Questa ricerca è stata sostenuta da T32 (CA 9686-18) e TL1 (TL1TR001431) premi post-dottorato borsa di formazione (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), così come U01 PAR-12-095 (Kumar) e P30 CA051008-21 (Weiner). la fissazione del campione, sezionamento e colorazione è stata eseguita nel Lombardi Comprehensive Cancer Center e Istologia del tessuto Shared Resource. Ringraziamo Richard Schlegel per le discussioni utili. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Cancer Institute e il National Institutes of Health.

1. Istituzione del Cell 3D cultura sistema di inserimento <ol><li> Posizionare inserti colture cellulari 2 policarbonato in un orientamento invertita (lato filtro verso l&#39;alto) verso il basso in un piatto ben 6 (Figura 1A). </li><li> Applicare uno strato sottile di 0,1% di gelatina in acqua al lato inferiore dell&#39;inserto e lasciare asciugare (10-20 min) in una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità. </li><li> Ripetere passaggio 1.2 altre due volte per un totale di 3 applicazioni di 0,1% di gelatina sugli inserti. NOTA: Il rivestimento di gelatina aiuterà diffusione limite tra le camere. </li><li> Per raccogliere i CRC primari da condizioni di coltura standard, aggiungere 5 ml di PBS per lavare il pallone di coltura. <ol><li> Trypsinize le cellule utilizzando (1 mL per un T-25 e 2 mL di T-75) 0,25% tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C. toccare delicatamente il lato del pallone per aiutare a sloggiare le cellule. Quindi procedere per bloccare la reazione tripsina e raccogliere le cellule con l&#39;aggiunta di 5 ml di DMEM completo. </li><li> Raccogliere<html> le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare la provetta a 4 ° C e 188 XG e contare utilizzando un contatore di cellule automatico o un emocitometro. </li><li> Risospendere 600.000 CRC in 250 microlitri mezzi (CM) condizionati e aggiungere alla correttamente orientata (lato del filtro verso il basso) la cultura inserto (Figura 1B). Questo è indicato come la camera interna. Nota: CM è F-mezzi condizionati dalle cellule irradiate J2 e contiene 10 micron Y-27632 come precedentemente descritto 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Applicare 2 ml di CM alla camera esterna del 6 pozzetti e incubare a 37 ° C per una notte (per almeno 18 h). </li><li> Rimuovere accuratamente il CM sulla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta e aggiungere lentamente supporti differenziamento (DM) alla camera interna con una mL pipetta 1 fino completa. Fare attenzione a non disturbare lo strato di cellule. </li></ol>Le &quot;&gt; 2. Manutenzione delle Culture 3D <ol><li> Controllare le culture ogni giorno. Le cellule sane appaiono come mostrato in Figura 2. </li><li> Modificare il CM nella camera esterna ogni giorno o ogni altro giorno a seconda del metabolismo delle cellule. </li><li> Quando i media del interiore cambia colore da camera (giallo), rimuovere con attenzione i media sulla camera di filtro interno con un 1 mL o 200 microlitri pipetta. </li><li> Aspirare il supporto nel esterna 6 ben camera di piatto con una punta di aspirazione. </li><li> Usando una pipetta 1 ml, applicare lentamente DM fresco alla camera interna fino al completo. Fare attenzione a non graffiare o altrimenti rimuovere lo strato di cellule. </li><li> Sostituire i media nella camera esterna con 2 ml di CM fresco. </li><li> Mantenere le culture per 2 settimane, e quindi procedere al trattamento per l&#39;isolamento bimolecular desiderato. NOTA: Ogni riga nella piastra 6 bene, un totale di sei inserti (Figura 1B), dovrebbe essere processato per esperimento per acquisire abbastanza cellule per DNA, RNA o proteine ​​per l&#39;analisi. </li><li> mezzi Aspirare nella camera esterna e risciacquare con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Rimuovere con attenzione dei media dalla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta e aggiungere 500 microlitri di PBS. Evitare di raschiare o comunque disturbare le cellule sulla membrana. </li><li> Aspirare PBS dalla camera esterna e trasferire PBS dalla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta. Una volta che il PBS è stato rimosso, procedere direttamente alla applicazione appropriata descritto di seguito. Non lasciare che la membrana si asciughi. La coltura può essere mantenuto brevemente in PBS finché l&#39;applicazione è pronto per iniziare. </li></ol> 3. L&#39;elaborazione dei Filtri per Pellet Banking <ol><li> Aggiungere 100 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per ogni camera interna e incubare per 5 min a 37 ° C. </li><li> In breve e con attenzione agitano / raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta 200 microlitri mentre pipettando su e giù (evitare puncturing la membrana). Incubare per 1 min a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 250 ml di CM alla prima camera interna e pipetta su e giù delicatamente per lavare il filtro. </li><li> Trasferimento risospesa celle alla camera del filtro adiacente che contiene le stesse condizioni di media e ripetere pipettando su e giù. </li><li> Ripetere questa procedura per ciascuno di detti inserti di un&#39;unica condizione. Raccogliere e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 centrifuga. </li><li> Lavare ogni camera interna con un ulteriore 100-200 ml di CM per raccogliere tutte le cellule rimanenti. Aggiungere alla provetta da 1,5 mL centrifuga nel passaggio 3.5. </li><li> Spin le cellule a 423 xg in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare il pellet di cellule una volta con 1000 ml di PBS. </li><li> Spin nuovo a 423 xg in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min. </li><li> Aspirare PBS e congelamento a -80 ° C per un uso successivo. </li></ol> 4. L&#39;elaborazione dei Filtri per RNA o DNA Isolation <ol&gt; <li> Aggiungere 200 microlitri di guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio o reagente simile estrazione alla camera interna e agitare brevemente le cellule sulla superficie della membrana pipettando su e giù. </li><li> Incubare nel reagente di estrazione per 5 min a temperatura ambiente con la camera esterna asciutta. <ol><li> Poiché il filtro può dissociarsi dal dell&#39;inserto, lavare la membrana del filtro dissociato pipettando la soluzione di estrazione su e giù. Raccogliere quanto più del reagente di estrazione possibile inclinando la piastra ben 6 ed aspirando il liquido residuo. </li></ol></li><li> Seguire il protocollo del produttore per la purificazione e il recupero di DNA, RNA o proteine. </li></ol> 5. L&#39;elaborazione dei Filtri per l&#39;isolamento delle proteine <ol><li> Posizionare la cartuccia del filtro nella piastra 6 bene su ghiaccio. Per la camera interna, aggiungere 10 ml di tampone proteine ​​lisi integrato con 1 fluoruro di sodio mM (NaF), 1 mM di sodio vanadato (NAV), 100 mM dithiothreitol (DTT) e 100 ml di cocktail di anti-proteasi. </li><li> Agitare / raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta 20 ml mentre pipettando su e giù. Evitare di generare bolle nel tampone di lisi. </li><li> Incubare la piastra 6 bene con cartucce filtranti in ghiaccio per 10 min. </li><li> Ripetere raschiatura e quindi risciacquare la superficie della membrana con il tampone di lisi. </li><li> Raccogliere i lisati dai 6 inserti e trasferire in una provetta da 1,5 ml centrifuga sul ghiaccio. </li><li> Risciacquare la prima membrana con altri 10 ml di tampone di lisi e trasferimento al filtro successivo. </li><li> Ripetere il passaggio 5.6 per tutti gli inserti, la raccolta di qualsiasi soluzione tampone di lisi residuo e aggiungere al 1,5 ml di tubo (passo 5,5). </li><li> Incubare il campione in ghiaccio per un ulteriore 5 min. </li><li> Spin alla massima velocità (16.873 xg in una centrifuga da tavolo) per 15 min a 4 ° C. </li><li> Pipetta lisato surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Procedere all&#39;analisi di concentrazione di proteine ​​o store lisati a -80 ° C. </li></ol> 6. elaborazione per H &amp; E e Immuno-colorazione <ol><li> Aggiungere 500 microlitri e 1 ml di 10% NBF (formalina neutra tamponata) alla camera interna ed esterna e lasciate incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Aspirare il NBF dalla camera esterna e aggiungere 1 ml di agarosio idrossietil (HEA) l&#39;elaborazione di gel per un mL centrifuga 1.5. Lentamente sciogliere l&#39;agarosio in un forno a microonde con bassa potenza e ripetuto 10-20 s impulsi fino a quando l&#39;agarosio è sciolto. </li><li> Tenere il HEA in un bagno caldo a 37 ° C per evitare la solidificazione fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Rimuovere il NBF dalla camera interna e applicare 25 ml di HEA fusa alla camera interna e consentire l&#39;agarosio solidificare per 2-5 min. </li><li> Wet 2 schiuma pastiglie istologia a 10% NBF e mettere un pad in una cassetta embedding (vedi Figura 3D). </li><li> Utilizzare un # 11 bisturi (che ha una lama a punta fine molto forte) di segnare il filtro dal lato inferiore dell&#39;insertocamera, parzialmente svincolandola dalla camera inserto in plastica. </li><li> Mettere una piccola quantità (100-200 ml) di NBF in una capsula di Petri e immergere il filtro parzialmente sloggiato nel NBF (Figura 3A). </li><li> Con # 10 bisturi, premere delicatamente contro il centro del filtro, dall&#39;interno della camera di inserto, per rimuovere completamente il filtro dal inserto barilotto (Figura 3B). Se non vi è alcuna parte del filtro che è ancora attaccato alla canna, tagliare con il bisturi. </li><li> Tagliare il filtro HEA rivestita a metà con il # 10 bisturi lama (Figura 3C). </li><li> Disporre ciascuna metà del filtro sul tappetino in gomma nella cassetta istologia preparato al punto 6.4 (Figura 3D). </li><li> Aggiungere il secondo il 10% NBF spugna imbevuta alla cassetta, sandwich il filtro. </li><li> Snap sigillare la cassetta, posto in NBF, e incubare durante la notte. </li><li> filtri di processo in blocchi di paraffina per il sezionamento e la colorazione comedescritto in precedenza 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis.">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li><li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development.">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li><li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+stem+cells.">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li><li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells.">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li><li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells.">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li><li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogs+of+the+Novel+Phytohormone,+Strigolactone,+Trigger+Apoptosis+and+Synergy+with+PARP1+Inhibitors+by+Inducing+DNA+Damage+and+Inhibiting+DNA+Repair.">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868 (2015).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

linee cellulari primarie sono una piattaforma importante e in rapido sviluppo per la ricerca sul cancro. Il sistema di coltura 3D basato su inserto cultura sostiene la differenziazione della prostata CRC primari entro un lasso di tempo di due settimane. Il metodo del filtro CRC rappresenta un nuovo metodo di media produttività per la ricerca della prostata. Esistenti modelli del mouse PDX sono in termini di tempo ed estremamente costoso, e molti dei campioni PDX non possono essere coltivate in cultura, limitando la sperimentazione investigatore-avviato e la loro utilità. Inoltre, mentre i tassi di successo di stabilire PDX variano notevolmente 13, il metodo CRC ha un alto tasso di successo nella creazione di linee cellulari 3. Riteniamo che il nostro sistema sia complementare all&#39;approccio organoide della prostata basate su R-spondina; Tuttavia, la mancanza di successo per quanto riguarda la creazione di organoidi da cancro alla prostata primaria stato segnalato 14. Inoltre, i media, i metodi di creazione,e manutenzione di CRC sono notevolmente più semplice rispetto all&#39;approccio organoide prostata R-spondina-based. Come ulteriore vantaggio, i CRC possono essere definiti e impiegati per testare abbinati culture normali e tumorali per i confronti diretti molecolari. Alcuni problemi tecnici rimangono da affrontare quando si stabilisce questo sistema. In primo luogo, il rivestimento di gelatina applicata alla parte inferiore del filtro inserto aiuta, ma non elimina, la diffusione dei media attraverso la membrana. Cambiamenti dei media frequenti sono utilizzati per mantenere il rispettivo gradiente di differenziazione (strato di cellule superiore o apicale) vs crescita (strato inferiore o basale delle cellule) condizioni all&#39;interno della camera. In secondo luogo, successo culture 3D CRC richiesta una relativamente alta densità di semina cellulare. Bassa densità di semina diedero scarsi risultati per quanto riguarda l&#39;integrità dello strato di cellule che si sviluppa sulla superficie del filtro. Questa è una considerazione comune quando la coltura CRC, man mano che crescono più vigorosamente quando mantenuto unalta densità di cellule T. Infine, la rimozione corretta e successiva incorporazione di paraffina dello strato di cellule intatte sia critico per definire l&#39;estensione della differenziazione cellulare. L&#39;aggiunta di idrossietil agarosio (HEA) sia diminuita perdita di cellule e migliorato la morfologia delle cellule nel rispetto ai filtri non incorporati (non mostrato). Una volta correttamente incorporato, i filtri sono stati sezionati e trattati in modo indistinguibile da tipici campioni di cellule e tessuti. Stiamo appena cominciando a emulare l&#39;architettura del dell&#39;epitelio prostatico utilizzando questo metodo filtro. Ulteriori modifiche alle condizioni di coltura, ai media e al substrato sono garantiti, che può essere affrontato con facilità. Ad esempio, i media differenziazione riformulati che possono meglio favorire luminale vs differenziazione basale possono essere rapidamente testati. Dal momento che l&#39;infezione lentivirale di CRC è stata eseguita con la stessa facilità con le cellule tumorali commerciali 7 e il CRC 2D avere alcosì state trasfettate con vettori di tecnologia editing CAS9 / gene CRISPR di modificare in modo permanente il genoma della cellula (dati non riportati), l&#39;effetto dei geni mutati, eliminati o riparati possono essere testati. Allo stesso modo, il monitoraggio lignaggio può essere reso possibile con l&#39;introduzione di specifici geni reporter lignaggio. Oltre a modificare i media o le cellule, modifiche alla superficie del filtro possono essere testati. Diversi substrati membrana filtro sono disponibili in commercio. Inoltre, abbiamo trovato che la matrice extracellulare commerciale fornisce un ambiente di crescita adatto quando applicato alla parte interna del filtro. Come uno degli obiettivi del sistema di inserimento è di modellare meglio microambiente prostata, forse le modifiche più interessante potrebbe essere l&#39;introduzione di cellule stromali normali o tumorali derivate, sia in co-coltura con le CRC entro i confini dell&#39;inserto o nella camera inferiore per condizionare i mezzi di crescita. Modifica l&#39;inserto bene con sezioni of tessuto prostatico decellularized è anche possibile. In questo approccio, stromali / interazioni epiteliali possono consentire alle cellule primarie di utilizzare il tessuto decellularized come impalcatura per la crescita. La capacità di stabilire cellule primarie e per fornire in seguito le condizioni per la loro differenziazione è un formato ideale per la ricerca di più biologicamente rilevanti in normale sviluppo ghiandolare e per la ricerca sul cancro. Il sistema qui descritto fornisce una piattaforma per cui un numero illimitato di tipi cellulari e modifiche possono essere combinati per adeguare il sistema alle singole esigenze sperimentali e di raccogliere in modo affidabile i campioni da analizzare.

L&#39;identificazione e l&#39;uso di terapie del cancro che sono personalizzati per gli individui sono un obiettivo primario nella ricerca sul cancro. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi approcci che consentono una maggiore facilità nella creazione di colture cellulari primarie, fornendo potenzialmente modi sia di identificare e testare terapie personalizzate. Ad esempio, la prostata basata R-spondina approccio organoide 1 consente tridimensionale (3D) coltura di normali e metastatici cellule tumorali della prostata in una matrice extracellulare commerciale (ad esempio, Matrigel), mentre il metodo condizionale riprogrammazione delle cellule (CRC) sviluppato presso Georgetown 2, 3 utilizza più condizioni di coltura 2D standard. In particolare, la combinazione di un inibitore della chinasi Rho (Y-27632) e cellule feeder fibroblasti murini J2 irradiati portano alla coltura indefinito di CRC cheratinociti 2. La metodologia è CRCestremamente robusto, con linee cellulari primarie stabilite con successo e mantenuto a tempo indeterminato dalla prostata e molti altri tessuti epiteliali normali e maligne 3. È importante sottolineare che la nostra tecnologia CRC ha permesso la rapida identificazione della base eziologico per papillomatosi respiratoria ricorrente in un paziente che non era riuscito un certo numero di trattamenti farmacologici precedenti. Inoltre, utilizzando normali e tumorali derivate dal CRC, l&#39;identificazione di successo di un farmaco approvato dalla FDA, vorinostat, è stata fatta entro due settimane dalla biopsia dei tessuti iniziale. Il paziente è stato posto sulla vorinostat, conseguente trattamento di successo della loro malattia 4. La prostata normale si compone di luminale, basale e le cellule neuroendocrine rari 5. cellule luminali formano lo strato epiteliale colonnare della ghiandola ed esprimono il recettore degli androgeni (AR), così come altri marcatori luminali quali citocheratine 8 e 18 e proantigene specifico-stato (PSA) 6. Viceversa, le cellule basali sono localizzati sotto lo strato luminale ed esprimono citocheratina 5 e p63, ma bassi livelli di AR 5. Abbiamo 7, 8, 9 e altri 10 hanno utilizzato con successo CRC prostata in preclinici indagini sensibilità ai farmaci meccanicistici. Tuttavia, se coltivate in condizioni di coltura tissutale 2D standard, queste cellule non riescono a cooperare pienamente AR segnalazione 10. È importante sottolineare che, quando posto sotto la capsula renale di topi immunodeficienti, il CRC riacquistato normale prostata architettura e la funzione ghiandolare che indica che CRC prostata mantengono il loro impegno lignaggio, quando sono immessi in un ambiente permissivo. Lo sviluppo del sistema di coltura cellulare basato inserto filtro qui descritto consente rapidi (2 settimane) differenziazione in vitro di CRC prostata come evidenziato by l&#39;aumentata espressione di geni bersaglio AR e AR, nonché diminuzione dei livelli di p63. Gli inserti del filtro utilizzati contengono membrane di policarbonato (dimensione dei pori, 0,4 micron) che possono sostenere la coltura di cellule di mammifero. Il sistema, sviluppato, fa uso di normali e maligne CRC prostata, piastre di coltura così 6 e gli inserti del filtro. Terreni di coltura cellulare condizionati dalle cellule J2 11 è posto nei media da camera e della prostata differenziazione di fondo nella camera superiore. Le tecniche descritte nel presente documento supportano la differenziazione delle cellule della prostata luminale entro una settimana 2 lasso di tempo, in linea con gli obiettivi della medicina personalizzata. Era inoltre indispensabile sviluppare le metodologie che consentono la profilatura molecolare, genetica e cellulare completa delle culture. Approcci per isolare DNA, RNA e proteine ​​da cellule rilasciate dalla superficie del filtro sono stati sviluppati e semplificato per l&#39;elaborazione del campione accurata ripetizione. Finally, la metodologia necessaria per la rimozione del filtro per consentire incorporamento, sezionamento e per H &amp; E, immunoistochimica e immunofluorescenza colorazione, è completamente descritto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 Well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin 0.1% in water</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpel 11 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>13721-39-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mix Media</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-270-333-M025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12585-014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15710-064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Adherent Dressing</td>
			<td>Telfa</td>
			<td>KDL2132Z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SIAL0167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>CG-M492</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation

le cellule riprogrammate condizionale (CRC) forniscono un metodo sostenibile per la coltura di cellule primarie e la capacità di sviluppare ampie &quot;biobanche di vita&quot; di pazienti derivate linee cellulari. Per molti tipi di cellule epiteliali, vari approcci tridimensionale (3D) di coltura sono stati descritti che supporta uno stato differenziato migliorata. Mentre CRC mantengono la loro lineage committment al tessuto dal quale sono isolati, non riescono ad esprimere molti dei marcatori di differenziazione associate al tessuto di origine quando coltivate in normali due condizioni dimensionali (2D) di coltura. Per migliorare l&#39;applicazione della CRC paziente-derivato per la ricerca sul cancro alla prostata, un formato di cultura 3D è stato definito che consente una rapida luminale differenziazione cellulare (2 settimane in totale) in entrambe le cellule epiteliali della prostata normali e tumorali di derivazione. Qui, un formato basato su inserto del filtro è descritto per la coltura e differenziazione di entrambe le normali e maligni CRC prostata. A deDescrizione coda delle procedure richieste per la raccolta delle cellule e di elaborazione per la colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza sono forniti. Collettivamente formato coltura 3D descritto, in combinazione con le linee CRC primari, fornisce un importante medio per evidenziare sistema modello produttività per la ricerca della prostata biospecimen-based.

Il sistema basato su inserto coltura cellulare è una procedura relativamente semplice e rapida per la produzione di colture 3D di CRC prostata che supporta la differenziazione delle cellule del lume. Uno schema del sistema è mostrato (Figura 1A) evidenziando l&#39;applicazione del rivestimento di gelatina alla superficie inferiore della cartuccia filtrante. Gli inserti sono ribaltati solo per l&#39;applicazione della gelatina. Nella Figura 1B i filtri sono nell&#39;orientamento appropriato per la coltura. Utilizzando un inserto cellulare trasparente, un&#39;immagine rappresentativa di una sana cultura prostata CRC 3D è mostrato (10X) (Figura 2). La densa stratificazione di CRC sani dimostrato è tipico, dopo la fondazione e può essere osservata con un microscopio di luce standard. Durante insediamento, è fondamentale per visualizzare il livello di celle formate per garantire che il metodo è compatibile con una data linea cellulare e che l&#39;attaccamento appropriato e laYering delle cellule si sono verificati. HEA viene applicata all&#39;interno dell&#39;inserto come sopra. Dopo l&#39;applicazione del HEA, bisogna fare attenzione quando aver eseguito il filtro per rimuoverlo dalla inserto (Figure 3A, 3B). In tutte le fasi (figure 3A-3D), cura deve essere esercitato per minimizzare i movimenti inutili dello strato HEA sul filtro con celle. Lo strato CRC può essere facilmente interrotto e danneggiato durante il trasferimento al H &amp; E cassette (Figura 3D). Dopo asportazione del filtro HEA rivestita dalla canna di plastica (Figure 3A-3C), il filtro può essere dimezzato e trattati per sezionamento e colorazione con cassette incorporare standard (Figura 3D). Dividere il filtro a metà è importante per massimizzare la superficie disponibile per il sezionamento trasversale su H &amp; E e IF. immunofluorescenza colorazionenonché campo chiaro (BF) immagini delle cellule coltivate sul livello filtro sono stati raccolti usando un microscopio confocale a disco con funzionalità filatura DSU (Disk Scan Unit). Risultati rappresentativi per istologia e H &amp; E colorazione sono mostrati in una sezione trasversale dell&#39;inserto filtro e cellule (20X) (Figura 4). Con una cura adeguata, dimostriamo che uno strato CRC sugli inserti filtro può essere sezionato e macchiato, come è pratica standard per l&#39;esame istologico dei tessuti. Durante sezionamento, è possibile che il CRC a distaccarsi dal filtro come strato intatto di cellule come dimostrato (Figura 4). L&#39;immagine BF mostra strati cellule multistrato sopra della membrana porosa (Figura 5A). Le singole immagini fluorescenti per nuclei (DAPI, figura 5B), p63 (Figura 5C) e AR (Figura 5D) sono mostrati, come è l&#39;unione di tutte le tre marcatori di fluorescenza (Figura 5e). Infine, un composite BF e IF sovrapposizione viene mostrato (Figura 5F), che stabilisce la localizzazione del segnale di fluorescenza relativa alle cellule e il filtro. La sovrapposizione della macchia DAPI con il p63 se la colorazione dimostra chiaramente alcune cellule ancora in uno stato proliferativo. La localizzazione di AR IF colorazione nel nucleo è indicativo di riattivazione funzionale di AR in cellule della prostata. Un confronto tra l&#39;IF del nostro sistema inserto filtro ed un tessuto prostatico sezionato è mostrato (figure 6A, 6B) per dimostrare la somiglianza in sviluppo del nostro strato dell&#39;inserto CRC a quella dell&#39;epitelio prostatico. Il condotto prostata mostra l&#39;espressione di p63, coerente con le cellule della prostata basali. p63 colorazione è visto anche nei CRC sull&#39;inserto. Una percentuale più elevata p63 cellule esprimenti stata osservata nel nostro inserto rispetto alla sezione di tessuto intatto. Inoltre, sia nucleare e citoplasmatica AR sono visti nel TIS prostata<html> citare in giudizio la sezione e mentre i CRC sul inserto del filtro spettacolo espressione meno complesso AR, entrambi espressione AR nucleare e colorazione citoplasmatica è visto, simile alla prostata intatto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55279/55279fig1.jpg" /> Figura 1: Rappresentante immagini della cultura Dish 6-bene e Insert che compongono il sistema cultura in 3D. (A) inserti invertito per l&#39;applicazione del rivestimento di gelatina al lato inferiore del filtro (freccia). A ingrandisci dell&#39;inserto e filtro è spettacolo (nel riquadro). (B) inserti posizionati correttamente. Le camere interne ed esterne del sistema sono mostrate (frecce). La riga inscatolato in B mostra come campioni multipli sono ottenuti per una data condizione sperimentale. Al termine del periodo di crescita due settimane questi inserti possono essere raggruppati per produrre materiale sufficiente per l&#39;analisi.&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55279/55279fig2.jpg" /> Figura 2: un&#39;immagine rappresentativa di uno strato di sana CRC seminate su un trasparente filtro a membrana viene mostrato. Entrambe le camere interne ed esterne contenevano mezzi condizionata. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55279/55279fig3.jpg" /> Figura 3: un&#39;immagine rappresentativa di un filtro Dimezzato in due sezioni e messo in una cassetta di paraffina per l&#39;incorporamento. (A) del filtro inserto con rivestimento HEA dopo il gol e prima della rimozione. (B) La cartuccia del filtro rilasciato dalla canna policarbonato. ( <strong&gt; C) Il filtro correttamente dimezzato. (D) corretto posizionamento e orientamento delle due metà all&#39;interno del cassetto incorporamento. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55279/55279fig4.jpg" /> Figura 4: Un rappresentante H &amp; E macchiato Sezione trasversale del filtro Inserimento e cellule (20X). Sia la membrana (basso) e strato di cellule (top) sono mostrati. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55279/55279fig5.jpg" /> Figura 5: Una serie di rappresentante campo luminoso (BF) e immunofluorescenza (IF) ImmaginiLe cellule sezionato sul filtro (40X). sono mostrate sezioni trasversali del filtro e le cellule. Un&#39;immagine BF senza macchia delle cellule sulla superficie del filtro (5A) è accompagnato da immagini per il nucleo DAPI macchiato (5B) e immunofluorescenza colorazione per due diverse proteine, p63 (5C) e il recettore degli androgeni (AR, 5D). Una sovrapposizione composito sezioni cellulari (5E, F) definisce la localizzazione dei segnali IF nell&#39;ambito delle cellule e del filtro. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55279/55279fig6.jpg" /> Figura 6: Un rappresentante immunofluorescenza (IF) Immagine di celle sezionati sul filtro contro una sezione di prostata Epitelio dal tessuto (20X).Una immagine in sezione trasversale di una cartuccia del filtro è mostrato (Figura 6A) rispetto agli strati epiteliali duttali di una prostata intatta (Figura 6B). La colorazione del p63, AR e il nucleo è stata eseguita come in Figura 5. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K Views.  Lombardi Comprehensive Cancer Center. Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

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A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a viable treatment strategy and biopsy is not routinely performed, the availability of patient samples for research is limited. Consequently, efforts to study this disease have been challenged by a paucity of faithful disease models. To address this need, we describe here a protocol for the rapid processing of post-mortem autopsy tissue samples in order to generate durable patient-derived cell culture models that can be used in in vitro assays or in vivo orthotopic xenograft experiments. These models can be used to screen for potential drug targets and to study fundamental pathobiological processes within DIPG. This protocol can further be extended to analyze and isolate tumor and microenvironmental cells using Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS), which enables subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA at the bulk cell or single cell level. Finally, this protocol can also be adapted to generate patient-derived cultures for other central nervous system tumors.

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

This protocol describes a method for the rapid processing of post-mortem diffuse intrinsic pontine glioma samples for the establishment of patient-derived cell culture models or direct characterization of tumor and microenvironmental cells.

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) for prostate cancer are hampered by tumor heterogeneity and its complex microevolution dynamics. Traditional prostate cancer mouse models include, amongst others, germline and conditional knockouts, transgenic expression of oncogenes, and xenograft models. Generation of de novo mutations in these models is complex, time-consuming, and costly. In addition, most of traditional models target the majority of the prostate epithelium, whereas human prostate cancer is well known to evolve as an isolated event in only a small subset of cells. Valuable models need to simulate not only prostate cancer initiation, but also progression to advanced disease.
Here we describe a method to target a few cells in the prostate epithelium by transducing cells by viral particles. The delivery of an engineered virus to the murine prostate allows alteration of gene expression in the prostate epithelia. Virus type and quantity will hereby define the number of targeted cells for gene alteration by transducing a few cells for cancer initiation and many cells for gene therapy. Through surgery-based injection in the anterior lobe, distal from the urinary track, the tumor in this model can expand without impairing the urinary function of the animal. Furthermore, by targeting only a subset of prostate epithelial cells the technique enables clonal expansion of the tumor, and therefore mimics human tumor initiation, progression, as well as invasion through the basal membrane.
This novel technique provides a powerful prostate cancer model with improved physiological relevance. Animal suffering is limited, and since no additional breeding is required, overall animal count is reduced. At the same time, analysis of new candidate genes and pathways is accelerated, which in turn is more cost efficient.

This protocol describes a newly established method for virus delivery to the murine prostate. Using either CRISPR/Cas9 technology, gene overexpression, or Cre recombinase delivery, the technique allows orthotopic alteration of gene expression and implements a novel mouse model for prostate cancer.

Consegna di virus di CRISPR guide alla prostata per alterazione del Gene murina

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. While 75% of bladder cancers are non-invasive and unlikely to metastasize, about 25% progress to an invasive growth pattern. Up to half of the patients with invasive cancers will develop lethal metastatic relapse. Thus, understanding the mechanism of invasive progression in bladder cancer is crucial to predict patient outcomes and prevent lethal metastases. In this article, we present a three-dimensional cancer invasion model which allows incorporation of tumor cells and stromal components to mimic in vivo conditions occurring in the bladder tumor microenvironment. This model provides the opportunity to observe the invasive process in real time using time-lapse imaging, interrogate the molecular pathways involved using confocal immunofluorescent imaging and screen compounds with the potential to block invasion. While this protocol focuses on bladder cancer, it is likely that similar methods could be used to examine invasion and motility in other tumor types as well.

The processes governing bladder cancer invasion represent opportunities for biomarker and therapeutic development. Here we present a bladder cancer invasion model which incorporates 3-D culture of tumor spheroids, time-lapse imaging and confocal microscopy. This technique is useful for defining the features of the invasive process and for screening therapeutic agents.

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Valutazione della capacità di differenziazione delle cellule epiteliali della prostata del topo utilizzando la cultura organoide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...