e quindi spingere una piccola quantità di campione attraverso l&#39;ago per espellere l&#39;aria e tutti i residui della precedente erogazione. </li><li> Due metodi possono essere utilizzati per proiettare gocce di campioni nella miscela N 2 -Ar. <ol><li> Per i campioni con grandi concentrazioni di componenti non acquose (&gt; 45% w / w) che possono essere vitrificate con modeste velocità di raffreddamento, premere leggermente la siringa per spostare un diametro piccolo (da 250 μm a 1 mm), ~ 10 nL a una goccia di 1 μl Che appende dalla punta dell&#39;ago per tensione superficiale. Toccare delicatamente l&#39;ago per staccare e proiettare la goccia verso la miscela liquida N 2 -Ar. </li><li> Per i campioni che richiedono un raffreddamento più veloce per la vitrificazione, posizionare l&#39;uscita di un tubo di gas collegato ad un generatore di vuotoO (fornito da aria compressa in laboratorio) nello spazio del gas sopra la miscela liquida N 2 -Ar e aspira delicatamente lo strato di gas freddo che forma. Ciò aumenta i tassi di raffreddamento per piccoli campioni 11 . <ol><li> Toccare con cautela la punta dell&#39;ago a una striscia di polimero trasparente di 25-75 μm per distribuire un piccolo volume (&lt;10 nL, corrispondente a un diametro di goccia &lt;200 μm) di campione. NOTA: per ottenere le gocce più piccole, quasi sferiche e facilmente rimosse, immergere la striscia in una soluzione di rivestimento idrofoba per 10 min e lasciare asciugare prima dell&#39;erogazione del campione. </li><li> Afferrare la striscia usando una barra di plastica o di legno attaccata e immergere manualmente l&#39;asta più la striscia nella miscela liquida N 2 -Ar. </li><li> Una volta che la goccia è solidificata e la bollitura è cessata, afferrare il bordo della striscia di fronte all&#39;asta utilizzando le pinzette. Fissare la striscia, mantenendola immersa nel liquido N 2 -Ar, finché la goccia di campione scompare e galleggia al surfasso. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Valutazione dello stato del campione <ol><li> Utilizzando una lunga distanza di lavoro (5-10 cm) di microscopio binoculare e un&#39;illuminazione luminosa e fresca da un LED o da un illuminatore a fibre ottiche, esaminare attentamente la goccia mantenendola immersa nel liquido N 2 -Ar. Le gocce vitrificate devono apparire chiare 12 , 13 . Rifiutare le gocce nocive o nuvolose (probabilmente contenenti più di una fase) e / o che mostrano imperfezioni ottiche, incluse le crepe (che possono essere associate a vuoti che modificano la densità media). NOTA: la verniciatura della superficie interna della camera di rame per fornire uno sfondo nero può facilitare l&#39;identificazione delle imperfezioni del campione. </li></ol> 8. Determinazione della densità del campione <ol><li> La goccia dispensata inizialmente gallegherà, sprofonda o (raramente) sarà neutrale in galleggiante nella miscela N 2 -Ar.A volte le gocce galleggianti possono essere tese da tensioni superficiali, piccole bolle o particelle di ghiaccio aderenti. Ispezionare l&#39;intera superficie di goccia con il microscopio. Spostare la goccia verso il basso dalla superficie del liquido usando una piccola plastica o legno in legno pre-refrigerato (2-3 mm di diametro, 10 cm) e osservare la sua risposta. </li><li> Se la goccia scende, aumentare la densità del liquido N 2 -Ar utilizzando la procedura nel punto 4 finché la goccia diventa neutrale o galleggia. </li><li> Se la goccia fluttua, diminuire la densità del liquido N 2 -Ar aggiungendo l&#39;azoto liquido usando un cryovial da 1,8 ml. A grandi densità di miscela iniziali (1,2-1,3 g / mL), l&#39;aggiunta di N2 in incrementi di 1 mL dà notevoli cambiamenti di densità, ma questo dovrebbe essere aumentato verso 5 mL a bassa densità (0,8-0,9 g / mL). Mescolare delicatamente il N 2 -Ar (in modo da non perdere la traccia della goccia di campione) usando la sottile fogli di foglio di rame perforata in alto e in basso nella camera di rame. </li><li> Dopo ogni aggiunta di N 2, Utilizzare una piccola barra pre-raffreddata per spostare delicatamente la goccia fluttuante verso il basso nel liquido e osservare la sua velocità tornando alla superficie. </li><li> Quando la densità della soluzione è stata regolata in modo che la goccia sembri essere neutrale o ascenda molto lentamente (&lt;50 μm / s garantirà una precisione di densità dello 0,1% o superiore per gocce con volumi fino a 50 pL) Ar come descritto al passaggio 5. Quindi aggiungere liquido addizionale N 2 fino a quando la goccia inizia innanzitutto a scendere lentamente e misurare nuovamente la densità della miscela N 2 -Ar. Queste due misure forniranno limiti alla densità di goccia. </li></ol>

<ol>
	<li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Cryopreservation+by+Vitrification.">Principles of Cryopreservation by Vitrification.</a> Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).</li><li>Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -. C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+eggs.">Cryopreservation of eggs.</a> Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).</li><li>Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+cooling+and+annealing+of+protein+crystals.">Flash cooling and annealing of protein crystals.</a> Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).</li><li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+lattice+repacking+illustrates+the+temperature+dependence+of+macromolecular+interactions.">Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions.</a> J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).</li><li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-cooling+in+macromolecular+crystallography:+advantages,+disadvantages+and+optimization.">Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization.</a> Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).</li><li>Alcorn, T., Juers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+rational+methods+of+cryoprotection+in+macromolecular+crystallography.">Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).</li><li>Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Droplet+Theory+Explains+the+Glass+Formability+of+Aqueous+Solutions.">Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions.</a> Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).</li><li>Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+transfer+from+protein+crystals:+implications+for+flash-cooling+and+X-ray+beam+heating.">Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating.</a> Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).</li><li>Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoflotation:+Densities+of+amorphous+and+crystalline+ices.">Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices.</a> J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).</li><li>Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+contraction+of+aqueous+glycerol+and+ethylene+glycol+solutions+for+optimized+protein-crystal+cryoprotection+Thermal+contraction+of+aqueous+glycerol+and+ethylene+glycol+solutions+for+optimized+protein-crystal+cryoprotection.">Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection.</a> Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).</li><li>Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperquenching+for+protein+cryocrystallography.">Hyperquenching for protein cryocrystallography.</a> J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).</li><li>McFerrin, M. B., Snell, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+a+method+to+quantify+the+quality+of+cryoprotectant+solutions+using+standard+area-detector+X-ray+images.">The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images.</a> J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).</li><li>Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+size:+An+important+parameter+in+flash-cooling+macromolecular+crystallization+solutions.">Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions.</a> J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).</li><li>Bosart, L. W., Snoddy, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+gravity+of+glycerol.">Specific gravity of glycerol.</a> Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).</li><li>Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+the+excess+molar+volumes+of+binary+and+ternary+mixtures+containing+water+++(1,2-ethanediol,+or+1,2-propanediol,+or+1,3-propanediol,+or+1,2-butanediol)+++(1-n-butyl-3-methylimidazolium+bromide)+at+298.15+K+and+atmospheric+pressure.">Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure.</a> J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).</li><li>Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryoprotectant+concentration+and+cooling+rate+on+vitrification+of+aqueous+solutions.">Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions.</a> J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).</li><li>Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Radiation+Damage+Limit+with+Cryo-SAXS.">Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS.</a> Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli attuali apparecchi e metodi, sviluppati principalmente da studenti universitari con accesso limitato a strumenti e macchine per la costruzione di strumenti, forniscono tuttavia misurazioni di densità estremamente accurate per singole gocce di liquidi minori di 50 pL. Nel campo di concentrazione vicino e al di sopra del 50% in peso, dove piccoli tassi di raffreddamento sono sufficienti per ottenere campioni vetrificati, le densità sono d&#39;accordo con quelle ottenute nelle precedenti misurazioni sui campioni di massa. Le extrapolazioni delle densità attuali fino alla concentrazione del 0% - acqua pura - sono anche abbastanza concorde con la densità accettata di ghiaccio amorfo a bassa densità a 77 K 9 . Generare le miscele N 2 -Ar necessarie tra 30 min e 5 h di flusso Ar, a seconda della densità N 2 -Ar finale necessaria per rendere una determinata composizione di goccia neutramente flessibile. Questa volta può essere ridotta utilizzando un diffusore o più tubi di gas per aumentare la superficie per Ar mixinG nel liquido criogenico. La regolazione della densità di N 2 -Ar fino a quando una goccia è accertata di essere neutrale può anche richiedere molto tempo, specialmente per gocce di piccole raggio ( r ) con velocità minime del terminale ( <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq5.jpg" /> R 2 ) e richiedono quindi osservazioni più attenti. La miscela N2 -Ar tende a sviluppare un gradiente di densità / composizione verticale, e quindi deve essere mescolato regolarmente. Di conseguenza, la determinazione di un singolo punto di densità di fase vitrea per un determinato tipo di soluto e la concentrazione, che richiedono misure su almeno 3-5 gocce, può richiedere diversi h. Ad ogni concentrazione vengono misurate tipicamente le densità di due o tre gocce. La &quot;densità&quot; di ogni goccia è stimata come la media dei limiti superiori e inferiori misurati sulla densità, data dalla più grande densità N 2 -Ar misurata che ha fatto il lavandino e la più piccola densità che la ha fatta galleggiare. Poiché sia ​​un limite superiore stretto che un limite inferiore stretto - dove la tenuta è valutata dalla velocità di salita o discesa della goccia - non sempre vengono ottenute nelle misurazioni su una data goccia ( ad esempio , la goccia può essere persa durante la miscelazione), le misurazioni Su gocce della stessa concentrazione e dimensione sono stati talvolta combinati in una stima di una singola densità. Per ridurre i tempi di sperimentazione, sono stati fatti tentativi di preparazione e conservazione di miscele N 2 -Ar ad alta densità in contenitori criogenici per uso da uno a tre giorni più tardi. In tutti i casi, Ar si è cristallizzato dalla soluzione e la densità del liquido diminuisce con il tempo di conservazione. La solidificazione e la densità di liquidi diminuiscono anche durante le misurazioni della densità di goccia se il liquido N 2 -Ar non è stato mescolato regolarmente. Una sfida importante in queste misure è minimizzare la formazione di ghiaccio e formazione di ghiaccio. Condensazione del vapore acqueo, formazione di ghiaccio e accumulo di ghiaccio sulLa camera di raffreddamento del campione, su altre superfici fredde, nel gas freddo sopra la miscela N2 -Ar e nella miscela N2 -Ar stessa può contaminare i campioni utilizzati nelle misurazioni di densità, promuovere la nucleazione del ghiaccio all&#39;interno di esse e modificarne la densità apparente. Ghiaccio sul campione e galleggiante e nella miscela liquida N 2 -Ar può rendere difficile la valutazione dello stato di bassa temperatura (vetroso o policristallino) del campione. Per minimizzare la formazione del ghiaccio, controllare regolarmente tutte le superfici fredde per il ghiaccio. Rimuovere accuratamente qualsiasi ghiaccio meccanicamente o usando caldo N2 gas secco. Se il ghiaccio si accumula nella camera di rame, rimuoverlo usando uno schermo a maglia sottile, altrimenti togliere, vuotare, asciugare e ricaricare la camera. Il tasso di raffreddamento minimo (critico) richiesto per ottenere un campione vitrificato aumenta con una diminuzione della concentrazione di soluto, avvicinandosi a 10 6 K / s per l&#39;acqua pura 7 . I tassi di raffreddamento del campione dipendono dalla forma e dalla dimensione della goccia (incrementoCon il diametro decrescente), la velocità con cui la goccia viene proiettata nel criogenico liquido, la presenza di gas freddo sopra il criogenico liquido (che in genere diminuisce i tassi di raffreddamento) e le proprietà del criogenico liquido. Generalmente, i tassi di raffreddamento più grandi di 1.000 K / s richiedono gocce con volumi (diametri) inferiori a ~ 1 nL (~ 100 μm). La concentrazione di solventi o crioprotettori più bassi per i quali può essere misurata la densità vitrea è impostata dai livelli massimi di raffreddamento a goccia e dalle minime gocce di dimensioni per le quali è possibile utilizzare in modo affidabile il saggio visivo per la vitrificazione. I tassi di raffreddamento potrebbero essere aumentati di un fattore di ~ 5 mediante raffreddamento di campioni in propano liquido o una miscela di propano-etano liquido. A differenza del liquido N 2 , questi liquidi criogenici hanno una grande separazione tra le temperature di ebollizione e di fusione e in tal modo possono assorbire molto più calore senza bolle di superficie che limita il trasferimento di calore. Le gocce raffreddate potrebbero quindi essere trasferite al N 2 -ArMiscela per misurazioni di densità. La transizione da gocce chiare a gocce nocive o nubi è brusca, che si verifica su una stretta gamma di concentrazioni di soluto (circa il 2% in peso) e velocità di raffreddamento ed è stata correlata con gli anelli di ghiaccio di apparenza nei modelli di diffrazione a raggi X 16 , 17 . Tuttavia, una precisa valutazione della chiarezza visiva diventa più difficile quando i volumi di caduta diminuiscono verso 10 pL. L&#39;intervallo di densità campione accessibile con miscele N2-Ar è regolato dalle densità dei liquidi puro, rispettivamente, 0,81 g / ml e 1,40 g / ml. Le miscele liquide Ar-Kr sono suscettibili alla cristallizzazione di Kr, ma potrebbero essere utilizzate per estendere questa gamma di densità a condizione che i liquidi siano stati costantemente mescolati. I metodi qui descritti sono generalmente applicabili alla determinazione delle densità di miscele acquose, cellule, aggregati cellulari, altri materiali biologici e altri sistemi in cui piccoli campioni eSono necessari grandi tassi di raffreddamento per ottenere la fase di bassa temperatura desiderata. Queste densità saranno utili per comprendere e minimizzare i danni provenienti dalla crioconservazione e per comprendere il comportamento dell&#39;acqua in soluzioni acquose e in ambienti confinati e affollati.

Le proprietà fisiche dell&#39;acqua e delle miscele acquose nelle loro varie fasi sono di interesse fondamentale e sono importanti per la comprensione in vivo e in vitro dei sistemi biologici. Nella criobiologia contemporanea e nella crioconservazione biologica sono particolarmente interessanti le fasi vitreose o amorfe di miscele crioprotectanti acquose 1 , 2 . La nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio possono interrompere le cellule e i tessuti e promuovere la denaturazione e l&#39;aggregazione delle proteine, per cui i protocolli di crioconservazione che vitrificano il solvente sono diventati sempre più popolari. Nella cristallografia biomolecolare, la cristallizzazione del solvente nei canali tra biomolecole distrugge i cristalli di cristallo e degrada le proprietà di diffrazione. La vitrificazione viene ottenuta attraverso una combinazione di rapido raffreddamento, disidratazione e aggiunta di solventi crioprotettori quali glicerolo, glicole etilenico, glicoli polietilenici (PEG),Alcoli e sali. Vitrificazione limita la cristallizzazione e la crescita del ghiaccio, ma non elimina tutti i danni provenienti dal raffreddamento. Per esempio, la mosaicità di cristallo (una misura della distribuzione degli orientamenti del piano di cristallo) aumenta regolarmente di un fattore da 10 a 100 quando i cristalli proteici vengono raffreddati in uno stato vitrificato 3 e i tassi di sopravvivenza post-dissolti delle cellule spermatiche e degli ovociti vitrificati variano ampiamente . Un meccanismo di danno è la contrazione differenziale del solvente e del materiale circostante durante il raffreddamento 3 , 4 , 5 . Il solvente di equilibrio e le concentrazioni di soluto all&#39;interno di un cristallo, di una cellula o di un tessuto dipendono dalla temperatura e il solvente più il soluto e il materiale circostante possono contrattare per quantità diverse. Il raffreddamento rapido può impedire la ridistribuzione del solvente e del soluto prima della vitrificazione e dei contratti differenziali<html> Può provocare grandi sollecitazioni inhomogenei e non equilibri che causano danni al campione. Gli approcci razionali per la riduzione dei danni causati dal raffreddamento potrebbero quindi beneficiare della conoscenza delle densità dipendenti dalla temperatura delle miscele acquose liquide e vetrificate. A concentrazioni di solventi superiori al 50% del soluto al peso della soluzione (w / w), la maggior parte delle miscele crioprotectanti acquose possono essere vitrificate con modesti tassi di raffreddamento di 10 K / s o meno, permettendo la produzione e la misurazione di densità utilizzando grandi campioni di vitreo 6 . La densità può quindi essere determinata usando il principio di Archimede, misurando il peso apparente del campione quando sospeso in un criogenico liquido come l&#39;azoto. Tuttavia, poiché la concentrazione del soluto diminuisce, i tassi di raffreddamento richiesti per la vitrificazione aumentano rapidamente: i tassi di raffreddamento per le miscele acquose di glicole aumentano da &lt;10 K / s al 50% di soluto in g al volume di soluzione in ml (v / v) a&gt; 1.000 K / s al 25% in pesoAss = &quot;xref&quot;&gt; 7. Il trasferimento di calore diventa limitato per i livelli di confine, in modo che raggiungere grandi velocità di raffreddamento richiedano campioni più piccoli e minori 8 . Le misure della densità dell&#39;acqua e del ghiaccio puro sono state ottenute depositare gocce di diametro del micrometro (volume femtolitore) in un vuoto su una superficie criogenica raffreddata in modo da costruire un campione macroscopico (massa grammaticale). La densità di questo campione è stata determinata mediante crioflotazione in una miscela di azoto-argon liquido in cui è stata regolata la densità del liquido criogenico fino a quando il campione è diventato neutrale 9 . Tuttavia, generare grandi campioni da un gran numero di piccole gocce in modo da ridurre al minimo i volumi vuoti - una fonte importante di errore nelle precedenti misurazioni di densità di fase in vitreo - non è banale. Per miscele acquose, l&#39;evaporazione differenziale dei componenti della soluzione durante l&#39;aerosolizzazione e la deposizione in un vuoto può portare aConsistenti incertezze nelle concentrazioni depositate. Abbiamo sviluppato un metodo basato su crioflotazione che consente una precisa determinazione della densità di miscele acquose utilizzando singole gocce minori di 50 pL 10 . Queste gocce possono essere rapidamente raffreddate pur mantenendo le loro concentrazioni originali e il loro stato di temperatura criogenica (vetrificato o cristallino) può essere valutato utilizzando un semplice test visivo correlato alle misure di diffrazione del raggio X. Questo metodo è ampiamente applicabile a miscele acquose e non acquose e può essere esteso ad una varietà di campioni biologici, incluse le cellule ( ad es . Stelo e uovo), campioni di tessuto e cristalli proteici aventi densità a bassa temperatura tra 0,8 e 1,4 g / mL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">centrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">6029236</td>
			<td style="width:167px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol, &#62;99.5%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G9012-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethylene glycol, &#62;99.8%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>324558-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analytical microbalance</td>
			<td style="width:71px;">Mettler</td>
			<td style="width:119px;">AE240</td>
			<td>Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">vortexer</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:119px;">SI-0236</td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Apparatus enclosure framing</td>
			<td style="width:71px;">Unistrut&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1-5/8&#34; metal framing</td>
			<td>48&#34; wide x 24&#34; deep x 40&#34; tall&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus enclosure air barrier</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any clear plastic sheeting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">neoprene rubber disk</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4&#34; diameter, 1/8&#34; thick</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dewar flask</td>
			<td style="width:71px;">Scilogix Dilvac</td>
			<td style="width:119px;">SS333</td>
			<td>4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">copper chamber</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This fabricated part is comprised of a 1.43&#34; diameter, 0.017&#34; wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.&#160; The copper base is 0.87&#34; tall and the overall chamber height is 7&#34;.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">NI HP300</td>
			<td>99.998% pure N2 gas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">argon gas</td>
			<td style="width:71px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">AR HP300</td>
			<td>99.998% pure Ar gas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">rotameter</td>
			<td style="width:71px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">FL3692ST</td>
			<td>2.52 l/min max flow rate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">foam insulating lid</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42&#34;, and ID of 1.52&#34;, and a thickness of 0.79&#34;.&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PTFE test mass</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This fabricated part is a 0.246&#34; diameter, 0.580&#34; tall cylinder with a 0.060&#34; diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10&#34; from one end.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">microbalance platform</td>
			<td style="width:71px;">Unistrut</td>
			<td style="width:119px;">1-5/8&#34; metal framing</td>
			<td>11&#34; wide x 24&#34; long x 24&#34; high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2 mil (50 um) monofilament line</td>
			<td style="width:71px;">Berkley</td>
			<td style="width:119px;">NF1502-CM</td>
			<td>Nanofil fishing line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Argon precooling coil tubing</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">60985-512</td>
			<td>1/8&#34; ID x 1/4&#34; OD PVC tubing</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">perforated copper foil mixer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1.4&#34; diameter,&#160; 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.&#160; Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">syringe</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309628</td>
			<td>1 ml Luer-Lok tip syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">vacuum generator</td>
			<td style="width:71px;">Gast</td>
			<td style="width:119px;">VG-015-00-00</td>
			<td>compressed air venturi single stage vacuum generator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">hydrophobic coating spray</td>
			<td style="width:71px;">RainX</td>
			<td style="width:119px;">620036</td>
			<td>plastic water repellent</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">long focal length stereo microscope</td>
			<td style="width:71px;">Bausch and Lomb Stereozoom 6</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LED ring illuminator</td>
			<td style="width:71px;">Amscope</td>
			<td style="width:119px;">LED144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LED spot illuminator</td>
			<td style="width:71px;">Newhouse Lighting</td>
			<td style="width:119px;">NHCLP-LED</td>
			<td>3W LED gooseneck clamp lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.8 ml cryo vial</td>
			<td style="width:71px;">Nunc</td>
			<td>V7634-500EA</td>
			<td>Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the densities of aqueous glasses at cryogenic temperatures

Abbiamo dimostrato un metodo per determinare le densità di temperatura criogenica a fase vitrea di miscele acquose e altri campioni che richiedono un raffreddamento rapido, per preparare la fase di temperatura criogenica desiderata. I microlitri a gocce di dimensioni del picoliter vengono raffreddate proiettando in una miscela di azoto liquido (N 2 -Ar). La fase di temperatura criogenica della goccia viene valutata usando un test visivo correlato alle misure di diffrazione del raggio X. La densità della miscela liquida N 2 -Ar viene regolata aggiungendo N 2 o Ar finché la goccia diventa neutrale. La densità di questa miscela e quindi della goccia è determinata usando una massa di prova e il principio di Archimede. Con la cura appropriata nella preparazione della goccia, la gestione del gas sopra la miscela criogenica liquida per ridurre al minimo la gelosia e la miscelazione regolare della miscela criogenica per prevenire la stratificazione della densità e la separazione di fase, le densità accurate a &lt;0,5% di gocce minori di 50 pLFacilmente determinato. Le misurazioni sulle miscele crioprotettanti acquose permettono di conoscere l&#39;azione crioprotrattante e fornire dati quantitativi per facilitare la corrispondenza della contrazione termica nella crioconservazione biologica.

Le misure di densità a T = 77 K per le gocce vitrificate di glicerolo acquoso e di glicole etilenico rispetto alla concentrazione di crioprotectant sono riportate rispettivamente in Figura 1 A e Figura 1 B e la corrispondente variazione del volume specifico tra T = 298 K e 77 K, calcolata utilizzando precedentemente Determinato T = 298 K densità, è mostrato in Figura 2 . A concentrazioni elevate di crioprotectanti, le soluzioni si contraggono sul raffreddamento allo stato vitrificato, mentre l&#39;acqua pura si espande. Nei prossimi 20-25% w / w soluzioni di entrambi i cryoprotectants sono previsti non mostrare alcuna espansione netta o contrazione. Il pendio del volume variabile rispetto alla concentrazione ha la grandezza maggiore al di sotto del 40% w / w, dove gli effetti di crioprotuctante aggiuntivo sulla struttura tetraedrica a bassa temperatura sono più pronunciate. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55761/55761fig1.jpg" /> Figura 1: Fase vitrea T = 77 K densità contro la concentrazione del cryoprotectant . T = 77 K densità rispetto alla concentrazione per gocce acquose vetrificate contenenti ( A ) glicerolo e ( B ) etilene glicole. I dati sono presentati come media ± SEM di tre singole gocce. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55761/55761fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55761/55761fig2.jpg" /> Figura 2: variazione del volume specifico sul raffreddamento da liquido a 298 K alla fase vitrea a 77 K. Modifica del volume percentuale sul raffreddamento da 298 K a 77 K per soluto acquosoOns di glicerolo e glicole etilenico. Le densità di soluzione T = 298 K sono ottenute dalle misurazioni precedenti 14 e 15 . I dati sono presentati come media ± SEM di tre singole gocce. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55761/55761fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures at JoVE.com

Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures

Viene descritto un protocollo per la determinazione delle densità di fase vitrea di gocce di dimensioni micro-pico-litri di miscele acquose a temperature criogeniche.

Misurare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche

We demonstrate a method for determining the vitreous phase cryogenic temperature densities of aqueous mixtures, and other samples that require rapid ...

measuring-the-densities-of-aqueous-glasses-at-cryogenic-temperatures

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Engineering

8.6K Views.  Cornell University.  Viene descritto un protocollo per la determinazione delle densità di fase vitrea di gocce di dimensioni micro-pico-litri di miscele acquose a temperature criogeniche. 

Video: Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures

Angle-resolved Photoemission Spectroscopy At Ultra-low Temperatures

The physical properties of a material are defined by its electronic structure. Electrons in solids are characterized by energy (&omega;) and momentum (k) and the probability to find them in a particular state with given &omega; and k is described by the spectral function A(k, &omega;). This function can be directly measured in an experiment based on the well-known photoelectric effect, for the explanation of which Albert Einstein received the Nobel Prize back in 1921. In the photoelectric effect the light shone on a surface ejects electrons from the material. According to Einstein, energy conservation allows one to determine the energy of an electron inside the sample, provided the energy of the light photon and kinetic energy of the outgoing photoelectron are known. Momentum conservation makes it also possible to estimate k relating it to the momentum of the photoelectron by measuring the angle at which the photoelectron left the surface. The modern version of this technique is called Angle-Resolved Photoemission Spectroscopy (ARPES) and exploits both conservation laws in order to determine the electronic structure, i.e. energy and momentum of electrons inside the solid. In order to resolve the details crucial for understanding the topical problems of condensed matter physics, three quantities need to be minimized: uncertainty* in photon energy, uncertainty in kinetic energy of photoelectrons and temperature of the sample.
In our approach we combine three recent achievements in the field of synchrotron radiation, surface science and cryogenics. We use synchrotron radiation with tunable photon energy contributing an uncertainty of the order of 1 meV, an electron energy analyzer which detects the kinetic energies with a precision of the order of 1 meV and a He3 cryostat which allows us to keep the temperature of the sample below 1 K. We discuss the exemplary results obtained on single crystals of Sr2RuO4 and some other materials. The electronic structure of this material can be determined with an unprecedented clarity.

The overall goal of this method is to determine the low-energy electronic structure of solids at ultra-low temperatures using Angle-Resolved Photoemission Spectroscopy with synchrotron radiation.

Angolo-spettroscopia di fotoemissione risolta A ultra-basse temperature

The physical properties of a material are defined by its  electronic structure. Electrons in solids are characterized by energy (&omega;)  and momentum ...

Ricerca

Ingegneria

Synthesis and Microdiffraction at Extreme Pressures and Temperatures

High pressure compounds and polymorphs are investigated for a broad range of purposes such as determine structures and processes of deep planetary interiors, design materials with novel properties, understand the mechanical behavior of materials exposed to very high stresses as in explosions or impacts. Synthesis and structural analysis of materials at extreme conditions of pressure and temperature entails remarkable technical challenges. In the laser heated diamond anvil cell (LH-DAC), very high pressure is generated between the tips of two opposing diamond anvils forced against each other; focused infrared laser beams, shined through the diamonds, allow to reach very high temperatures on samples absorbing the laser radiation. When the LH-DAC is installed in a synchrotron beamline that provides extremely brilliant x-ray radiation, the structure of materials under extreme conditions can be probed in situ. LH-DAC samples, although very small, can show highly variable grain size, phase and chemical composition. In order to obtain the high resolution structural analysis and the most comprehensive characterization of a sample, we collect diffraction data in 2D grids and combine powder, single crystal and multigrain diffraction techniques. Representative results obtained in the synthesis of a new iron oxide, Fe4O5 1 will be shown.

The laser heated diamond anvil cell combined with synchrotron micro-diffraction techniques allows researchers to explore the nature and properties of new phases of matter at extreme pressure and temperature (PT) conditions. Heterogeneous samples can be characterized in situ under high pressure by 2D mapping and combined powder, single-crystal and multigrain diffraction approaches.

Sintesi e microdiffrazione a pressioni e temperature estreme

High pressure compounds and polymorphs are investigated for a broad range of purposes such as determine structures and processes of deep planetary ...

Experimental Measurement of Settling Velocity of Spherical Particles in Unconfined and Confined Surfactant-based Shear Thinning Viscoelastic Fluids

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic (VES) fluids. The measurements are made for particles settling in unbounded fluids&#160;and fluids between parallel walls. VES fluids over a wide range of rheological properties are prepared and rheologically characterized. The rheological characterization involves steady shear-viscosity and dynamic oscillatory-shear measurements to quantify the viscous and elastic properties respectively. The settling velocities under unbounded conditions are measured in beakers having diameters at least 25x the diameter of particles. For measuring settling velocities between parallel walls, two experimental cells with different wall spacing are constructed. Spherical particles of varying sizes are gently dropped in the fluids and allowed to settle. The process is recorded with a high resolution video camera and the trajectory of the particle is recorded using image analysis software. Terminal settling velocities are calculated from the data.
The impact of elasticity on settling velocity in unbounded fluids is quantified by comparing the experimental settling velocity to the settling velocity calculated by the inelastic drag predictions of Renaud et al.1&#160;Results show that elasticity of fluids can increase or decrease the settling velocity. The magnitude of reduction/increase is a function of the rheological properties of the fluids and properties of particles. Confining walls are observed to cause a retardation effect on settling and the retardation is measured in terms of wall factors.

This paper demonstrates the experimental procedure to measure terminal settling velocities of spherical particles in surfactant-based shear thinning viscoelastic fluids. Fluids over a wide range of rheological properties are prepared and settling velocities are measured for a range of particle sizes in unbounded fluids and fluids between parallel walls.

Misurazione sperimentale della velocità di sedimentazione delle particelle sferiche in fluidi viscoelastici a base di tensioattivi non raffinati e confinati

An experimental study is performed to measure the terminal settling velocities of spherical particles in surfactant based shear thinning viscoelastic ...

Ambient Method for the Production of an Ionically Gated Carbon Nanotube Common Cathode in Tandem Organic Solar Cells

A method of fabricating organic photovoltaic (OPV) tandems that requires no vacuum processing is presented. These devices are comprised of two solution-processed polymeric cells connected in parallel by a transparent carbon nanotubes (CNT) interlayer. This structure includes improvements in fabrication techniques for tandem OPV devices. First the need for ambient-processed cathodes is considered. The CNT anode in the tandem device is tuned via ionic gating to become a common cathode. Ionic gating employs electric double layer charging to lower the work function of the CNT electrode. Secondly, the difficulty of sequentially stacking tandem layers by solution-processing is addressed. The devices are fabricated via solution and dry-lamination in ambient conditions with parallel processing steps. The method of fabricating the individual polymeric cells, the steps needed to laminate them together with a common CNT cathode, and then provide some representative results are described. These results demonstrate ionic gating of the CNT electrode to create a common cathode and addition of current and efficiency as a result of the lamination procedure.

A method of fabricating, in ambient conditions, organic photovoltaic tandem devices in a parallel configuration is presented. These devices feature an air-processed, semi-transparent, carbon nanotube common cathode.

Metodo ambiente per la produzione di un ionicamente Gated Nanotubi di carbonio catodo comune in celle solari tandem Organic

A method of fabricating organic photovoltaic (OPV) tandems that requires no vacuum processing is presented. These devices are comprised of two ...

A Simple Dewar/Cryostat for Thermally Equilibrating Samples at Known Temperatures for Accurate Cryogenic Luminescence Measurements

The design and operation of a simple liquid nitrogen Dewar/cryostat apparatus based upon a small fused silica optical Dewar, a thermocouple assembly, and a CCD spectrograph are described. The experiments for which this Dewar/cryostat is designed require fast sample loading, fast sample freezing, fast alignment of the sample, accurate and stable sample temperatures, and small size and portability of the Dewar/cryostat cryogenic unit. When coupled with the fast data acquisition rates of the CCD spectrograph, this Dewar/cryostat is capable of supporting cryogenic luminescence spectroscopic measurements on luminescent samples at a series of known, stable temperatures in the 77-300 K range. A temperature-dependent study of the oxygen quenching of luminescence in a rhodium(III) transition metal complex is presented as an example of the type of investigation possible with this Dewar/cryostat. In the context of this apparatus, a stable temperature for cryogenic spectroscopy means a luminescent sample that is thermally equilibrated with either liquid nitrogen or gaseous nitrogen at a known measureable temperature that does not vary (&#916;T &#60; 0.1 K) during the short time scale (~1-10 sec) of the spectroscopic measurement by the CCD. The Dewar/cryostat works by taking advantage of the positive thermal gradient dT/dh that develops above liquid nitrogen level in the Dewar where h is the height of the sample above the liquid nitrogen level. The slow evaporation of the liquid nitrogen results in a slow increase in h over several hours and a consequent slow increase in the sample temperature T over this time period. A quickly acquired luminescence spectrum effectively catches the sample at a constant, thermally equilibrated temperature.

A simple liquid nitrogen Dewar/cryostat apparatus comprised of a small fused silica optical Dewar, a thermocouple, and a charge-coupled device (CCD) spectrograph are described. The experiments for which this Dewar/cryostat is designed require fast sample loading, freezing, and alignment, accurate and stable sample temperatures, and small size/portability.

A Simple Dewar / criostato per equilibrare termicamente i campioni a temperature criogeniche noti accurate misurazioni di luminescenza

The design and operation of a simple liquid nitrogen Dewar/cryostat apparatus based upon a small fused silica optical Dewar, a thermocouple assembly, and ...

Design and Evaluation of Smart Glasses for Food Intake and Physical Activity Classification

This study presents a series of protocols of designing and manufacturing a glasses-type wearable device that detects the patterns of temporalis muscle activities during food intake and other physical activities. We fabricated a 3D-printed frame of the glasses and a load cell-integrated printed circuit board (PCB) module inserted in both hinges of the frame. The module was used to acquire the force signals, and transmit them wirelessly. These procedures provide the system with higher mobility, which can be evaluated in practical wearing conditions such as walking and waggling. A performance of the classification is also evaluated by distinguishing the patterns of food intake from those physical activities. A series of algorithms were used to preprocess the signals, generate feature vectors, and recognize the patterns of several featured activities (chewing and winking), and other physical activities (sedentary rest, talking, and walking). The results showed that the average F1 score of the classification among the featured activities was 91.4%. We believe this approach can be potentially useful for automatic and objective monitoring of ingestive behaviors with higher accuracy as practical means to treat ingestive problems.

This study presents a protocol of designing and manufacturing a glasses-type wearable device that detects the patterns of food intake and other featured physical activities using load cells inserted in both hinges of the glasses.

Progettazione e valutazione di vetri per ingestione di cibo e la classificazione di attività fisica

This study presents a series of protocols of designing and manufacturing a glasses-type wearable device that detects the patterns of temporalis muscle ...

Processing of Bulk Nanocrystalline Metals at the US Army Research Laboratory

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued development of nanocrystalline metals. Despite these efforts, the transition of these materials from the lab bench to actual applications has been blocked by the inability to produce large scale parts that retain the desired nanocrystalline microstructures. Following the development of a method proven to stabilize the nanosized grain structure to temperatures approaching that of the melting point for the given metal, the US Army Research Laboratory (ARL) has progressed to the next stage in the development of these materials - namely the production of large scale parts suitable for testing and evaluation in a range of relevant test environments. This report provides a broad overview of the ongoing efforts in the processing, characterization, and consolidation of these materials at ARL. In particular, focus is placed on the methodology used for producing the nanocrystalline metal powders, in both small and large-scale amounts, that are at the center of ongoing research efforts.

This paper provides a brief overview of the ongoing efforts at the Army Research Laboratory on the processing of bulk nanocrystalline metals with an emphasis on the methodologies used for the production of the novel metal powders.

Lavorazione dei metalli nanocristallini Bulk presso la US Army Research Laboratory

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic glasses (MGs). Despite their amorphous nature, the identification of hyperfine interactions unveils faint structural modifications. For this purpose, we have employed two techniques that utilize nuclear resonance among nuclear levels of a stable 57Fe isotope, namely M&#246;ssbauer spectrometry and nuclear forward scattering (NFS) of synchrotron radiation. The effects of heat treatment upon (Fe2.85Co1)77Mo8Cu1B14 MG are discussed using the results of ex situ and in situ experiments, respectively. As both methods are sensitive to hyperfine interactions, information on structural arrangement as well as on magnetic microstructure is readily available. M&#246;ssbauer spectrometry performed ex situ describes how the structural arrangement and magnetic microstructure appears at room temperature after the annealing under certain conditions (temperature, time), and thus this technique inspects steady states. On the other hand, NFS data are recorded in situ during dynamically changing temperature and NFS examines transient states. The use of both techniques provides complementary information. In general, they can be applied to any suitable system in which it is important to know its steady state but also transient states.

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Here, we present a protocol to describe ex situ and in situ investigations of structural transformations in metallic glasses. We employed nuclear-based analytical methods which inspect hyperfine interactions. We demonstrate the applicability of M&#246;ssbauer spectrometry and nuclear forward scattering of synchrotron radiation during temperature-driven experiments.

Metodi di Ex Situ ed In Situ indagini sulle trasformazioni strutturali: il caso di cristallizzazione dei vetri metallici

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic ...

Generation and Control of Electrohydrodynamic Flows in Aqueous Electrolyte Solutions

To drive electrohydrodynamic (EHD) flows in aqueous solutions, the separation of cation and anion transport pathways is essential because a directed electric body force has to be induced by ionic motions in liquid. On the other hand, positive and negative charges attract each other, and electroneutrality is maintained everywhere in equilibrium conditions. Furthermore, an increase in an applied voltage has to be suppressed to avoid water electrolysis, which causes the solutions to become unstable. Usually, EHD flows can be induced in non-aqueous solutions by applying extremely high voltages, such as tens of kV, to inject electrical charges. In this study, two methods are introduced to generate EHD flows induced by electrical charge separations in aqueous solutions, where two liquid phases are separated by an ion-exchange membrane. Due to a difference in the ionic mobility in the membrane, ion concentration polarization is induced between both sides of the membrane. In this study, we demonstrate two methods. (i) The relaxation of ion concentration gradients occurs via a flow channel that penetrates an ion-exchange membrane, where the transport of the slower species in the membrane selectively becomes dominant in the flow channel. This is a driving force to generate an EHD flow in the liquid. (ii) A long waiting time for the diffusion of ions passing through the ion-exchange membrane enables the generation of an ion-dragged flow by externally applying an electric field. Ions concentrated in a flow channel of a 1 x 1 mm2 cross-section determine the direction of the liquid flow, corresponding to the electrophoretic transport pathways. In both methods, the electric voltage difference required for an EHD flow generation is drastically reduced to near 2 V by rectifying the ion transport pathways.

The rectification of ion transport pathways is an effective method to generate one-directional ion-dragged electrohydrodynamic flows. By setting an ion-exchange membrane in a flow channel, an electrically polarized condition is generated and causes a liquid flow to be driven when an electric field is externally applied.

Generazione e controllo di idrodinamiche flussi in soluzioni acquose dell'elettrolito

To drive electrohydrodynamic (EHD) flows in aqueous solutions, the separation of cation and anion transport pathways is essential because a directed ...

Measurement of Dynamic Force Acted on Water Strider Leg Jumping Upward by the PVDF Film Sensor

This study aimed to make an explanation for the phenomenon in nature that water strider usually jumps or glides on the water surface easily but quickly, with its peak locomotion speed reaching 150 cm/s. First of all, we observed the microstructure and hierarchy of water strider legs using the scanning electron microscope. On the basis of the observed morphology of the legs, a theoretical model of the detachment from water surface was established, which explained water striders' capability to slide on water surface effortlessly in terms of energy reduction. Secondly, a dynamic force measurement system was devised using the PVDF film sensor with excellent sensitivity, which could detect the whole interaction process. Subsequently, a single leg in contact with water was pulled upward at different speeds, and the adhesion force was measured at the same time. The results of the departing experiment suggested a deep understanding of the fast jumping of water striders.

The protocol here is dedicated to investigating the free and quick maneuvering of water strider on water surface. The protocol includes observing the microstructure of legs and measuring the adhesion force when departing from water surface at different speeds.

Misurazione della forza dinamica ha agito sulla gamba di Strider acqua saltando verso l'alto dal sensore Film PVDF

This study aimed to make an explanation for the phenomenon in nature that water strider usually jumps or glides on the water surface easily but quickly, ...