We thank those individuals and groups who have used SpikeSorter and who have provided requests for file format support and suggestions and feedback on how to improve it. These include Youping Xiao, Felix Fung, Artak Khachatryan, Eric Kuebler, Curtis Baker, Amol Gharat and Dongsheng Xiao. We thank Adrien Peyrache for the false positive and negative figures given in 'Representative Results'.

<ol>
	<li>Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles.">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).</li><li>Blanche, T. J., Spacek, M. A., Hetke, J. F., Swindale, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polytrodes:+High+Density+Silicon+Electrode+Arrays+for+Large+Scale+Multiunit+Recording.">Polytrodes: High Density Silicon Electrode Arrays for Large Scale Multiunit Recording.</a> J. Neurophys. 93, 2987-3000 (2005).</li><li>Lewicki, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+methods+for+spike+sorting:+the+detection+and+classi&#64257;cation+of+neuronal+action+potentials.">A review of methods for spike sorting: the detection and classi&#64257;cation of neuronal action potentials.</a> Network. 9, R53-R78 (1998).</li><li>Letelier, J. C., Weber, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+sorting+based+on+discrete+wavelet+transform+coefficients.">Spike sorting based on discrete wavelet transform coefficients.</a> J. Neurosci. Methods. 101, 93-106 (2000).</li><li>Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unsupervised+spike+detection+and+sorting+with+wavelets+and+superparamagnetic+clustering.">Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering.</a> Neural Computation. 16, 1661-1687 (2004).</li><li>Franke, F., Natora, M., Boucsein, C., Munk, M., Obermayer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+online+spike+detection+and+spike+classi&#64257;cation+algorithm+capable+of+instantaneous+resolution+of+overlapping+spikes.">An online spike detection and spike classi&#64257;cation algorithm capable of instantaneous resolution of overlapping spikes.</a> J. Comput. Neurosci. 29, 127-148 (2010).</li><li>J&#228;ckel, D., Frey, U., Fiscella, M., Franke, F., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+independent+component+analysis+on+high-density+microelectrode+array+recordings.">Applicability of independent component analysis on high-density microelectrode array recordings.</a> J. Neurophysiol. 108, 334-348 (2012).</li><li>Rossant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+sorting+for+large,+dense+electrode+arrays.">Spike sorting for large, dense electrode arrays.</a> Nature Neuroscience. 19, 634-641 (2016).</li><li>Vandecasteele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+recording+of+neurons+by+movable+silicon+probes+in+behaving+rodents.">Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents.</a> JoVE. (61), e3568 (2012).</li><li>Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+large-scale+neuronal+ensembles+with+silicon+probes+in+the+anesthetized+rat.">Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat.</a> JoVE. (56), e3282 (2011).</li><li>Swindale, N. V., Spacek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+sorting+for+polytrodes:+a+divide+and+conquer+approach.">Spike sorting for polytrodes: a divide and conquer approach.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 8, 1-21 (2014).</li><li>Swindale, N. V., Spacek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+detection+methods+for+polytrodes+and+high+density+microelectrode+arrays.">Spike detection methods for polytrodes and high density microelectrode arrays.</a> J. Comput. Neurosci. 38, 249-261 (2015).</li><li>Swindale, N. V., Spacek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Veri&#64257;cation+of+multichannel+electrode+array+integrity+by+use+of+cross-channel+correlations.">Veri&#64257;cation of multichannel electrode array integrity by use of cross-channel correlations.</a> J. Neurosci. Meth. 263, 95-102 (2016).</li><li>Fukunaga, K., Hostetler, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+gradient+of+a+density+function,+with+applications+in+pattern+recognition.">The estimation of the gradient of a density function, with applications in pattern recognition.</a> IEEE Transactions on Information Theory (IEEE). 21, 32-40 (1975).</li><li>Mitelut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+spike+sorting:+an+in+vitro,+in+silico+and+in+vivo+study+to+develop+quantitative+metrics+for+sorting+extracellularly+recorded+spiking+activity.">Standardizing spike sorting: an in vitro, in silico and in vivo study to develop quantitative metrics for sorting extracellularly recorded spiking activity.</a> Soc. Neurosci. Abstr. 598 (10), (2015).</li><li>Hazan, L., Zugaro, M., Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klusters,+NeuroScope,+NDManager:+A+free+software+suite+for+neurophysiological+data+processing+and+visualization.">Klusters, NeuroScope, NDManager: A free software suite for neurophysiological data processing and visualization.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 207-216 (2006).</li><li>Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+tetrode+spike+separation+as+determined+by+simultaneous+intracellular+and+extracellular+measurements.">Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements.</a> J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Buzs&#225;ki, G., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+and+activity+dependent+extracellular+correlates+of+intracellular+spiking.">Cell-type and activity dependent extracellular correlates of intracellular spiking.</a> J. Neurophysiol. 114, 608-623 (2015).</li><li>Wohrer, A., Humphries, M. D., Machens, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-wide+distributions+of+neural+activity+during+perceptual+decision-making.">Population-wide distributions of neural activity during perceptual decision-making.</a> Prog. Neurobiol. 103, 156-193 (2013).</li><li>Mizuseki, K., Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconfigured,+skewed+distribution+of+firing+rates+in+the+hippocampus+and+entorhinal+cortex.">Preconfigured, skewed distribution of firing rates in the hippocampus and entorhinal cortex.</a> Cell Reports. 4, 1010-1021 (2013).</li><li>Schmitzer-Torbert, N., Jackson, J., Henze, D., Harris, K., Redish, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measures+of+cluster+quality+for+use+in+extracellular+recordings.">Quantitative measures of cluster quality for use in extracellular recordings.</a> Neuroscience. 131, 1-11 (2005).</li><li>Barnett, A. H., Magland, J. F., Greengard, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+neural+spike+sorting+algorithms+without+ground-truth+information.">Validation of neural spike sorting algorithms without ground-truth information.</a> J. Neurosci. Meth. 264, 65-77 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Formati di file Attualmente i formati di file supportati includono Neuralynx (.ntt e .ncs), Plexon (.PLX), Neuroscope (.xml + dat), sistemi multicanale (.mcd), Blackrock (.nev) e Intan (.rhd). Per i formati non supportati, ci sono due opzioni. Uno è quello di richiedere aggiunta del formato di file per una prossima release (un collegamento e-mail allo sviluppatore è previsto nella &#39;Guida - Informazioni su&#39; finestra di dialogo). L&#39;altro è quello di convertire il file in un formato supportato. Un&#39;opzione semplice è quella di utilizzare il tempo-spike-formato &#39;.tsf&#39;. Questo formato ossa nude contiene il record di tensione e di canale dati di localizzazione più la registrazione di eventi e del canale e le assegnazioni dei cluster seguenti ordinamento. La lettura di questi file è spesso più veloce rispetto ad altri formati. Indipendentemente trattare con formati non supportati può essere conveniente per salvare i dati filtrati in un file .tsf (questo formato è compresa tra le opzioni di esportazione) poiché questo evitare la necessità di successiva fil tempotraggio. Dettagli del formato .tsf sono inclusi nella documentazione fornita con il programma. file ausiliari Due file ausiliari vengono utilizzati per memorizzare i parametri, ss_prefs.sav e ss_parameters.sav. Il file &#39;ss_prefs.sav&#39; salva solo valori definiti dall&#39;utente scelta che non hanno effetto diretto sulla selezione e hanno meno probabilità di avere bisogno di cambiare, ad esempio, le dimensioni delle finestre e le posizioni, di tensione e di altri valori di scala. Se ss_prefs.sav non esiste, viene creato quando si preme il pulsante &#39;Applica&#39; nella finestra di dialogo relativa, o quando il programma viene chiuso. Se l&#39;opzione &#39;parametri&#39; appiccicoso in questo file è impostato, un file &#39;ss_parameters.sav&#39; separata viene utilizzata per memorizzare i valori e le opzioni che influenzano l&#39;esito della selezione così come molte opzioni di visualizzazione dei parametri selezionabili dall&#39;utente. Questo file viene salvato, o aggiornato, quando il programma viene chiuso tramite il normale &#39;File - Exit&#39; percorso (ma non quando il programma &#39;Chiudi&#39;il pulsante (in alto a destra) è utilizzato). In assenza di questo file all&#39;avvio, vengono utilizzati i valori di default. Limiti di programma Il limite alla lunghezza della registrazione che può essere ordinata è determinata dalla quantità di RAM nel computer. Un PC con 16 GB di RAM può generalmente gestire file raw fino a 13 GB-14 Gb (2 GB inferiore alla RAM totale) se la memoria non è in uso per altri scopi. Altri limiti, ad esempio il numero massimo di canali, dimensioni massime dei cluster, ecc possono variare con la versione del programma e gli aggiornamenti futuri. Essi possono essere visualizzati da andando a &#39;Help - riguardo&#39;. Caratteristiche aggiuntive The View, finestra pulite e split cluster offre diverse opzioni per la definizione dei confini manuale a grappolo. Essi comprendono l&#39;uso del mouse per disegnare un ellisse nella finestra di visualizzazione del PC, per disegnare un rettangolo di ampiezza PP (o PC1 o PC2) vs. visualizzazione del tempo, e disegnare discriminat<html> finestre di ioni nel display della forma d&#39;onda principale. Questi possono essere tutti utilizzati per creare sottocluster (qualsiasi subclustering esistente verrà sovrascritto). La finestra di dialogo deve essere uscito prima di qualsiasi di questi oggetti si possono trarre. Premendo il tasto relativo nella finestra di dialogo ( &#39;Windows&#39;, &#39;Ellisse&#39; o &#39;rettangolo&#39;) crea il subcluster. Una finestra di strategia (Sort - Strategy) mostra una varietà di smistamento parametri che sono meno probabilità di bisogno di essere cambiato, ma che può avere un effetto significativo sulla selezione. Questi includono, per esempio, i parametri che determinano l&#39;assegnazione dei canali ai cluster e la selezione dei punti di tempo che contribuiscono al calcolo delle componenti principali per ogni cluster. La finestra di gestione dei cluster offre informazioni più dettagliate sui cluster individuali di quello previsto dalla vista, pulito e dialogo cluster dividere, o dalla finestra di dialogo di post-elaborazione. Ci sono anche più svariate opzioni per l&#39;eliminazione di cluster. ontent &quot;&gt; I canali sono visualizzati in un particolare ordine verticale, definito il &#39;ordinamento&#39;, nella finestra di visualizzazione della tensione. Idealmente questo ordine verrà riflette la vicinanza fisica dei canali, ma questo può essere difficile da raggiungere dato che il layout attuale è in due dimensioni. l&#39;ordinamento viene generato calcolando la proiezione delle posizioni dei canali su una linea con un certo angolo rispetto alla asse y. la sequenza dei numeri di canale sulla linea è l&#39;ordinamento. Questo è calcolato automaticamente in molti casi ma è possibile generare una diversa andando a &#39;Vista - proprietà acquisizione&#39;.. la possibilità di visualizzare i canali in ordine numerico è prevista anche noti che l&#39;ordine di visualizzazione non ha effetto sulla ordinamento. altri approcci Esistono altri pacchetti software per fare spike sorting. Questi includono programmi commerciali quali Offline Sorter (http://www.plexon.com/products/offline-sorter), come well software libero, come MClust (AD Redish: http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html), Klustakwik (KD Harris: https://sourceforge.net/projects/klustakwik/), Wave_clus (RQ Quiroga: http://www2.le.ac.uk/departments/engineering/research/bioengineering/neuroengineering-lab/spike-sorting) ei programmi Neuroscope e Klusters (http: //. neurosuite) 16. Un confronto dettagliato con questi programmi, molti dei quali sono di uso comune, non rientra nell&#39;ambito del presente documento. Tale confronto comporterebbe una serie di criteri relativi, tra cui la facilità d&#39;uso, affidabilità, supporto del formato file, la progettazione grafica, la documentazione, grado di automazione, la dipendenza da componenti hardware e software, la velocità di elaborazione, adattabilità al MEA così come tetrodi, e, nella misura in cui è possibile misurare, la precisione di smistamento. In assenza di un confronto dettagliato, crediamo che SpikeSorter offre una combinazione di opzioni e supporto per picco sortaING che potrebbe non essere disponibile in qualsiasi altro pacchetto di ordinamento autonomo picco attualmente disponibili. Qualità Ordinamento Come accennato in precedenza, le misure oggettive di esito che possono essere utilizzati per decidere se una procedura o scelta è migliore di un altro sono in gran parte carenti. La dipendenza dai parametri e la necessità di input dell&#39;utente frequente rende anche improbabile che qualsiasi tipo particolare potrà mai essere riprodotto. Questo di per sé potrebbe limitare l&#39;uso di misure di outcome, se esistessero. A peggiorare le cose, non è affatto certo che precisa picco ordinamento è possibile anche in linea di principio. Registrazioni extracellulari accoppiato con registrazioni intracellulari di interesse: singole cellule esistono 17, 18 ma intracellulari registrazioni da coppie vicine di neuroni sono necessari per dimostrare che i segnali provenienti da cellule vicine possono sempre essere distinti. I fattori che possono causare segnali di tensione extracellulari da unadata neurone di variare per periodi di tempo, sia a breve che a lungo, sono poco compreso che in pratica può aggiungere considerevole variabilità (ad esempio le figure 8 e 10) che complica l&#39;ordinamento. Per spike classificare essere un problema risolvibile queste modifiche devono essere più piccole, o di natura diversa, rispetto alle piccole differenze che possono verificarsi tra le cellule come risultato di differenze posizionali. Basandosi sulle misure numeriche di qualità cluster potrebbe anche essere problematico. Ad esempio, le cellule possono sparare a tassi che differiscono da ordini di grandezza 19, 20. L&#39;inclusione di quasi tutte le punte da una cellula scarsa gittata tra quelle di una cella alto tasso di fuoco può avere un impatto su una qualsiasi misura di qualità cluster, nascondendo il fatto che la qualità di ordinamento della cellula basso tasso sarebbe povero o non esistente. Alla luce di queste sfide, i metodi per la valutazione della qualità di ordinamento basati su cluster di sovrapposizione8, 21 o l&#39;ordinamento stabilità a fronte del parametro di variazione 22 può dare un falso senso di sicurezza. Invece, suggeriamo che potrebbe essere necessario accettare il fatto che l&#39;ordinamento picco si basa sulla scienza incompleta. Selezionatrici possono avere a vivere con un senso di imperfezione e di imparare che può essere meglio di dedicare il tempo a forme più produttive di analisi dei dati, piuttosto che continuamente cercare di migliorare la qualità di una sorta.

Chiunque registra segnali extracellulari dal cervello utilizzando metodi più sofisticati di soglia semplice on-line e finestre fronte al compito di identificare e separare i segnali dei vari neuroni dai segnali di tensione rumorosi registrati dall&#39;elettrodo. Questo compito è comunemente noto come picco di smistamento. La difficoltà di picco ordinamento è aggravato da vari fattori. I neuroni possono essere molto vicini tra loro in modo che i segnali registrati dai loro da un elettrodo area sono probabilmente simili e difficili da distinguere. I segnali prodotti da un singolo neurone possono variare nel tempo, forse a causa di movimenti dell&#39;elettrodo, cinetiche sodio canale variabili nei periodi di alta velocità di fuoco, gradi variabili di attivazione di conduttanze tensione in dendriti che sono vicino all&#39;elettrodo, o possibilmente come a seguito di cambiamenti di stato cerebrale. Questi problemi possono essere mitigati mediante matrici multi-elettrodo (MEA) con molte ravvicinate (20 - 100 micron) r<html> ecording canali che permette una migliore definizione spaziale dei segnali dai singoli neuroni in quanto sono tipicamente distribuite su più canali 1, 2. Tuttavia, ciò, unito al fatto che i segnali dai neuroni sviluppa per tutta la lunghezza della sovrapposizione dell&#39;elettrodo nello spazio, si traduce in uno spazio tridimensionale potenzialmente molto alto entro cui cluster corrispondente neuroni unici devono essere identificate. Questo problema diventa computazionalmente intrattabile per più di un piccolo numero di canali di elettrodi. Ad oggi, non vi è generalmente concordato-upon metodo migliore per Spike ordinamento, anche se molte soluzioni sono state proposte 3, 4, 5, 6, 7, 8 e registrazioni da MEA stanno diventando sempre più comuni 9,ass = &quot;xref&quot;&gt; 10. Perché Spike ordinamento non è fine a se stessa, ma è semplicemente un passaggio preliminare necessario prima di ulteriori analisi dei dati, vi è la necessità per un pacchetto facilmente fruibile che leggerà in file di dati di registrazione prima e convertirli in treni di impulsi ordinate con il poco utente ingresso, e come rapido e affidabile, come possibile. Questo documento fornisce un tutorial per l&#39;utilizzo di SpikeSorter - un programma sviluppato con l&#39;obiettivo di soddisfare queste esigenze. Il programma si basa su algoritmi descritti in documenti pubblicati in precedenza 11, 12, 13. Gli obiettivi nella progettazione del programma erano che a) si dovrebbe avere una interfaccia user-friendly che richiede poca o nessuna conoscenza preventiva di programmazione di computer o di picco di smistamento metodologia; b) devono essere necessari pochi o nessun altri componenti software specializzati al di là di sistemi operativi standard di Windows o Linux; c </em&gt;) Una vasta gamma di formati di dati di registrazione per l&#39;importazione e l&#39;esportazione dei dati dovrebbe essere sostenuta; d) la necessità di input da parte dell&#39;utente durante l&#39;ordinamento deve essere ridotto al minimo, ed e) l&#39;ordinamento tempi dovrebbero scalare in modo ragionevole, idealmente linearmente, con la durata della registrazione e il numero di canali dell&#39;elettrodo. Gli algoritmi implementati nel programma comprendono a) un insieme flessibile di strategie di pre-elaborazione e di rilevamento degli eventi; b) una divisione automatizzata e la strategia di conquista di riduzione dimensione che raggruppa le forme d&#39;onda di tensione in base ai componenti principali (PC) distribuzioni ottenute da sottoinsiemi di canali assegnati a gruppi specifici; c) il clustering automatico delle distribuzioni PC con una procedura rapida di clustering basate sull&#39;algoritmo media-shift 3, 14, e d) fusione parzialmente automatizzato a due a due e la divisione dei cluster per assicurare che ciascuno è distinto il più possibile da tutti gli altri. This, è stato aggiunto un insieme di procedure che permettono la scissione o la fusione manuale di cluster basati su ispezione di distribuzioni PC, cross e auto-correlogrammi di treni di impulsi e trame tempo ampiezza di forme d&#39;onda picco. Le registrazioni da tetrodi, array, array tetrodo Utah così come MEA-gambo multiuso e possono essere letti e ordinati. Il limite di corrente del numero di canali è 256 ma questo può essere aumentato in futuro. Un&#39;altra implementazione open-source cross-platform, &quot;spyke&quot; (http://spyke.github.io), è inoltre disponibile. Scritto da uno di noi (MS) in Python e Cython, spyke utilizza lo stesso approccio globale come SpikeSorter, con alcune differenze: per ridurre le richieste di memoria, dati grezzi viene caricato in piccoli blocchi, e solo quando è assolutamente necessario; cluster sono esclusivamente visualizzati, manipolati, e ordinati in 3D; e delle componenti principali e analisi delle componenti indipendenti sono entrambi usati come metodi di riduzione dimensione complementare. Spyke richiede più utenti ininterazione, ma si basa molto sulla tastiera e scorciatoie da mouse e una coda di undo / redo per esplorare rapidamente gli effetti di vari fattori sul raggruppamento di un dato sottoinsieme di punte. Questi fattori includono canale di picco e la selezione intervallo di tempo, l&#39;allineamento picco, le dimensioni di clustering e larghezza di banda spaziale (Sigma) 11. Quanto segue è una breve descrizione degli algoritmi e le strategie utilizzate per l&#39;ordinamento. Più descrizioni complete possono essere trovati in precedenti pubblicazioni 11, 12, 13 e nelle annotazioni che possono essere accessibili tramite pulsanti di aiuto (identificato con un &#39;?&#39;) Entro SpikeSorter. Dopo aver caricato un file di tensione extracellulare crudo e filtrando le componenti a frequenza inferiore, una fase iniziale dei risultati del rilevamento evento in un insieme di eventi, ciascuno dei quali è costituito da una breve un&#39;istantanea tensione prima e dopo il tempo dell&#39;evento. Se gli elettisiti ha guidato sono sufficientemente ravvicinati (&lt;100 micron), i segnali di unità singole appare generalmente su più canali vicini. Un canale centrale viene scelto automaticamente per ogni evento, corrispondente al canale sul quale la tensione di picco-picco dell&#39;evento è grande. Automated classificare inizia formando un unico cluster iniziale per ogni canale elettrodo, costituito da tutti gli eventi che sono stati localizzati a quel canale. Un&#39;unità a metà strada tra i canali può dar luogo a picchi che sono localizzate (forse casualmente) per canali diversi: i cluster di queste due serie di picchi saranno identificati come simili e uniti in una fase successiva. La forma d&#39;onda media degli eventi in ogni cluster iniziale viene quindi calcolato. Questo è indicato come modello di cluster. canali ausiliari sono assegnati a ciascun cluster sulla base delle ampiezze e deviazione standard delle forme d&#39;onda modello su ciascun canale. I valori delle componenti principali vengono calcolati per ogni o cluster basato sun le forme d&#39;onda sul set assegnato di canali. L&#39;utente può scegliere il numero di dimensioni dei componenti principali d&#39;uso: di solito 2 è sufficiente. Ciascun cluster viene quindi diviso in un ulteriore insieme di cluster, e questo viene ripetuto fino nessuno può essere ulteriormente divisa dal raggruppamento automatizzato. A questo punto, una prima serie di esempio, 64 cluster da un elettrodo 64 canali, possono essere suddivisi in due o tre volte quel numero, a seconda del numero di unità che era presente nella registrazione. Ma a causa della assegnazione della variabile di eventi da singole unità a canali diversi, il numero di cluster trovato in questa fase è quasi certamente più grande di quanto dovrebbe essere. La prossima fase di ordinamento è quello di correggere la oversplitting confrontando coppie di cluster e la fusione coppie simili o riassegnazione eventi da uno all&#39;altro. Questa fase di ordinamento è indicato come &#39;unire e dividere&#39;. Fusione e scissione Per N cluster, vi sono N * (N -1) / 2 coppie e quindi il numero di coppie cresce come N 2, che è indesiderabile. Tuttavia, molte coppie possono essere esclusi dal confronto perché i due membri della coppia sono fisicamente distanti. Questo riduce la dipendenza da qualcosa che è più linearmente correlato al numero di canali. A dispetto di questa scorciatoia, l&#39;unione e la fase di spaccatura può ancora essere abbastanza tempo. Esso funziona nel seguente modo. Ogni coppia di cluster che è quello di essere paragonata (quelli che sono fisicamente vicini tra loro, come giudicato dalla sovrapposizione nei set di canali assegnati a ciascun) è fusa temporaneamente, pur mantenendo le identità dei picchi nei due cluster membri noti. Le principali componenti della coppia fusione vengono calcolati. Una misura della sovrapposizione tra i punti nei due cluster viene calcolato in base alla distribuzione dei primi due componenti principali. Il modo in cui il ov<html> misura ERLAP è calcolato è descritto in dettaglio altrove 11. Il suo valore è zero se il cluster non si sovrappongono affatto, cioè il vicino più prossimo di ciascun punto è nello stesso cluster. Il suo valore è vicino a 1 se i cluster sovrappongono completamente, cioè la probabilità del vicino più vicino essendo nello stesso cluster è lo stesso di quello previsto da una miscelazione uniforme dei punti. Diverse decisioni sono prese, che prende la misura di sovrapposizione in considerazione. Se la sovrapposizione è maggiore di un certo valore, cluster possono essere unite. Se la sovrapposizione è molto piccola, la coppia cluster potrebbe essere definito come distinto e lasciato solo. I valori intermedi, indicando incompleta separazione della coppia di cluster, potrebbero segnalare che la coppia dovrebbe essere fusa e poi ri-split, il risultato desiderato di essere una coppia di ammassi con meno sovrapposizioni. Queste procedure sono eseguite prima in una fase automatizzata e quindi in una fase guidata manualmente. tenda &quot;&gt; Nella fase automatizzata, le coppie di cluster con un alto valore di sovrapposizione sono fusi;. poi le coppie di cluster con intermedio a bassi valori di sovrapposizione vengono uniti e re-split Nella seconda, fase user-guidato, l&#39;utente si presenta con tutte le restante coppie di cluster ambigue (cioè quelli con i valori di sovrapposizione in un range intermedio definito) in sequenza e viene chiesto di scegliere se a) per unire la coppia, b) si fondono e resplit la coppia, c) di dichiarare la coppia di essere distinti (che sovrascriverà il significato della misura di sovrapposizione), oppure d) per definire la relazione tra la coppia come &#39;ambiguo&#39; indicando che i picchi di coppia è improbabile che siano ben ordinati. sono forniti diversi strumenti per aiutare con queste decisioni, tra cui auto - e cross-correlogrammi e trame serie temporali di altezza picco e dei valori PC. Idealmente, al termine delle fasi di unire e dividere ogni cluster dovrebbe essere distinto da tutti gli altri,sia perché ha pochi o nessun canale in comune con altri raggruppamenti, o perché l&#39;indice sovrapposizione è inferiore ad un valore definito. Questo valore è selezionabile dall&#39;utente, ma è tipicamente 0.1. Cluster (unità) che passano questo test sono definiti come &#39;stabile&#39;, quelli che non (perché la sovrapposizione con uno o più altri cluster è maggiore della soglia) sono definiti come &#39;unstable&#39;. In pratica, la maggior parte delle unità finiscono per essere definito come &#39;stabile&#39; al traguardo di smistamento, lasciando il resto sia di essere scartato o trattata come potenzialmente più unità. Requisiti software SpikeSorter è compatibile con le versioni a 64 bit di Windows 7 e di Windows 10, ed è stato anche eseguito con successo sotto Linux usando l&#39;emulatore Wine. I file di dati vengono caricati completamente in memoria (velocità) così disponibili RAM deve scalare con la dimensione della registrazione (lasciare circa 2 GB per il programma stesso). elettrofisiologicoAl file di dati più grandi di 130 GB di dimensione sono stati ordinati con successo in entrambi gli ambienti Windows e Linux. Le opzioni sono accessibili tramite i menu standard di Windows, una barra degli strumenti e le finestre di dialogo. Il layout delle voci del menu corrisponde grosso modo l&#39;ordine delle operazioni in selezione, a partire dal menu &#39;File&#39; sulla sinistra per l&#39;input dei dati e il menu &#39;Export&#39; sulla destra che permette per l&#39;esportazione di dati ordinati. pulsanti della barra degli strumenti forniscono scorciatoie per utilizzati comunemente voci di menu. Il file di configurazione del canale Molti formati di dati di registrazione non memorizzano posizioni di canale. Tuttavia, conoscendo questi è essenziale per il picco di smistamento. I canali possono anche essere numerati in vari modi di software di acquisizione: SpikeSorter richiede che i canali sono numerati in sequenza, a cominciare con il canale 1. Quindi, un file di configurazione degli elettrodi accessoria deve essere creato in grado di rimappare i numeri dei canali di seguire la regola sequenziale, e per loc canale di negoziozioni. Il file di configurazione del canale è un file di testo con una sola fila di testo per ogni canale. La prima riga del file memorizza un nome di testo, fino a 16 caratteri, che identifica l&#39;elettrodo. I numeri in righe successive possono essere separati da tabulazioni, una virgola o spazi. Ci sono quattro numeri in ogni riga che forniscono (in ordine): il numero del canale nel file, il numero del canale a cui deve essere mappato (cioè il numero che verrà utilizzato da SpikeSorter), e le coordinate x e y del canale, in micron. La coordinata x normalmente essere preso come perpendicolare alla direzione di inserimento dell&#39;elettrodo e la coordinata y conseguenza sarebbe profondità nel tessuto. Il file di configurazione deve essere posizionato nella stessa directory del file di registrazione. Vi è una certa flessibilità nel modo in cui esso può essere nominato. Il programma prima cercare un file che ha lo stesso nome del file di dati grezzi, ma con estensione .cfg. Se il file ios non trovato, si cercherà il file &#39;electrode.cfg&#39;. Se il file a sua volta, non è stato trovato viene generato un messaggio di errore per indicare una mancanza di informazioni sul layout del canale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td class="xl63" height="21" style="height:15.75pt;width:162pt" width="216">spikesorter.exe</td>
			<td class="xl63" style="width:53pt" width="71">N/A</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl64" style="width:125pt" width="167">program file currently available through invited dropbox link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a visual guide to sorting electrophysiological recordings using 'spikesorter'

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be user friendly with a graphical user interface, able to read data files in a variety of formats, and provide users with a flexible set of tools giving them the ability to detect and sort extracellular voltage waveforms from different units with some degree of reliability. Previously published spike sorting methods are now available in a software program, SpikeSorter, intended to provide electrophysiologists with a complete set of tools for sorting, starting from raw recorded data file and ending with the export of sorted spikes times. Procedures are automated to the extent this is currently possible. The article explains and illustrates the use of the program. A representative data file is opened, extracellular traces are filtered, events are detected and then clustered. A number of problems that commonly occur during sorting are illustrated, including the artefactual over-splitting of units due to the tendency of some units to fire spikes in pairs where the second spike is significantly smaller than the first, and over-splitting caused by slow variation in spike height over time encountered in some units. The accuracy of SpikeSorter's performance has been tested with surrogate ground truth data and found to be comparable to that of other algorithms in current development.

Figura 7 mostra il display (ottenuto andando &#39;Vista - forme d&#39;onda Ordinati&#39;) per una tipica registrazione ordinato. L&#39;opzione di visualizzazione predefinita è solo per mostrare le forme d&#39;onda sul canale centrale per ogni cluster. Un&#39;esperienza comune è che le forme d&#39;onda per un paio di cluster sullo stesso canale sembrano identici, ma quando il &#39;Confronto coppie&#39; dialogo è usato per esaminare i due cluster sono gruppi distinti nella proiezione del PC, il più delle volte derivanti da differenze di forma d&#39;onda sui canali adiacenti . Ciò vale, ad esempio, delle forme d&#39;onda di canale 62 in Figura 7. Come notato sopra, non è raro trovare coppie di cluster in cui le decisioni di fusione deve essere basato su appezzamenti di ampiezza-time e on cross-correlogrammi. La figura 8 mostra un esempio di una decisione fusione basata in parte sulla croce correlogramma. Una molto forte, asymmetric correlazione incrociata a brevi intervalli di tempo (Figura 8B) accoppiato con una differenza di altezza di picco-picco di unità e rosate simili (figura 8E) suggerisce fortemente che i picchi provengono dallo stesso neurone. Figura 9 mostra un caso in cui lo stesso tipo di prova per fusione è carente. Qui, il cross-correlogramma è debole e non fortemente asimmetrica. Inoltre, le forme delle autocorrelograms dei due gruppi sono differenti (Figura 9A). Probabilmente, le due unità non dovrebbero essere unite a causa della differenza chiara supplementare nelle distribuzioni dei componenti principali (Figura 9C). La figura 10 mostra un caso in cui le altezze PP di due unità fondono allo stesso tempo che uno di loro ferma cottura e le altre riprende. In questo caso la decisione di fusione sembra corretto, anche se non si può escludere la possibilità che le unità coordinano loro modelli di cottura inmodi complessi e che la somiglianza nelle altezze è casuale. Questi esempi illustrano la difficoltà di offrire una guida ferma su come prendere decisioni di fusione. A questo si aggiunge la generale mancanza di misure oggettive per valutare la qualità complessiva del picco di smistamento e gli effetti delle variazioni dei parametri. Questo è a causa della mancanza di informazioni verità a terra, che per spike sorting, consisterebbe di registrazioni intracellulari (o loro equivalenti) di ogni neurone che era abbastanza vicino a un elettrodo di registrazione per dare luogo a segnali extracellulari rilevabili. Nonostante questo limite, ci sono surrogati per i dati di verità a terra e non è irragionevole supporre che un cambiamento di strategia di ordinamento che si traduce in una migliore performance sui dati surrogati porterà a migliori prestazioni con i dati reali. I surrogati sono dati reali MEA registrazione in cui picchi, presi dalla registrazione, vengono aggiunti nuovamente dentro il recording in tempi noti su diversi canali, dove non possono essere confusi con le punte originali. Tale test ha costituito la base di un concorso di smistamento picco organizzato da G. Buzsáki e T. Harris presso Janelia Farm nel 2013. dati surrogati sono stati generati dalle registrazioni effettuate nel talamo o ippocampo di ratti liberi di muoversi (A. Peyrache, A. Berenyi e G. Buzsáki, dati non pubblicati). segnali spike per la quale non vi era &#39;verità a terra&#39; sono stati generati prendendo picchi da una unità registrata su un gambo e aggiungendoli alla registrazione su un altro gambo in modo da garantire che il rapporto di quel treno picco con l&#39;attività di fondo e stati cerebrali è stata preservata. Registrazioni contenevano attività spiking effettiva in aggiunta al terreno treni verità spike aggiunti. I tassi di falsi positivi per SpikeSorter erano 0,26% e il 0,01% per due diverse serie di test, mentre i corrispondenti tassi di falsi negativi erano il 2,1% e il 0,37% (A. Peyrache, comunicazione personale). Questi tassi sono stati tra tegli meglio della concorrenza, ma soprattutto si sono bassi e probabilmente accettabile per la maggior parte dei tipi di analisi neurofisiologica. Un altro approccio è quello di utilizzare su larga scala simulazioni biofisici altamente dettagliate di reti di neuroni di generare registrazioni extracellulari simulati da disegni MEA specificati. I ricercatori attualmente lavorando su metodi di ordinamento MEA sono stati invitati a ordinare simulazioni di test di questa natura 15. sono stati confrontati cinque diversi algoritmi di ordinamento. Ci sono vari modi di valutazione delle prestazioni di smistamento e le prestazioni dei diversi gruppi variava secondo cui le misure sono state utilizzate, con nessun gruppo essendo ovviamente meglio di qualsiasi altro. I risultati di SpikeSorter è caduto all&#39;interno della gamma di risultati ottenuti dai vari gruppi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig1.jpg" /> Figura 1. Il rilevamento di dialogo Event. Questo proopzioni VIDES per la selezione del metodo di misurazione del rumore, per i canali di mascheramento, l&#39;impostazione dei valori thresholding e metodi di applicazione di loro, e per la scelta di metodi per evitare la duplicazione degli eventi. In questo e in altri dialoghi, le informazioni sulle scelte è fornita da pulsanti identificati da punti interrogativi ( &#39;?&#39;). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig2.jpg" /> Figura 2. The View, pulito e Dialog Spalato. Questo fornisce opzioni per la visualizzazione delle forme d&#39;onda a grappolo, l&#39;identificazione e l&#39;eliminazione di forme d&#39;onda periferiche, per suddividere i cluster in una o più sottocluster, e per la cancellazione o la formazione di nuovi cluster dalle sottocluster. Sottocluster sono identificate dai colori indicati. (Questi possono essere modificate nella finestra delle preferenze.) <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig3.jpg" /> Figura 3. </sTrong&gt; Effetto dell&#39;allineamento dei eventi a una funzione inaffidabile. La figura mostra i dati da un singolo cluster basato sul canale, definito come l&#39;insieme di eventi la cui forma d&#39;onda tensioni di picco-picco era più grande su un particolare canale. Pannello A mostra un sottoinsieme di 50 forme d&#39;onda degli eventi da questo cluster, overplotted, su diversi canali elettrodi. numeri di canale sono mostrati in alto a sinistra di ogni serie di forme d&#39;onda. I punti neri accanto a un numero di canale indicano che il canale è stato assegnato a quel particolare gruppo. I canali sono disposti nello stesso ordine spaziale che hanno sull&#39;elettrodo. assi orizzontali mostrano tempo e assi verticali, di tensione. La posizione orizzontale l&#39;asse verticale indica il punto di allineamento, cioè ogni evento è posizionato in modo suo punto di allineamento coincide con l&#39;asse. La barra di scala in basso a sinistra del pannello A mostra 0,5 ms e 100 mV. Le linee blu in A indicano la media di ogni serie di forme d&#39;onda (il modello).<html> Canale 24 (grigio) è mascherato. Eventi sono allineati al minimo locale più negativo della forma d&#39;onda (trogolo negativo) come determinato immediatamente successivo rilevamento di un evento. Pannello B mostra la distribuzione delle prime 2 componenti principali derivati da tutte le forme d&#39;onda del cluster. Tre sottocluster sono visibili in questa distribuzione. Pannello C mostra lo stesso insieme di eventi dopo allineandoli alla forma d&#39;onda modello. La distribuzione principale componenti (pannello D) ora mostra solo due sottocluster (quello identificato in rosso). Ulteriore esame risulta che un cluster spuria in B è stata causata dall&#39;allineamento di un sottoinsieme di eventi di un secondo canale negativo (più lento negativa dopo potenziale) che in alcuni casi è più negativa rispetto al primo. Alcuni di questi eventi non allineati sono visibili nel pannello A quanto forme d&#39;onda la cui forma non corrispondono al resto._blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig4.jpg" /> Figura 4. La finestra di dialogo ordinamento automatico. Questo fornisce opzioni di eventi di rilevamento, opzioni di clustering e le opzioni per la fusione automatica e la divisione delle coppie di cluster dopo la fase iniziale di clustering automatico. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig5.jpg" /> Figura 5. Le coppie di cluster Confronta dialogo. Questo fornisce opzioni per la scelta di coppie di cluster, misure di confronto (metodo match), la ricerca attraverso gli elenchi delle coppie ordinate dal valore di confronto, le opzioni per la visualizzazione correlogrammi, la visualizzazione dei grafici di altezza PP (o PC1 o PC2) in funzione del tempo, e la possibilità di unire le coppie. &gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig6.jpg" /> Figura 6. La finestra di dialogo di post-elaborazione. Questo fornisce opzioni per lo spostamento e / o l&#39;eliminazione di eventi duplicati, per l&#39;eliminazione di eventi possibilmente rumorosi, per reclustering eventi non clustered, per l&#39;eliminazione di cluster con un segnale basso di rumore (SNR) e per la rinumerazione (smistamento) cluster in base a criteri diversi. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig7.jpg" /> Figura 7. Visualizzazione delle unità Ordinati Showing a caso scelta, Overplotted forme d&#39;onda colorato secondo numero Cluster. Per chiarezza, è mostrata solo la forma d&#39;onda del canale centro di ciascun cluster. I dati (da Mitelut &amp; Murphy, non pubblicato) mostrano i minori di 14 canali di una registrazione elettrodi a 64 canali da topo corteccia visiva. annuncio / 55217 / 55217fig8.jpg &quot;/&gt; Figura 8. Esempio di prova che può essere esercitata su una decisione o meno per unire due cluster. I cluster confronta finestra di dialogo (Pannello A) è stato utilizzato per la ricerca di coppie di cluster con forme d&#39;onda simili, ignorando l&#39;ampiezza (dot-prodotto normalizzato partita metodo). Pannello B mostra autocorrelograms (AC) e il cross-correlogramma (CC) per i due gruppi, con due diverse larghezze Bin (0,2 e 2 ms). Questi mostrano che picchi del secondo gruppo (unità 53) hanno una forte tendenza a verificarsi 4 o 8 ms prima picchi nel primo (unità 28). Pannello C mostra le forme spike delle due unità e mostra che il secondo (mostrato in verde) presenta un picco più piccolo del primo anche. Pannello D mostra la distribuzione PC dei due gruppi. Pannello E PC1 grafici (asse verticale) delle due unità delle due unità (rispettivamente rosso e verde) vs. &lt;/ Em&gt; tempo (espresso in minuti) durante l&#39;intero periodo di registrazione. Vedere il testo per una descrizione più dettagliata. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55217/55217fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig9.jpg" /> Figura 9. Esempio di un paio cluster in cui c&#39;è molto meno prove per l&#39;unione. Pannello A mostra che i autocorrelograms (AC) e il cross-correlogramma (CC) per i due gruppi hanno forme diverse. Pannello B mostra la forma d&#39;onda modello mediati e deviazioni standard (ombreggiatura indica 1 unità SD) per mostrare le differenze di forma d&#39;onda più chiaramente. Pannello C mostra la distribuzione PC dei due gruppi. Pannello D rappresenta graficamente l&#39;altezza di picco-picco (asse verticale, mV) delle due unità in funzione del tempo durante thvia e tutto il periodo di registrazione. Vedere il testo per una descrizione più dettagliata. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55217/55217fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/55217/55217fig10.jpg" /> Figura 10. La prova per la fusione Sulla base di cottura Pattern e Componenti Principali Variation. Pannello A mostra le forme d&#39;onda dei due cluster (rosso e verde). Pannello B trame PC1 (asse verticale) in funzione del tempo (asse orizzontale) per i due cluster e mostra uno schema complementare di combustione con valori PC1 essendo simile al momento una unità ferma cottura e l&#39;altra comincia. Questo supporta una decisione di fondere nonostante la presenza di gruppi distinti nelle distribuzioni PC (pannello C).

Watch this Scientific Journal Video about A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using 'SpikeSorter' at JoVE.com

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using 'SpikeSorter'

The article shows how to use the program SpikeSorter to detect and sort spikes in extracellular recordings made with multi-electrode arrays.

Una guida visiva per Ordinamento elettrofisiologiche registrazioni con &#39;SpikeSorter&#39;

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be ...

a-visual-guide-to-sorting-electrophysiological-recordings-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Views.  University of British Columbia. The article shows how to use the program SpikeSorter to detect and sort spikes in extracellular recordings made with multi-electrode arrays.

Video: A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using 'SpikeSorter'

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

Le registrazioni elettrofisiologiche dal Percorso di Fiber Gigante D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Il Sistema swimmeret di gamberi: Una guida pratica per la dissezione del cavo di Nerve e extracellulari registrazioni del modello Motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.