Questo progetto è stato sostenuto dalla National Science Foundation naturali della Cina (NSFC): 31.301.950 e 31.671.288.

Il metodo attuale è stato stabilito e convalidato per raccogliere e memorizzare più di 1.000 campioni di muscolo per la colorazione istologica nel nostro laboratorio. Tutte le procedure che coinvolgono la cura degli animali e l&#39;uso hanno seguito le linee guida stabilite dal Ministero dell&#39;Agricoltura della Cina. 1. apparecchiature per la raccolta del campione <ol><li> Etichettare l&#39;identità del campione su ogni fiala criogenico. Nota: La fiala criogenico è appositamente progettato per congelare campioni di tessuto fresco per la procedura cryosection (Figura 1A). I flaconi sono realizzati in polipropilene in una fabbrica di stampo (Figura 1C). </li><li> Ottenere le seguenti attrezzature: azoto liquido in un apposito serbatoio di azoto liquido, occhiali di protezione o una visiera, guanti congelatore, 10 cm forcipe, 25 pinzette cm, un dispositivo di raffreddamento polistirolo (dimensioni interne: 20 cm x 12 cm larghezza x 13,5 cm ; dimensioni esterne: 24 cm di lunghezza x 16 cm di altezza di larghezza x 15 cm), film plastici (2,5 cm di lunghezza x 0,8 cm di spessore di larghezza x 0,1 mm),un bisturi, e copre vincolante A4 in PVC (21 cm x 29,5 centimetri) (Figura 1B). </li></ol> 2. Preparazione di campioni di muscolo <ol><li> Riempire il dispositivo di raffreddamento di polistirolo con azoto liquido 5 minuti prima del prelievo del campione. NOTA: La grande colonna di azoto liquido è essenziale perché parte del azoto liquido bolle di distanza e si trasforma in gas quando campioni freschi toccano. Al fine di ridurre la frequenza di trasferimento di azoto liquido per ricostituire la perdita, un dispositivo di raffreddamento polistirolo dimensioni adeguate deve essere acquisita in anticipo secondo il numero di campioni. </li><li> Una volta che un campione viene ottenuta, appoggiarlo su un foglio di copertura vincolante A4 PVC e osservare la direzione delle fibre muscolari. NOTA: Qui, abbiamo usato la sezione del muscolo longissimus Doris dal primo all&#39;ultimo vertebra lombare nei suini. I campioni sono lunghe circa 12 cm, 8 cm di larghezza e 5 cm di altezza. </li><li> Utilizzare un bisturi per fare due incisioni parallele attraverso il I Modellon la direzione delle fibre muscolari, circa 3 cm di lunghezza e 0,6 cm di distanza. Tagliare il muscolo incisa in un rettangolo circa 0,6 centimetri di larghezza x 0.6 cm lungo alte x 1,5 cm. NOTA: L&#39;affidabilità della misurazione della sezione trasversale delle fibre muscolari principalmente dipende l&#39;orientamento delle fibre del muscolo incisa. </li><li> Utilizzare 10 cm pinze per mettere delicatamente il campione su un pezzo di pellicola plastica, con l&#39;asse longitudinale del parallelo muscolo incisa al lato lungo della pellicola (Figura 2A). NOTA: La pellicola plastica ha due funzioni: una funzione di tenuta che aiuta a fissare l&#39;orientamento delle fibre muscolari e una funzione di adesione che impedisce crepe nel campione a causa di congelamento rapido. </li><li> Utilizzando pinze, posizionare il tessuto muscolare in basso al centro di una fiala criogenico etichettato, proprio tra i fori di ingresso, e poi ermeticamente tappare il flacone (Figura 2B). </li></ol> 3. Congelare e conservare muscolare CampioneS <ol><li> Con 25 pinzette cm, immergere rapidamente l&#39;intero flaconcino criogenico in azoto liquido nel refrigerante pre-raffreddato polistirolo, aspettando dell&#39;azoto liquido non bolla (circa 10-20 s). NOTA: L&#39;esageratamente galleggia quando l&#39;azoto liquido bolle, quindi immergere attentamente la fiala in azoto liquido bollente per 10-20 s. </li><li> Trasferire i campioni di muscolo di un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido o un -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 4. Preparazione del vetrino <ol><li> Preraffreddare un criostato a -20 ° C e -22 ° C. </li><li> Rimuovere ed eliminare la vecchia lama microtomo, pulire il portalama e la piastra anti-rollio nel criostato, installare una nuova lama microtomo criostato, e impostare lo spessore di taglio a 8 um. </li><li> Trasferire il campione di muscolo nella fiala criogenico dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido o -80 ° C freezer al criostato, trasportandolo in azoto liquido o il ghiaccio secco. </li&gt; <li> Attendere 30 minuti per il campione equilibrare con la temperatura del criostato. NOTA: Tutte le apparecchiature che potrebbero toccare il campione deve essere pre-raffreddamento, a causa di una temperatura elevata potrebbe causare la formazione di cristalli di ghiaccio presenti nel campione. </li><li> Montare il campione nel portacampione sotto la formulazione ottimale temperatura di taglio di glicoli e resine idrosolubili (OCT). Tagliare sezioni 8-micron. NOTA: regolare l&#39;angolo di taglio perpendicolarmente all&#39;orientamento delle fibre muscolari, perché il CSAF è l&#39;area della sezione trasversale delle fibre muscolari. </li><li> Montare le sezioni verso il centro di un MicroSlide a temperatura ambiente. Collocare immediatamente il vetrino in una cassa scorrevole in una -80 ° C freezer. Non lasciare che il vetrino asciugare a temperatura ambiente. </li></ol>

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Nessun conflitto di interesse, finanziario o di altro, sono dichiarate dagli autori.

Qui, descriviamo un nuovo, multiforo esageratamente per il congelamento e la conservazione tessuti muscolari per effettuare valutazioni istologiche della funzione muscolare. La fase critica modificato in questo protocollo è che il campione nella esageratamente fori multipli è direttamente immersa in azoto liquido. A nostra conoscenza, questo è il modo più semplice e rapidest di ottenere campioni congelati eccellenti per criosezionamento muscolare tra i metodi di congelamento esistenti (vedere i risultati rappresentativi). La sfida tecnica affrontato da ricercatori muscolari è che i cristalli di ghiaccio sono più probabilità di formare quando si utilizza il congelamento come mezzo per indurire il tessuto muscolare per il sezionamento. Come notato nei risultati rappresentativi, tre fattori giocano un ruolo significativo nel determinare il corretto congelamento muscolare per gli studi patologici, tra cui la scelta di una fonte fredda adeguato, riducendo al minimo l&#39;umidità del campione, e l&#39;aumento della percentuale della superficie totale a contatto con la sorgente fredda. Primo,il tasso di congelamento è fondamentale per evitare danni durante la preparazione del tessuto congelato per il sezionamento. Quando il congelamento è lento, i muscoli congelati mostrano il ben noto effetto di &quot;formaggio svizzero&quot;, perché i cristalli di ghiaccio di grandi dimensioni si formano extracellulare. Quando il congelamento è rapido, ma non sufficientemente veloce, un gran numero di piccoli cristalli di ghiaccio aghiformi si formano all&#39;interno delle cellule muscolari individuali. Questi cristalli di ghiaccio aghiformi causano pochi danni strutturali rilevabili, ma portano i seguenti effetti: i mitocondri sono danneggiati 10, la dimensione delle fibre muscolari è aumentato artificialmente 11, e l&#39;integrità delle strutture fibrose viene distrutto 11. Così, una sorgente fredda ad una temperatura sufficientemente fredda e una velocità di congelamento sufficiente sono essenziali per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio in criosezioni muscolari. Idealmente, la sorgente fredda è a temperature estremamente basse ed è disposto to contattare tutte le superfici. Entrambi azoto liquido (-190 ° C) ed isopentano in uno stato misto solido-liquido (-160 ° C) soddisfano questa condizione. Tuttavia, i due mezzi di congelamento hanno i loro svantaggi. L&#39;azoto liquido ha una costante calore specifico estremamente basso. Il risultato è che il contatto tra azoto liquido e il tessuto provoca una barriera al vapore che si accumula accanto al tessuto e notevolmente rallenta la penetrazione del freddo nel tessuto 12. Così, significativi manufatti di congelamento si verificano all&#39;interno del muscolo congelato. Lo stato di sospensione isopentano è un mezzo di congelamento ideale che non forma barriera al vapore, ma il problema principale è che isopentano deve essere utilizzato in combinazione con azoto liquido per ottenere una temperatura del bagno liquido di 160 ° C. Inoltre, isopentano è un liquido estremamente volatile ed infiammabile a temperatura ambiente. In secondo luogo, il muscolo contiene acqua eccessivo (&gt; 75%), in modo che qualsiasi modo per introdurre l&#39;umidità esogeno nel campione<html> causerebbe artefatti congelamento. Ad esempio, Ottobre mezzo di montaggio aggiunge acqua in più al muscolo, in modo da cristalli di ghiaccio sono molto più prominente in quei criosezioni muscolari rispetto a quelli senza ottobre mezzo di montaggio. Infine, lo spessore del tessuto muscolare è anche importante per congelare adeguatamente perché il tasso di congelamento in parte dipende dalla percentuale della superficie totale a contatto con la sorgente fredda (di solito, lo spessore &lt;0,5 cm). Pertanto, l&#39;unico modo esistente per congelare correttamente il tessuto è immergere il tessuto muscolare con uno spessore inferiore a 0,5 cm all&#39;interno isopentano pre-raffreddato (160 ° C), come precedentemente descritto 8. Questo protocollo prima descrive come congelare correttamente tessuti muscolari immergendo direttamente in azoto liquido. Il problema con l&#39;utilizzo di azoto liquido solo è la formazione di gas azoto sulla superficie del tessuto, che funge da isolante e inibendo il raffreddamento del tessutof &quot;&gt; 13. Tale coperta vapore può formare solo quando la fusione di bolle è così rapido che il gas azoto può separare il tessuto dalla azoto liquido. Secondo dinamica bolla, un flusso veloce liquido comporterà bolle più piccole, come ha minori possibilità di unire 14. Pertanto, abbiamo perforato 14 fori nella parete del esageratamente per aumentare la velocità del flusso di liquido attorno al tessuto e per evitare l&#39;effetto &quot;coperta vapore&quot; quando i contatti azoto liquido tessuto. Considerando che il fattore che determina il successo sperimentale è la velocità di flusso di liquido attorno al tessuto, tre parametri della esageratamente sono molto importanti, tra cui la posizione e il numero di fori, il diametro dei fori di ingresso, e la distanza tra l&#39;orifizio e il campione. dinamiche liquidi mostra che la portata attraverso un orifizio è determinata dal diametro dei fori e che un flusso di ricircolo sviluppa immediatamente giùflusso dell&#39;orifizio (Figura 5) 15, 16. Corrispondentemente, la distanza tra il diaframma e il campione determina in gran parte l&#39;area di contatto tra il flusso di fluido ad alta velocità e il campione, come mostrato in figura 5. Di conseguenza, l&#39;esageratamente multiforo in Figura 1A è adatto per un campione muscolo che è 0.6 cm di altezza di larghezza x 0.6 cm x lunghezza 1,5 cm. Per frammenti muscolari più grandi, vale la pena provare questo metodo con un tubo più grande e più fori. Tuttavia, questo protocollo non è adatto per congelare campioni di muscolo di piccoli animali, come ad esempio in un modello murino, perché i fori di ingresso potrebbe essere troppo grande per i campioni più piccoli. Inoltre, tre fasi critiche devono essere rigorosamente seguite nel protocollo. In primo luogo, l&#39;azoto liquido deve essere sufficiente per immergere completamente esageratamente, e la fiala criogenico deve essere completamente al di sotto del livello del liquido. In secondo luogo, è necessario unvuoto contatto accidentale tra i muscoli congelati e contenitori a temperatura ambiente o strumenti. Ad esempio, senza trasporto attenta, nuovi cristalli di ghiaccio possono formare quando si trasferisce un campione congelato dal serbatoio di azoto liquido o -80 ° C congelatore un criostato. In terzo luogo, non ci dovrebbe essere troppo ottobre utilizzato quando i campioni sono montati sul supporto a causa dell&#39;elevata probabilità di formazione di cristalli di ghiaccio intorno alla zona di contatto tra i muscoli congelati e ottobre Nel settore della carne, una procedura cryosection muscolare è indispensabile perché il processo di formalina fissazione e paraffina provoca il restringimento nelle fibre muscolari, che altera la valutazione di alcuni tratti muscolari, come TNF e CSAF. Inoltre, il muscolo congelato è richiesto quando si valuta FTC usando il saggio miosina ATPasi. Come mostrato in figura 3E, questo protocollo può soddisfare i requisiti sia analisi patologica e macchie istochimiche nei muscoli. La preparazionedi un cryosection è un&#39;operazione di routine nei laboratori di patologia muscolare clinici. Come descritto da Meng et al. 8, una procedura operativa standard per il congelamento tessuti muscolari è quello di immergere campioni autoptici in isopentano pre-raffreddato. Tuttavia, isopentano non è disponibile per congelare i campioni autoptici presso istituzioni senza laboratori di patologia muscolare clinici. Di conseguenza, le biopsie muscolari diagnostiche sono spesso subottimale elaborati in molte strutture mediche. Così, il nostro protocollo potrebbe migliorare sostanzialmente la possibilità per i piccoli ospedali o laboratori per eseguire biopsie muscolari diagnostiche di qualità adeguata. Considerando l&#39;elevata efficienza e semplice operazione di questo protocollo, potrebbe essere una promettente alternativa all&#39;attuale metodo di congelamento isopentano-based e può essere ampiamente applicata agli studi istologici in futuro.

Il muscolo scheletrico è la componente più importante di un animale produttrice di carne dal punto nutrizionale e l&#39;elaborazione di vista. Nel settore della carne, ci sono due aspetti particolarmente critici: l&#39;efficienza della crescita muscolare e la qualità della carne risultante. Come componente principale del muscolo, le fibre muscolari sono direttamente legate alla performance di crescita e la qualità della carne fresca in animali 1. Ad esempio, il numero totale di fibre (TNF) e l&#39;area trasversale di fibre (CSAF) in gran parte determinano la massa muscolare e la qualità della carne; Inoltre, Fibra Tipologia Composizione (FTC) influenza fortemente la qualità della carne fresca 2. Pertanto, la manipolazione delle caratteristiche della fibra muscolare negli animali è un metodo molto efficace per aumentare la redditività core e competitività delle aziende 1. Fino ad oggi, diversi fattori intrinseci ed estrinseci sono stati identificati per manipolare fibra muscolare caratteristica atmosferaCI 1. Questa manipolazione può essere ottenuto attraverso la selezione mirata di animali con geni specifici, come il gene miostatina nei bovini 3, il gene Callipyge nelle pecore 4, e la RYR1 e geni IGF2 nei suini 5. Inoltre, controllo della dieta e trattamenti con ormoni specifici svolgono un ruolo importante nelle caratteristiche della fibra muscolare 6. Così, un approccio che combina i fattori genetici e nutrizionali potrebbe essere in grado di migliorare tenore di carne magra e la qualità della carne. Tuttavia, gli studi sulle fibre muscolari sono limitati nel settore della carne, perché la spiegazione della struttura delle fibre muscolari è ancora una sfida. proprietà delle fibre muscolari vengono identificati mediante metodi istochimici, quali il test miosina adenosina trifosfatasi (ATPasi). Questo metodo si basa sul fatto che gli enzimi trova a sezioni sottili (6-8 micron) congelati difibre muscolari possono essere fatti reagire chimicamente con alcuni prodotti. Tuttavia, il contenuto di acqua dei muscoli è maggiore del 75% nei suini, conigli, topi, ed esseri umani, indipendentemente dalla posizione (cioè, schiena, addome, o degli arti posteriori) 7. Tale elevato contenuto di umidità nei muscoli causa un problema di frequente riscontro - artefatti congelamento - durante la preparazione di criosezioni, come precedentemente descritto 8, 9. Nella maggior parte dei casi, è quasi impossibile per congelare in modo appropriato tessuti muscolari in una linea di produzione di macellazione, secondo la nostra esperienza. Il protocollo presentato qui descrive un metodo semplice ed efficace utilizzato nel nostro laboratorio di congelare i tessuti muscolari per criosezionamento in maniera high-throughput. Il culmine di questo metodo è un nuovo esageratamente che è progettato per i tessuti muscolari flash congelamento in azoto liquido. Il flusso di lavoro corrente può contemporaneamente facilitare tessutocongelamento e lavorazione per un&#39;eccellente cryosection muscolare, con un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile e la stretta apposizione di miofibre al tessuto circostante. Inoltre, questo protocollo può essere applicata a una vasta gamma di opzioni per l&#39;analisi dei tessuti perché l&#39;azoto liquido non si mescola con i tessuti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Cryostat Microtome</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Leica</td>
			<td style="width:111px;">Leica CM1950</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">&#160;Cryogenic Vial&#160;&#160; Plastic film</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Designed by ourself</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm-forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25cm-tweezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Safety glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezer gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

Studi sulla fisiologia del muscolo scheletrico affrontare la sfida tecnica di trattare opportunamente i campioni per ottenere sezioni con vani citoplasmatici ben visibili. Un altro ostacolo è la stretta apposizione di miofibre ai tessuti circostanti. Poiché il processo di fissaggio di tessuto e in paraffina conduce alla contrazione delle fibre muscolari, congelamento è un mezzo ottimali di indurimento tessuto muscolare per il sezionamento. Tuttavia, un problema di frequente riscontro, la formazione di cristalli di ghiaccio, si verifica durante la preparazione delle sezioni congelate a causa del alto contenuto di acqua del muscolo. Il protocollo presentato qui in primo luogo descrive un metodo semplice ed efficace per il congelamento correttamente tessuti muscolari immergendole in azoto liquido. Il problema con l&#39;utilizzo di azoto liquido da solo è che provoca la formazione di una barriera al gas azoto accanto al tessuto, che funge da isolante e inibisce il raffreddamento dei tessuti. Per evitare questo effetto &quot;coperta di vapore&quot;, a neesageratamente w è stato progettato per aumentare la velocità di flusso del liquido intorno alla superficie del tessuto. Questo è stato ottenuto per tranciatura di un totale di 14 fori di ingresso nella parete del flaconcino. Secondo dinamiche bolla, un più alto tasso di risultati di flusso del liquido in bolle più piccole e meno probabilità di formare una barriera al gas. Quando l&#39;azoto liquido fluisce nella esageratamente attraverso i fori di ingresso, la velocità di flusso intorno il tessuto è abbastanza veloce per eliminare la barriera ai gas. Rispetto al metodo di congelamento tessuti muscolari utilizzando isopentano pre-raffreddato, questo protocollo è più semplice e più efficiente e può essere utilizzato per bloccare il muscolo in modo di throughput. Inoltre, questo metodo è ottimale per gli istituti che non hanno accesso a isopentano, che è estremamente infiammabile a temperatura ambiente.

L&#39;illustrazione esageratamente e l&#39;equipaggiamento di laboratorio per il congelamento muscoli durante la preparazione di sezioni congelate sono mostrati in Figura 1. I cryovials sono realizzati in polipropilene in uno stampo di fabbrica. Ogni flaconcino ha un totale di 14 fori di ingresso: uno è sul cappuccio; un altro è nella parte inferiore; e le restanti 12 formano quattro linee parallele, ciascuna con quattro fori a 90 ° fra loro. Questi fori di ingresso possono accelerare la velocità di flusso di azoto liquido accanto al tessuto per evitare l&#39;effetto &quot;coperta vapore&quot; quando i contatti azoto liquido del tessuto. Di conseguenza, pochissimi cristalli di ghiaccio si formano nei campioni congelati. Soprattutto, isopentano, il liquido estremamente volatile e infiammabile con un punto di ebollizione a 28 ° C, non è necessario in questa procedura. Per evidenziare ulteriormente il vantaggio di questo metodo, ci si è bloccato il muscolo longissimus dorsinei suini utilizzando cinque metodi di congelamento e quindi osservata loro proprietà di colorazione e dettagli istologici utilizzando un colorante ematossilina / eosina (HE) (Figura 3). Un problema comunemente incontrati è stata la formazione di cristalli di ghiaccio durante la preparazione dei muscoli per cryosection. Quando il campione è stato collocato direttamente in un -80 ° C congelatore (figura 3A), grandi cristalli di ghiaccio formate e quindi causato un ben noto effetto &quot;formaggio svizzero&quot; nel cryosection muscolo. Inoltre, i cristalli di ghiaccio formano anche quando il tessuto muscolare è stato immerso direttamente in azoto liquido (Figura 3B). Anche se l&#39;azoto liquido è un liquido molto freddo (-190 ° C), il suo calore costante è estremamente bassa. Quando tutti i contatti del provino l&#39;azoto liquido, una coperta di vapore possono accumularsi vicino al tessuto e isolare la penetrazione di freddo nel tessuto. Inoltre, una procedura di routine per il congelamento esemplari nei laboratori di patologia non è ancora applicabile al tessuto muscolare. UNs mostrato in figura 3C, molti cristalli di ghiaccio aghiformi formate nel compartimento citoplasmatico miofibre dopo che il tessuto muscolare è stato immerso in Ottobre montante nell&#39;orientamento corretto e poi velocemente congelata in una sospensione di isopentano (-160 ° C). In conclusione, la velocità di congelamento appropriato per i tessuti muscolari deve essere rigorosamente incontrato nel funzionamento. Il protocollo attuale raggiunge un&#39;eccellente integrità del campione, con un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile e la stretta apposizione di miofibre al tessuto circostante (Figura 3D). Esso permette un&#39;eccellente visualizzazione delle proprietà metaboliche di fibre muscolari utilizzando il saggio miosina ATPasi (Figura 3E). Per questo saggio, miosina ATPasi attività è stata analizzata sulla base del fatto che le fibre muscolari fast-contraenti (tipo mammiferi 2A e 2B) idrolizzano ATP veloce di fibre lenta contraenti (mammiferi tipo 1). Quando somministrato equivavolte prestati, fibre rapida contraenti colore chiaro, con due gradi, e fibre lenta contraenti appaiono nere. È importante sottolineare che questo metodo può essere utilizzato in modo efficiente in un ambiente ad elevata capacità perché è facile da eseguire e risparmiare tempo (Figura 4). Al giorno d&#39;oggi, un metodo di congelamento consolidata è sommergere tessuti muscolari in una sospensione di isopentano senza contatto e di ottene montante, come descritto in precedenza 8, 9 (figura 3F). In questa procedura, ci vogliono circa il 30 min per uno stato sospensione solido-liquido 240 mL di isopentano da realizzare entro il preraffreddamento del isopentano in azoto liquido e agitazione fino a piccoli precipitati bianchi appaiono in basso (Figura 4). Ci sono tre difficoltà pratiche incontrate dai ricercatori durante il tentativo di congelare i tessuti muscolari in isopentano pre-raffreddato: (1) Uno stato impasto solido-liquido di isopantane è difficile da mantenere quando iltempo di campionamento è superiore a 1 h. Nei nostri tentativi passati, manufatti congelamento di solito si sono verificati nei campioni che sono stati fatti nelle fasi metà e fine del processo, quando decine di tessuti muscolari sono stati raccolti una volta. (2) Come un liquido pericoloso, isopantane non è consentito da nessuna parte sui mezzi pubblici. (3) Isopentano non è disponibile se non in laboratorio. Molti ricercatori carne di scienze di solito congelare tessuti muscolari in un macello che è lontano da un laboratorio e che non è permesso di avere isopentano. Inoltre, biopsie muscolari diagnostiche sono spesso sub-ottimale elaborata a causa della mancanza di isopentano a strutture mediche. Così, il nostro protocollo è uno sviluppo importante per il congelamento campioni muscolari in situazioni in cui non è disponibile isopentano. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55616/55616fig1.jpg" /> Figura 1: L&#39;apparecchio per Muscle congelamento. (A) Le illustrazionidella esageratamente utilizzato in questo studio. 14 fori di ingresso vengono punzonati nella parete del tubo: uno è sul tappo; un altro è nella parte inferiore; e le restanti 12 formano quattro linee parallele, ciascuna con quattro fori a 90 ° fra loro. (B) Una fotografia dell&#39;apparecchiatura di congelamento. Un mezzo sicuro ed efficiente di congelamento in azoto liquido muscoli implica l&#39;uso di una pellicola plastica esageratamente, occhiali protettivi, guanti, congelatore 10 cm pinze, pinzette 25 cm, un dispositivo di raffreddamento polistirolo, un bisturi, e la copertura rilegatura A4 PVC. (C) Le illustrazioni dello stampo esageratamente fornita da un tecnico, Yonghua Wang, in fabbrica stampo. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55616/55616fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55616/55616fig2.jpg" /> Figura 2: Preparazione di campioni di muscolo. (A </strong&gt;) Inserire un tessuto muscolare incisa sulla pellicola di plastica. (B) Il tessuto muscolare deve essere inserito tra i fori di ingresso nel flaconcino criogenico. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55616/55616fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55616/55616fig3.jpg" /> Figura 3: Rappresentante immagini del istologica di valutazione di muscoli Pig longissimus dorsi dopo sono congelati utilizzando cinque diversi metodi. Cristalli di ghiaccio distruggono la leggibilità del criosezioni muscolari imaged con SE colorazione quando i muscoli sono congelati per l&#39;analisi istologica con metodi inadeguati, come mostrato in (AC). Artefatti congelamento notevoli verificato quando campioni di muscolo sono stati posti direttamente in un 80 ° C congelatore (A) o immersi nel liquidoazoto (B). Molti cristalli di ghiaccio aghiformi formano all&#39;interno delle cellule muscolari singole dopo che il tessuto muscolare è stato immerso in Office e poi direttamente messo in un impasto di isopentano (C). Il protocollo presentato in questo studio può eliminare la formazione di cristalli di ghiaccio quando il tessuto muscolare è semplicemente immersa in azoto liquido (D). Questo protocollo è applicabile all&#39;analisi di attività enzimatica nel muscolo congelato sulla base del saggio di miosina ATPasi (E). Il metodo di congelamento standard per il muscolo non funzionare meglio; tessuto muscolare è immerso in una poltiglia di isopentano senza contatto diretto e di ottene mezzo di montaggio (F). Tutte le immagini sono sotto un obiettivo 10X, ad eccezione di quelli con bordi neri (20x). Barre di scala: 100 micron. La freccia nella Figura 3C indica piccoli cristalli di ghiaccio aghiformi. La freccia e il testo in Figura 3E indicano il tipo di fibre muscolari: Tipo 1 rappresenta le fibre lento miosina catena pesante, type 2A: fibre di catena pesante della miosina intermedia e digitare 2B indica fibre catena pesante della miosina veloce. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55616/55616fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55616/55616fig4.jpg" /> Figura 4: Confronto tra flussi di lavoro per le procedure di congelamento liquido a base di azoto e basati isopentano. Nel protocollo a base di azoto liquido, il tessuto muscolare nella nuova esageratamente viene immerso in azoto liquido. Nel protocollo isopentano-based, uno stato di sospensione isopentano deve essere ottenuta in anticipo preraffreddamento del isopentano in azoto liquido e agitazione fino a piccoli precipitati bianchi appaiono in basso. Poi, il tessuto muscolare viene immerso nel isopentano pre-raffreddata. Rispetto ai 35 min nella procedura isopentano-based, come descritto in Figura 3F, ci vogliono solo 5 min t<html> o completare la procedura di congelamento presentato in questo protocollo. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55616/55616fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55616/55616fig5.jpg" /> Figura 5: Liquido di flusso di azoto attraverso un orifizio a spigolo vivo. Quando immergendo l&#39;intero fori multipli esageratamente in azoto liquido, forze di pressione atmosferica azoto liquido nel tubo attraverso i fori di ingresso 14. La presenza dei fori rende il flusso accelerare attraverso di loro, aumentando così la velocità. Un flusso di ricircolo (in blu) sviluppa immediatamente a valle dell&#39;orifizio (arancione). D1 indica il diametro dell&#39;orifizio sulla parete del tubo e D2 rappresenta la distanza tra il diaframma e il campione di muscolo (in rosso).= &quot;_ Blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Questo protocollo descrive una procedura di congelamento tessuti muscolari immergendo direttamente in azoto liquido. Questo protocollo evidenzia anche un nuovo esageratamente che può evitare l&#39;effetto &quot;coperta&quot; di gas azoto quando i contatti di azoto liquido la superficie del tessuto di un campione.

Una multi-foro esageratamente Elimina gelati Imperfezioni muscoli sono direttamente immerso in azoto liquido

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

a-multi-hole-cryovial-eliminates-freezing-artifacts-when-muscle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Jiangxi Agricultural University.  Questo protocollo descrive una procedura di congelamento tessuti muscolari immergendo direttamente in azoto liquido. Questo protocollo evidenzia anche un nuovo esageratamente che può evitare l'effetto "coperta" di gas azoto quando i contatti di azoto liquido la superficie del tessuto di un campione. 

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Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove residual media that could otherwise quench the Trypsin reaction.  Warmed 0.05% Trypsin-EDTA is then added to cover the cells, and the plate allowed to incubate for up to 5 mins at room temperature.  During this time cells can be observed rounding, and colonies lifting off the plate surface.  Gentle repeated pipetting will remove cells and colonies from the plate surface.  Trypsinized cells are placed in a standard conical tube containing pre-warmed hES cell media to quench remaining trypsin, and then spun.  Cells are resuspended growth media at a concentration of approximately one million cells in one mL of media, a concentration such that one frozen aliquot is sufficient to resurrect a culture on a 10cm plate.  After cells are adequately resuspended, ice cold freezing media is added at equal volume.  Cell suspensions are mixed thoroughly, aliquoted into freezing vials, and allowed to slowly freeze to -80C over 24 hours.  Frozen cells can then moved to the vapor phase of liquid nitrogen for long term storage, or remain at -80 for approximately six months.

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.

Congelamento cellule staminali embrionali umane

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Ricerca

Biologia

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Demonstrated in this video are the techniques for flash freezing and sectioning embryonic brain tissue from mouse. Useful tips for using the cryostat are given, including troubleshooting methods that can be used while cutting to ensure that the resultant tissues sections are free of cracks and other distortions.

Flash Congelamento e criosezionamento E12.5 cervello di topo

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Congelamento, lo scongelamento, e celle di imballaggio per il trasporto

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l&#39;Air Interface Liquid

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of fluorescently tagged proteins using total internal fluorescence (TIRF) microscopy is used to visualize and quantify changes in cytoskeletal dynamics. TIRF microscopy and the use of fluorescent tags also allows for quantification of the changes in cytoskeletal dynamics caused by mutations in actin. Using this technique, quantification of cytoskeletal function in live cells valuably complements in vitro studies of protein function. As an example, missense mutations affecting the actin residue R256 have been identified in three human actin isoforms suggesting this amino acid plays an important role in regulatory interactions. The effects of the actin mutation R256H on cytoskeletal movements were studied using the yeast model. The protein, Aip1, which is known to assist cofilin in actin depolymerization, was tagged with green fluorescent protein (GFP) at the N-terminus and tracked in vivo using TIRF microscopy. The rate of Aip1p movement in both wild type and mutant strains was quantified. In cells expressing R256H mutant actin, Aip1p motion is restricted and the rate of movement is nearly half the speed measured in wild type cells (0.88 &#177; 0.30 &#956;m/sec in R256H cells compared to 1.60 &#177; 0.42 &#956;m/sec in wild type cells, p &#60; 0.005).

Disease-causing mutations in actin can alter cytoskeletal function. Cytoskeletal dynamics are quantified through imaging of fluorescently tagged proteins using total internal fluorescence microscopy. As an example, the cytoskeletal protein, Aip1p, has altered localization and movement in cells expressing the mutant actin isoform, R256H.

Aip1p Dynamics sono alterati dalla R256H mutazione in actina

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Tissue Triage e Freezer per i modelli di malattia muscolare scheletrico

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Plunge congelamento: uno strumento per l&#39;ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

L'ingestione di fluorescente, nanoparticelle magnetiche per determinare la capacità di assorbimento di liquido negli insetti

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...