Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro pianificazione (NRF-2014R1A1A2057527 e NRF-2016R1D1A1B03934418).

1. preparazione del attraverso-foro alluminio piastra e magnete una matrice
<ol><li>Preparare due 50 mm x 50 mm (o superiore) piastre in alluminio. Lo spessore di ogni piatto era 300 µm che è la metà del diametro del tallone.</li>
	<li>Costituiscono una matrice di attraverso-foro di 30 x 30 su una delle piastre in alluminio utilizzando un incisore rotativo di CNC con un po' di micro punta Φ550-µm con 30 mm/s di tasso di tuffo e 8000 RPM di velocità dell'alberino. La distanza tra ogni foro (da centro a centro) era 1 mm (Figura 1a e 2a Figura, io).</li>
	<li>Costituiscono una matrice di 30 x 30 di fori Φ750-µm sull'altra piastra di alluminio, utilizzando la stessa procedura come descritto nella 1.2 (Figura 1a e 2a Figura, ii).</li>
	<li>Collegare le due piastre vicenda utilizzando un nastro adesivo e formare fori di allineamento di mm Φ3 a ciascuno dei quattro angoli di entrambe le piastre in alluminio.</li>
	<li>Immergere le piastre di alluminio in 15% di acido solforico per 12 h pulire le superfici. Dato che il sottile strato di ossido di alluminio sulla superficie dell'alluminio lo rendono resistente alla corrosione, il diametro del foro e lo spessore della piastra non vengono modificate da questo trattamento acido.</li>
	<li>Costituiscono una matrice di 30 × 30 di 1 x 1 x 1 magneti di neodimio mm (con una forza magnetica di 0.363 N). Garantire che ogni magnete è la polarità opposta al suo vicino. Per evitare la rottura o la dispersione della matrice magnete, attaccare una piastra di alluminio di 30 x 30 mm sul fondo della matrice magnete utilizzando nastro biadesivo (Figura 2a, iii e inserto in Figura 2).</li>
</ol>2. processo di registrazione dei colori perlina
<ol><li>Allineare e impilare le due piastre di alluminio (piastra superiore: 750-µm-foro piastra, piastra inferiore: 550-µm-foro piastra) utilizzando i fori di allineamento preparati ai quattro angoli di ciascuna piastra (Figura 1b).</li>
	<li>Bloccare le due piastre insieme inserendo M3 bulloni nei fori di allineamento e quindi fissare i bulloni con dadi (Figura 1b).</li>
	<li>Impilare la piastra di alluminio sulla matrice preparato magnete (Figura 1b, 2be 2C). Allineare la matrice dei magneti e la matrice di attraverso i fori nella piastra di alluminio durante il processo di sovrapposizione. Quindi utilizzare un nastro adesivo per fissare la posizione della matrice magnete.</li>
	<li>Posto un numero sufficiente di acciaio mm SUJ2 Φ600 perline sull'Assemblea di piatto e manipolare le perle utilizzando un acryl (o non-metallici) piastra tali che una perlina diventa intrappolata in ogni buco (Figura 1C, 1De 1e) mentre simultaneamente rimuovendo le perline in eccesso che non hanno presentato nei fori.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la piastra superiore per evitare indesiderate scattering e la dislocazione dei branelli intrappolati (Figura 1f).</li>
</ol>3. concavo microtiter fabbricazione
<ol><li>Spostare lo stampo concavo microtiter, prodotto nei passaggi 2.1 a 2.5, sopra, a una piastra di Petri.</li>
	<li>Mescolare il polidimetilsilossano (PDMS) monomero e agente indurente in base istruzioni19 del produttore con un monomero PDMS: rapporto di 10:1 catalizzatore di vulcanizzazione.</li>
	<li>De-gas la miscela PDMS utilizzando un essiccatore e pompa a vuoto per rimuovere eventuali bolle intrappolate nella miscela PDMS.</li>
	<li>Versare nello stampo concavo microtiter PDMS e de-gas utilizzando la stessa procedura come descritto al punto 3.3 (Figura 1f).</li>
	<li>Cuocere il composto PDMS su una piastra riscaldante a 80 ° C per 2 h formare un substrato PDMS tallone-embedded (Figura 1 g).</li>
	<li>Rimuovere il substrato PDMS curato dallo stampo (Figura 1 g). Nel processo di rimozione, spruzzare di metanolo con bottiglia di lavaggio per staccare il substrato PDMS dallo stampo.</li>
	<li>Utilizzando un Φ15 x 2 mm magnete, rimuovere le sfere d'acciaio intrappolate dal substrato PDMS (Figura 1 h). Per questo processo, può essere utilizzato qualsiasi magnete che è sufficientemente forte per estrarre le perle dal substrato PDMS.</li>
</ol>4. cultura sferoide
<ol><li>Tagliare il substrato PDMS concavo microtiter-fantasia utilizzando un pugno di biopsia di mm Φ14 per essere montati nella piastra a 24 pozzetti in questo studio.</li>
	<li>Sterilizzare il substrato PDMS di mm Φ14 risultante in una sterilizzatrice autoclave a 121 ° C e 15 psi.</li>
	<li>Posto il substrato PDMS in una piastra ben 24.</li>
	<li>Rivestire l'intero substrato PDMS con soluzione al 4% (p/v) pluronic F-127 durante la notte per evitare il collegamento delle cellule sulla superficie di pozzetti. Durante il processo di rivestimento, rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nei pozzetti concavi pipettando o utilizzando un pulitore ad ultrasuoni.</li>
	<li>Lavare tre volte la soluzione di F-127 mediante tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Semi di 1 mL di soluzione di cella-medio (Medium di Eagle per volta di Dulbecco) (che contiene 2 x 106 cellule) sul substrato PDMS. Si noti che la densità di semina può essere cambiata secondo la dimensione della sferoide di destinazione e/o tipo di cella di destinazione. Qui, le cellule staminali adiposo-derivate (ASC) sono state usate.</li>
	<li>Aspirare il 1 mL di terreno utilizzando una pipetta di 1000 µ l per rimuovere tutte le cellule in eccesso che non sono rimasti intrappolate nei pozzetti (Figura 3).</li>
	<li>Incubare le cellule a 36,5 ° C, umidità di > 95% e 5% CO2 condizione. In caso di ASC utilizzata nel nostro studio, le cellule aggregate per uno sferoide in 48h.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy.">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li><li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes.">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li><li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+little+world:+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions.">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing.">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li><li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids.">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).</li><li>Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medium+composition+on+the+morphology+and+function+of+rat+hepatocytes+cultured+as+spheroids+and+monolayers.">Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).</li><li>Nyberg, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver.">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel.">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Choi, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays.">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li><li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clustering+of+pancreatic+islet+cells+using+concave+microwell+array.">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li><li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model.">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li><li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model.">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li><li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network.">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li><li>Corning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).</li><li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+cavities+in+polydimethylsiloxane+using+DRIE+silicon+molds.">Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).</li><li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

La sfida principale di questo metodo di fabbricazione era il fissaggio sicuro dei branelli della matrice del attraverso-foro nella piastra di alluminio. Per risolvere questa sfida, forza magnetica sotto forma di una matrice di 30x30 magnete è stato utilizzato per fissare le perline saldamente, come mostrato nelle figure 6 e 7. La densità di flusso magnetico della matrice di magnete, che ha la polarità opposta, è più forte al centro di ogni superficie del magnete. Poiché l'intensit?...

Le cellule coltivate in una forma sferoide sono più simile a tessuto reale nel corpo di una coltura planare bidimensionale1. Dato questo vantaggio, l'uso di sferoidi è stata adottata per migliorare lo studio della interazione cellula-cellula2,3, immunitario-attivazione4,5e6di differenziazione di screening di stupefacenti. Inoltre, sferoidi incorporando più tipi di cellule sono stati applicati recentemente a organoids (quasi-fisiologiche tessuto tridimensionale (3D)), che sono molto utili per studiare lo sviluppo e la malattia umana7. Diversi metodi sono stati utilizzati per produrre sferoidi. Il metodo più semplice prevede l'utilizzo di una superficie non-adesivo, tale che le cellule di aggregazione con gli altri e sferoidi di forma. Una capsula di Petri può essere trattata con albumina di siero bovino, pluronic F-127 o un polimero idrofobico (ad es. in metacrilato di 2-hydroxyethl poli) per rendere la sua superficie non adesivo89. Il metodo del filatore-pallone è un altro ben noto mezzo di produrre grandi quantità di sferoidi10,11. In questo metodo, le cellule sono tenute in sospensione da mescolando per impedire loro di diventare attaccato al substrato. Invece, il galleggiante cellule aggregato di sferoidi di forma. Il metodo superficiale non adesivo e il filatore boccetta metodo può produrre grandi quantità di sferoidi. Tuttavia, essi sono soggetti a limitazioni compreso le difficoltà nel controllare la dimensione della sferoide, come pure il tracciamento e monitoraggio di ogni sferoide. Come rimedio a tali problemi, un altro metodo di produzione della sferoide, vale a dire, l'impiccagione metodo drop può essere autonomo12. Si tratta di deposito di gocce di sospensione cellulare sulla parte inferiore del coperchio di una piastra di coltura. Queste gocce sono di solito da 15 a 30 µ l di dimensioni e contengono circa 300 a 3000 cellule13. Quando il coperchio viene invertito, le gocce sono tenute in posizione dalla tensione superficiale. L'ambiente di microgravità in ogni goccia si concentra le cellule, che poi formano sferoidi singoli presso l'interfaccia liquido-aria libera. I vantaggi dell'impiccagione metodo drop sono che offre una distribuzione delle dimensioni ben controllato, mentre è facile da tracciare e monitorare ogni sferoide, riguardante i metodi di boccetta di superficie e spinner non adesivo. Tuttavia, questo metodo comporta uno svantaggio in quanto la produzione massiccia di sferoidi e il processo di produzione stesso è eccessivamente labor intensive.
Una matrice di micropozzetti è un piatto piatto con molti micro-dimensione pozzi, ciascuno con un diametro che varia da 100 a 1000 µm. Il principio di produzione di sferoide quando utilizzando micropozzetti è simile a quella del metodo superficiale non adesivo. I benefici includono il fatto che i micropozzetti forniscano spazi tra i micropozzetti per separare le cellule o sferoidi, tale che è facile controllare la dimensione di sferoide, mentre anche lo rende facile da monitorare ogni singola sferoide. Con un gran numero di micropozzetti, produzione di alto-rendimento sferoide è anche possibile. Un altro vantaggio di micropozzetti è l'opzione per pozzi di forma di diverse forme (hexahedral, cilindrico, trigonal prismatico) a seconda di unici scopi sperimentali degli utenti. In generale, tuttavia, una forma di tridimensionale (3D) concava (o emisferica) è considerata come essendo il più adatto per la produzione di uniforme-dimensioni singoli sferoidi. Di conseguenza, l'utilità di micropozzetti concavi è stato segnalato per molti studi di biologia cellulare come quelli esame del cardiomyocyte differenziazione delle cellule staminali embrionali14, la secrezione dell'insulina delle cellule dell'isolotto cluster15, la attività enzimatica di epatociti16e la farmacoresistenza tumorale sferoidi17.
Purtroppo, la fabbricazione di micropozzetti spesso richiede strutture specializzate micropatterning; metodi convenzionali basati su fotolitografia richiedono esposizione e strutture in via di sviluppo mentre metodi basati su ion-acquaforte reattive bisogno apparecchiature plasma e il fascio di ioni. Tale attrezzatura è costosa che, insieme con il processo di fabbricazione complicati, presenta un'elevata barriera all'entrata per i biologi che non hanno accesso alla microtecnologia. Per superare questi problemi, altri metodi economici come ghiaccio Litografia18 (con le goccioline di acqua congelata) e il metodo di membrana flessibile14 (utilizzando una membrana, substrato del attraverso-foro e un vuoto) sono stati suggeriti. Tuttavia, questi metodi inoltre incorrere in seri inconvenienti come fosse difficile controllare le dimensioni del modello, il raggiungimento di elevati rapporti di aspetto e la produzione di più grande zona micropozzetti.
Per superare i problemi di cui sopra, stiamo proponendo un metodo di fabbricazione del romanzo concavo microtiter utilizzando un substrato del attraverso-foro, le perline in acciaio e una matrice di magnete. Utilizzando questo metodo, centinaia di micropozzetti sferici concavi può essere fabbricato sfruttando il meccanismo di perline metalliche autobloccanti magnetico-forza-assistita (Figura 1). Il processo di fabbricazione prevede l'utilizzo di pochissimi servizi costosi e complicati e non richiede molte competenze avanzate. Come tale, anche addestrato può facilmente intraprendere questo metodo di fabbricazione. Per illustrare il metodo proposto, umano-adiposo-ha derivato le cellule staminali sono state coltivate nei pozzetti concavi per produrre sferoidi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CNC rotary engraver</td>
			<td style="width:111px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:119px;">EGX-350</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro drill bit</td>
			<td style="width:111px;">HAM Pr&#228;zision</td>
			<td style="width:119px;">30-1301 TA</td>
			<td>&#934; 0.55 and 0.75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sulfuric acid 98%</td>
			<td style="width:111px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">7683-4100</td>
			<td style="width:167px;">For cleaning aluminum plate. 
			Dilute with distilled water with 15% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:111px;">Supermagnete</td>
			<td>W-01-N</td>
			<td>1 x 1 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bearing ball</td>
			<td style="width:111px;">Agami Modeling</td>
			<td style="width:119px;">SUJ2</td>
			<td>&#934; 600 &#956;m steel bead</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:111px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">p2443</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

Una cultura di sferoide è uno strumento utile per comprendere il comportamento cellulare in quanto fornisce un in vivo-come ambiente tridimensionale. Vari metodi di produzione di sferoide come superfici non-adesivo, boccette filatore, impiccagione gocce e micropozzetti sono stati utilizzati in studi di interazione della cellula--cellula, immunitario-attivazione, lo screening, staminali differenziazione cellulare e generazione organoid. Tra questi metodi, micropozzetti con una geometria tridimensionale concava hanno guadagnato l'attenzione di scienziati e ingegneri, dati loro vantaggi di generazione sferoide uniforme di dimensioni medie e la facilità con cui possono essere le risposte di sferoidi individuali monitorati. Anche se sono stati proposti metodi economici come l'uso di membrane flessibili e ghiaccio Litografia, queste tecniche comportano gravi inconvenienti quali difficoltà nel controllare le dimensioni del reticolo, raggiungimento di elevati rapporti di aspetto e la produzione di aree più grandi di micropozzetti. Per superare questi problemi, vi proponiamo un metodo affidabile per la realizzazione di micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Questo metodo utilizza una matrice di foro passante 30x30, diverse centinaia di micrometro-ordine acciaio perle e la forza magnetica per fabbricare 900 micropozzetti in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm. Per dimostrare l'applicabilità del nostro metodo per applicazioni biologiche delle cellule, abbiamo coltivate cellule staminali adipose per 3 giorni e prodotto con successo utilizzando la nostra piattaforma microtiter sferoidi. Inoltre, abbiamo effettuato una simulazione di magnetostatica per studiare il meccanismo, per cui la forza magnetica è stato utilizzato per intrappolare le sfere d'acciaio nei fori. Noi crediamo che il metodo di fabbricazione microtiter proposto potrebbe essere applicato a molti studi cellulari basati su sferoide quali lo screening di stupefacenti, rigenerazione tissutale, differenziazione delle cellule staminali e metastasi del cancro.

Uno stampo convesso e microtiter modello erano stati fabbricati con successo seguendo la procedura descritta 2.1 a 3.7. (Figura 4). Le perle d'acciaio commerciali sono rimasti intrappolate nella matrice del attraverso-foro di 30x30. Le perle erano tenute strettamente senza lacune tra le perline e i corrispondenti fori di passaggio (Figura 4a). La forma del fabbricato microtiter concavo è concavo emisferica, con un diametro di 60...

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A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Questo manoscritto presenta un metodo affidabile di fabbricare micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Usando la forza magnetica, perline in acciaio e una matrice di attraverso-foro, diverse centinaia micropozzetti sono stati formati in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm.

Una perlina accoppiato e matrice di magnete per lo stampaggio di micropozzetti con geometrie variabili concavi

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

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8.6K Views.  Chung-Ang University. Questo manoscritto presenta un metodo affidabile di fabbricare micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Usando la forza magnetica, perline in acciaio e una matrice di attraverso-foro, diverse centinaia micropozzetti sono stati formati in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm.

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Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

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Bioingegneria

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Rapida e basso costo Prototipazione di dispositivi medici che usano 3D Stampo Stampato per stampaggio ad iniezione Liquid

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimerici Microneedle Array Fabrication per Fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-step altezza variabile fotolitografia per Valvolati multistrato microfluidici Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Assemblea e monitoraggio dello sviluppo microbico della comunità all&#39;interno di una piattaforma di array Microwell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...