This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

1. Preparativi per colture cellulari <ol><li> Acquisto commercialmente disponibili scorte di cellule umane. NOTA: Questo protocollo utilizza il carcinoma del colon-retto HCT116 e renali cellule primarie umane prossimali tubulari epiteliali (HRPTEC). </li><li> Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HCT116: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / medio alta di glucosio integrato con 7,5% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S). </li><li> Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HRPTEC: media delle cellule epiteliali integrato con il 5% FBS, 1% supplemento di crescita delle cellule epiteliali, e l&#39;1% P / S. </li><li> Preparare 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS): 140 mm NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mm KH 2 PO 4. Regolare il pH a 7,4 e sterilizzare in autoclave per 40 minuti a 121 ° C. </li></ol> 2. Apertura di Cell Coltura <ol><li> Con attenzione aspirare il medium da un piatto confluenti 80-90% senza disturbare tegli cellule. </li><li> Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l&#39;operazione per un secondo lavaggio 1x PBS. </li><li> Aliquota 3 ml di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico 0,05% (EDTA) in ogni piatto cultura e delicatamente in modo uniforme di roccia per rivestire le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti. </li><li> Trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 4000 xg per 90 sec. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di DMEM completo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare quanti apirogene e polistirolo 100 millimetri cella cultura piatti sono necessari per raggiungere una densità di semina iniziale di circa 2.500-5.000 cellule per cm 2. </li><li> terreno completo Pre-caldo coltura cellulare made in passi 1.2 o 1.3 in un bagno d&#39;acqua C 37 ° C per 30-45 minuti. </li><li> Decontaminare la bottiglia medio e fiala cella con il 70% di etanolo. Da questo punto in avanti tuttile operazioni devono essere eseguite in modo asettico. </li><li> Aliquotare 6 ml di DMEM completo in altrettante piatti di coltura cellulare 100 mm richiesti per utilizzare l&#39;intero volume di cellule congelate nella densità di semina di cui al punto 2.6. </li><li> Trasferire il volume di sospensione cellulare calcolata al punto 2.6 a ciascuno dei piatti 100 coltura mm. Oscillare ciascuna piastra manualmente per distribuire uniformemente le cellule sulla superficie della piastra. </li><li> Posizionare la testa di serie 100 millimetri piatto di coltura cellulare in incubatore a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima che i passi successivi. </li></ol> 3. Trapianto <ol><li> Mostra ogni piatto di coltura cellulare al microscopio per determinare la percentuale di confluenza cellule (cellule% coprono l&#39;area del piatto). le cellule per l&#39;incubatore e pre-caldo terreno completo e PBS 1x Return. Procedere al passaggio successivo, se le cellule sono 80-100% confluenti. </li><li> aspirare accuratamente la media trascorsa senza disturbare ilcellule in ogni piatto cultura. </li><li> Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l&#39;operazione per un secondo lavaggio 1x PBS. </li><li> Aliquota 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA in ogni piatto cultura e agitare delicatamente per rivestire in modo uniforme le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti. </li><li> Durante questa incubazione, un&#39;aliquota di 10 ml di terreno completo in altrettanti piatti della cultura sono necessari per ottenere la densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm 2. </li><li> Quando le cellule hanno staccata dalla piastra, aggiungere rapidamente 3 ml di inibitore della tripsina 1x definito e miscelare delicatamente il piatto per 1 min per garantire che tutte le tripsina-EDTA è stato neutralizzato. </li><li> Trasferire le cellule staccate in una sterile 15 ml provetta e mettere da parte. Aggiungere 3 ml di PBS 1X per il piatto per raccogliere tutte le cellule rimanenti e il trasferimento che per lo stesso 15 ml provetta. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 150 xgper 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di mezzo completo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 150 mm piastre di coltura contenente 15 ml di terreno completo per ottenere una densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm 2. Utilizzare due di 150 mm per ogni test cap-binding. NOTA: diffusione di ossigeno alle cellule tramite mezzo liquido dipende dal volume di 36. Si raccomanda di mantenere il volume dei mezzi coerenti tra esperimenti se le cellule aderenti o cellule in sospensione sono utilizzati. I supporti possono essere pre-condizionati (incubate nella postazione di lavoro per 24 ore, come discusso in discussione) per evitare questi variabilità in diffusione. </li><li> Porre le capsule testa di serie-cultura nel termostato a 37 ° C in atmosfera di CO 2 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima di procedere alle fasi successive. </li></ol> 4. L&#39;esposizione Physioxic <ol><li> Visualizza le cellule sotto il microscopio. per besrisultati t, in modo che le cellule sono 70-80% confluenti per una esposizione di 24 ore, il 50-60% confluenti per un&#39;esposizione 48 ore, e il 40-50% confluenti per un&#39;esposizione 72 ore. </li><li> Posizionare le cellule in una workstation ipossia per il tempo desiderato (24, 48, o 72 ore a seconda dell&#39;esperimento). </li><li> Impostare la workstation per la physioxia appropriata. NOTA: Ad esempio, un&#39;impostazione 3% O 2 sarebbe accompagnata da 5% di CO 2 e il 92% N 2. NOTA: Se le fluttuazioni di ossigeno all&#39;interno di una gamma dinamica si desiderano su una linea temporale specifico, il programma il programma nello strumento o regolare manualmente le impostazioni di ossigeno agli intervalli desiderati. </li><li> Impostare l&#39;umidità al 60%. L&#39;atmosfera workstation è molto secca comunque, e dei media sarà notevolmente evapora durante lunghi esperimenti (&gt; 48 ore). Mantenere una riserva media in un pallone di coltura di cellule all&#39;interno della stazione di lavoro (in modo che il supporto viene equilibrato con l&#39;ambiente workstation) per ricostituire i mezzi di comunicazione nel DIS coltura cellularelui è. NOTA: Ogni soluzione che interagirà con le cellule prima di lisi (come PBS e tripsina-EDTA) deve essere pre-condizionato per 24 ore prima dell&#39;uso nella workstation ipossia in modo che l&#39;ossigeno disciolto equilibra con l&#39;ossigeno atmosferico 36. </li><li> Mantenere le cellule all&#39;interno della stazione di lavoro fino lisi. </li></ol> 5. Buffer Preparazione per il saggio Cap-binding <ol><li> Preparare 1x Tris-Buffered Saline (TBS). <ol><li> In 800 ml di dH 2 O, sciogliere 8,76 g di NaCl e 6,05 g Tris Base. </li><li> Portare la soluzione ad un pH finale di 7,4 usando 1 M HCl. </li><li> Portare il volume finale di 1 L con dH 2 O. </li></ol></li><li> Preparare tampone di lisi non denaturazione. Preparare Lysis Buffer il giorno del test tappo vincolante. Fare tampone di lisi in più per lavare le perline agarosio vuote e la γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked (passi 7.9 e 7.13). <ol><li> In 7 ml di dH 2 O, aggiungere 160 ml 5 M NaCl, 160 microlitri 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 microlitri 200 mM NaF, 40 microlitri 1 M MgCl 2 e 40 microlitri 1 mM sodio orthovanadate. </li><li> Aggiungere 40 ml di Igepal alla soluzione 7 ml. Tagliare la punta della pipetta per aiutare recuperare Igepal in quanto è estremamente viscoso. </li><li> Mescolare pipettando su e giù, o vortice, la soluzione 7 ml finché tutti i Igepal è stato dissolto. </li><li> Aumentare il volume finale della soluzione a 8 ml e tenere in ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparare 4x dodecil solfato di sodio (SDS) -page Sample Buffer. <ol><li> In un becher, unire 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml di glicerolo, e 8 ml ditiotreitolo (DTT). </li><li> Aggiungere 3,2 g di SDS e 0,16 g di blu di bromofenolo. Lasciare in polvere per sciogliere completamente mescolando con un bastoncino magnetico. </li><li> Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. cellulare Lysis <ol><li> Preparare non denaturazione-tampone di lisi e tenere in ghiaccio il giorno di The cap-binding assay. </li><li> Pre-calda 1x PBS e tripsina in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 min. </li><li> Aliquota 980 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per ogni test cap-binding in corso di esecuzione. </li><li> Aggiungere 10 ml di 4- (2-amminoetil) benzensolfonile fluoruro cloridrato e 10 ml di 100x cocktail di inibitori delle proteasi ai 980 ml di tampone di lisi. Tenere in ghiaccio. </li><li> Eliminare il supporto da ogni piatto 150 millimetri in un contenitore di rifiuti all&#39;interno della stazione di lavoro ipossia. </li><li> Lavare le cellule con 3-4 ml di caldo 1x PBS e scartare tutto il liquido. </li><li> Aggiungere 1 ml di caldo 0,05% tripsina-EDTA per ogni piatto e lasciate riposare per 2 minuti o fino a quando le cellule non sono rispettate piastra. </li><li> Usando una pipetta, trasferire le cellule di una piastra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere se necessario in modo che ciascuna piastra di cellule viene trasferito in un 1,5 ml provetta separata. </li><li> Centrifugare le provette da 1,5 ml microcentrifuga a 6.000 g per 90 sec to agglomerare le cellule. </li><li> Aspirare il tripsina con una pipetta senza disturbare il pellet. Se il pellet è disturbato, ri-centrifugare la provetta da 1,5 ml a 6.000 g per 90 sec. </li><li> Lavare le cellule con caldo PBS 1x pipettando gentilmente 200 ml di PBS nella provetta appena sopra il pellet. Re-centrifuga se il pellet è disturbato. </li><li> Aspirare il PBS senza disturbare il pellet. </li><li> Pipettare 500 microlitri dalle 1 ml preparati soluzione tampone di lisi sul primo pellet cellulare. Risospendere il pellet interamente pipettando su e giù. </li><li> Combinare le cellule risospese con il secondo pellet di cellule e risospendere il secondo pellet pipettando su e giù. Ripetere questo processo fino a quando tutti i pellet sono stati combinati e risospese per ogni campione. </li><li> Combinare il lisato con i restanti 500 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Rimuovere campioni dalla workstation ipossia. NOTA: Dopo aver aggiunto tampone di lisi, unall fasi successive devono essere eseguite in aria ambiente come workstation ipossia è impostato a 37 ° C e le seguenti operazioni devono essere eseguite a freddo (4 ° C o su ghiaccio). </li><li> Lisare le cellule utilizzando blanda agitazione ruotando i campioni a 4 ° C per 1,5-2 ore. </li><li> Centrifugare le cellule lisate a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Trasferire il lisato in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet. </li><li> Prenotare una porzione (5-10%) del surnatante da utilizzare nel suo complesso controllo di input lisato cellulare per future analisi western blot. </li></ol> 7. Assay Cap-binding <ol><li> Per ogni campione, trasferire 50 ml di vuoto agarosio liquami controllo tallone e 50 ml di liquame tallone γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio C10-linked per separare 1,5 ml microprovette. Utilizzare forbici per rimuovere la punta della pipetta per facilitare la raccolta della poltiglia tallone. </li><li> Agglomerare le perline by centrifugazione della poltiglia a 500 xg per 30 sec. </li><li> Rimuovere il surnatante con attenzione e risospendere le sfere in 500 ml di TBS. </li><li> Ripetere i punti 7.2 e 7.3. Agglomerare le perline a 500 xg per 30 sec e rimuovere il surnatante. </li><li> Trasferire il surnatante contenente il lisato dal punto 6.19 al tubo di 1,5 ml microcentrifuga contenente le perline agarosio vuote. NOTA: Le perle di agarosio bianco agiscono come una fase di pre-compensazione per rimuovere le proteine ​​dal lisato che interagiscono in modo non specifico con il tallone. </li><li> Incubare per 10 minuti a 4 ° C con agitazione. </li><li> Pellet le perline agarosio vuote per centrifugazione a 500 g per 30 sec. </li><li> Trasferire il lisato alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked. </li><li> Lavare le perline agarosio vuote da risospendere le sfere in 500 ml di tampone di lisi, pellet le perline per centrifugazione a 500 xg per 30 secondi, e scartando la Supernatant. Ripetere questa operazione quattro volte per un totale di cinque lavaggi. </li><li> Risospendere le sfere agarosio vuote nel tampone campione 1x SDS-PAGE, e far bollire le perline per 90 secondi a 95 ° C. Conservare a -20 ° C per una futura analisi western blot per osservare se la proteina di interesse si lega in modo non specifico per il tallone. </li><li> Incubare il lisato con le perline γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio C10-collegate con agitazione per 1 ora a 4 ° C per catturare le proteine di legame della cap. </li><li> Agglomerare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec. Eliminare il surnatante. </li><li> Lavare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked ripetendo il passaggio 7.9. </li><li> Risospendere le sfere in 600 microlitri di tampone di lisi. </li><li> Aggiungere GTP ad una concentrazione finale di 1 mM. </li><li> Incubare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked + 1 mM GTP con agitazione per 1 ora a 4 ° C. Nota: Questosarà dissociarsi proteine che interagiscono in modo non specifico con m 7 GTP (vale a dire, di interagire anche con GTP non metilato). </li><li> Agglomerare le γ-amminofenil-m 7 GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 200 ml di 4x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo). Conservare il campione di controllo GTP a -20 ° C per una futura analisi Western Blot 37. Lavare le perline ripetendo il passaggio 7.9. </li><li> Risospendere le sfere in 1x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo) e ebollizione a 95 ° C per 90 sec. Conservare il m frazione 7 GTP-bound a -20 ° C per una futura analisi Western Blot 37. </li></ol>

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A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

L&#39;analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni di ossigeno fisiologiche può consentire l&#39;identificazione di nuovi fattori di inizio della traduzione di ossigeno-regolamentato. L&#39;affinità di questi fattori per tappo di mRNA o di altre proteine cap-associate al 5 &#39;può essere misurata con la forza della loro associazione di m 7 GTP-linked perline agarosio. Un avvertimento di questa tecnica è che misura il potenziale cap-legame delle proteine ​​post-lisi, ma essa è stata eseguita in condizioni non denaturanti che mantengono le interazioni proteina-proteina e modificazioni post-traduzionali (PTM). Diverse interazioni proteina-proteina mediano il legame della famiglia eIF4E al cap al 5 &#39;. Il 4E-BP lega e reprime eIF4E bloccando la sua interazione con eIF4G e prevenire il reclutamento dei 43S pre-iniziazione complessi 38. Il complesso eIF4E / 4E-BP rimane legato al tappo mRNA 5 &#39;, bloccando ogni iniziazione da tale trascrizione, e ci riesceessere utilizzato come marker per l&#39;inibizione eIF4E in m 7 colonne GTP affinità. Viceversa, l&#39;interazione di eIF4E con eIF4G sul m 7 colonne GTP potrebbe essere un marcatore per l&#39;iniziazione traduzione attiva. PTM sono un altro metodo per regolare l&#39;attività dei fattori di inizio della traduzione. Ad esempio, la fosforilazione di eIF4E da Mnk1 può aumentare la sua affinità per il mRNA 5 &#39;Cap 39. Il modificatore proteina codificata dal interferone stimolata Gene 15 (ISG15) è un PTM che aumenta l&#39;attività tappo vincolante eIF4E2 in risposta ad induzione di interferone tramite infezione patogeno 40. Il gene ISG15 contiene un elemento di risposta all&#39;ipossia nel suo promotore suggerendo che questo sistema potrebbe regolare eIF4E2 in ossigeno basso. Molto poco si sa su come PTM possono alterare l&#39;attività delle proteine ​​di legame della cap in condizioni di ossigeno fisiologicamente rilevanti. Questa tecnica seguita da analisi di spettrometria di massa potrebbe rivelare PTM ossigeno-regolata e fisiologicamente rilevanti nuovi Tha mediare l&#39;attività dei fattori di traduzione iniziazione. Un metodo alternativo per la cattura con una m 7 GTP tappo analogico potrebbe essere quella di un tappo immunoprecipitare vincolante conosciuta proteine come eIF4E o eIF4G ed eseguire la spettrometria di massa per identificare le proteine associate. Un limite di questa strategia è che le proteine di legame della cap hanno spesso ruoli cellulari alternative come all&#39;interno di stress granuli 41 o in traduzione cap-indipendenti 1,4. Pertanto, utilizzando m 7 analoghi cap GTP è il migliore, il metodo più affidabile per isolare le proteine di legame della cap, in particolare nell&#39;ambito delle indagini nuove proteine cap-associata. Una limitazione di utilizzare un tappo GTP analogico m 7 è che alcune proteine di legame della cap come il scavenger decapping enzima DcpS non solo interagire con il tappo GTP mRNA m 7, ma richiedono anche la seconda base per la rilegatura 42. Inoltre, gli enzimi decapping in generale, come ad esempio il complesso DCP1 / DCP2, possono Hydrolyze m 7 GTP e ridurre efficacemente la capacità della resina. Pertanto, alcune proteine ​​di legame della cap possono essere persi in questa analisi. Per ignorare questi avvertimenti, enzimaticamente resistenti analoghi cap mRNA possono essere utilizzati. Due analoghi cap non idrolizzabili, mononucleotide m 7 GpCH2pp o dinucleotide m 7 GpCH2ppA hanno dimostrato di catturare DcpS, DCP1, e DCP2 43. Questi analoghi cap mRNA non sono disponibili in commercio, ma devono essere sintetizzati chimicamente de novo. Un altro limite di questo protocollo è che solo cap-binding proteine ​​o proteine ​​che interagiscono con le proteine ​​di legame della cap tramite &quot;bagarinaggio&quot; da scattare. Mentre cap-dipendente inizio della traduzione è la principale forma di iniziazione, meccanismi di cap-indipendente sono particolarmente frequenti durante condizioni di stress cellulare 1. Tuttavia, nel contesto di questa tecnica e tendenze emergenti nel campo della traduzione iniziazione 6-8,24, individuando i fattori di stress-indotta romanzo che participate nell&#39;iniziazione cap-dipendente è una promettente area di ricerca. Un altro fattore da considerare in questo protocollo è l&#39;ossigeno nei media. Coltura di cellule in un mezzo liquido fornisce una barriera tra le cellule e l&#39;atmosfera. E &#39;stato dimostrato che i mezzi liquidi possono richiedere fino a 24 ore per equilibrare con la composizione gas atmosferico 36. Pertanto, le cellule devono essere coltivate per 24 ore nella disponibilità di ossigeno desiderato prima di lisi, oppure i media possono essere pre-condizionati se sono necessarie incubazione più brevi. Precondizionamento consiste nel mantenere il supporto nella workstation ipossia per almeno 24 ore in un pallone di coltura sterile che permette lo scambio di gas. Qualsiasi soluzione ossigenata introdotta per le cellule all&#39;interno della stazione di lavoro ipossia potrebbe rapidamente cambiare vie di segnalazione cellulare, come l&#39;avvio di traduzione cap-dipendente che è in fase di esame in questo protocollo. A causa della sensibilità dei percorsi ossigeno-sensing in cellule, qualsiasi soluzione che saràinteragire con le cellule prima di lisi, come PBS e tripsina-EDTA deve anche essere pre-condizionati per almeno 24 ore. Lisi e lavaggio post-lisi buffer devono essere utilizzati freddo e sono quindi non pre-condizionati nella workstation ipossia 37 ° C. Mentre alcune modifiche di ossigeno-dipendente alle proteine ​​potrebbero essere attivo post-lisi, i tamponi freddi sono tenuti a ridurre al minimo le attività enzimatiche e &quot;rimescolamento&quot; di proteina-proteina o proteina-RNA complessi che potrebbero portare a manufatti. Una modifica di questo protocollo per aumentare la severità può essere pre-condizioni di lisi e lavaggio post-lisi buffer per 24 ore e poi incubare in ghiaccio all&#39;interno della stazione di lavoro prima dell&#39;uso. Media e tamponi non devono essere tenuti in workstation ipossia per più di tre giorni perché queste soluzioni si concentreranno a causa dell&#39;evaporazione dell&#39;acqua. Per gli studi a lungo termine (&gt; 3 giorni), l&#39;importo iniziale di cellule seminate deve essere attentamente considerata. Come le cellule si dividono e la superficie del piatto diventa affollato,altri stress, come l&#39;acidificazione media potrebbero influenzare l&#39;attività delle proteine ​​di legame della cap. L&#39;ultimo giorno dell&#39;esperimento, le cellule dovrebbero avere una confluenza del 80-90%. Ci sono quattro passaggi critici all&#39;interno di questo protocollo: mantenendo le cellule nella stazione di lavoro ipossia fino lisi, la quantità di cellule utilizzate, lavare le perline, e il controllo non metilato GTP. 1) Ci sono diversi metodi per mantenere le cellule in ossigeno basso. La maggior parte di questi includono piccole camere che possono ospitare solo piatti di coltura cellulare, ma qualsiasi manipolazione o cella lisi devono essere eseguiti al di fuori delle camere presenti nell&#39;aria ambiente. Componenti della macchina di ossigeno-sensing come i fattori ipossia inducibile sono attivati o inattivati nel giro di uno o due minuti e 35. Pertanto, come accennato in precedenza, la lisi delle cellule in una stazione di lavoro ipossia è fondamentale per garantire l&#39;attività delle proteine ​​di legame della cap è associata alla rispettiva disponibilità di ossigeno. 2) Il numero di cellesuggerito in questo protocollo (due piatti 150 mm) è sufficiente per forte m 7 GTP interattori quali la famiglia eIF4E o membri della eIF4F complesso (eIF4A e eIF4G). Più cellule, almeno cinque piatti di 150 mm, potrebbe essere richiesto di rilevare le proteine con interazioni transitori o che solo associato con la m 7 GTP mRNA tappo attraverso eIF4F. 3) Lavare le perline dopo di loro incubazione con il lisato cellulare possono essere eseguite in maniera rigorosa e meno rigoroso. Il protocollo qui presentata offre un&#39;opzione stringente dove tampone di lisi è usato per lavare le perline cinque volte. Se le proteine ​​con interazioni deboli a Cap-binding proteins sono di interesse, si può effettuare un minor numero di lavaggi e utilizzare soluzione salina Tris tamponata al posto del tampone di lisi. 4) Anche se è importante pre-cancellare il lisato cellulare con coniugata agarosio per rimuovere le proteine ​​che interagiscono in modo non specifico con il tallone, alcune proteine ​​di legame della cap non possono distinguere tra la vera struttura tappo mRNA, GTP metilato (m7 GTP), e GTP non metilato. Una di queste proteine è il eIF4E omologo eIF4E3 44. Eluizione le perline con GTP sarà rimuovere qualsiasi proteina che riconosce anche GTP non metilato, che possa essere di interesse. La rilevanza biologica di proteine che riconoscono entrambi m 7 GTP e GTP deve essere ancora completamente chiariti. Questo è sottolineata dalle poche pubblicazioni che coinvolgono eIF4E3 (che è una bona fide proteina cap-vincolante con un cap-dominio di legame conservato) rispetto alle proteine eIF4E e eIF4E2, che fanno riconoscere m 7 GTP da GTP non metilato. Questa tecnica, come presentato, può essere eseguito come un approccio mirato per identificare m 7 interattori GTP di interesse o come approccio ampio analizzando l&#39;eluato GTP m 7 tramite spettrometria di massa. Diverse altre tecniche possono seguire l&#39;esposizione physioxic (protocollo 4) per analizzare l&#39;attività cap-binding, come frazionamento subcellulare, immunofluorescenza, co-immunoprecipitazione, unND analisi polysome. il controllo traslazionale sta emergendo come un contributore uguale espressione genica come trascrizione. Utilizzando questa tecnica per indagare l&#39;attività e la composizione dei complessi cap-binding farà luce su come inizio della traduzione cap-dipendente è regolata in risposta a basso ossigeno.

Il controllo traslazionale sta emergendo come un passo altrettanto importante regolazione trascrizionale dell&#39;espressione genica, in particolare durante i periodi di stress cellulare 1. Un punto focale di controllo traduzione è al fattore limitante di iniziazione dove le prime fasi della sintesi proteica coinvolgono il legame della eucariotica fattore di iniziazione 4E (eIF4E) al 7-methylguanosine (m 7 GTP) 5 &#39;tappo di mRNA 2 . eIF4E è parte di un complesso di nome trimeric eIF4F che include eIF4A, una elicasi RNA, e eIF4G, una proteina impalcatura necessaria per l&#39;assunzione di altri fattori di traduzione e le 40S del ribosoma 3. In condizioni fisiologiche normali, la stragrande maggioranza degli mRNA vengono tradotti attraverso un meccanismo di cap-dipendente, ma sotto i periodi di stress cellulare circa il 10% di mRNA umani contiene 5 &#39;UTR che potrebbero consentire di traduzione cap-indipendente rito di iniziazione 1,4. traduzione Cap-dipendente è stata storicamente sinonimounità organizzative con eIF4F, tuttavia, le variazioni specifiche di stress di eIF4F sono diventati un argomento di tendenza 5-8. Vari stress cellulari causano attività eIF4E da reprimere attraverso la mammalian target of complesso rapamicina 1 (mTORC1). Questa chinasi diventa compromessa sotto stress, che provoca l&#39;aumento di attività di uno dei suoi obiettivi, la proteina 4E-binding (4E-BP). Non fosforilata 4E-BP si lega ad eIF4E e blocca la sua capacità di interagire con eIF4G causando la repressione della traduzione cap-dipendente 9,10. È interessante notare che, un omologo di eIF4E chiamato eIF4E2 (o 4EHP) ha un&#39;affinità molto più basso per 4E-BP 11, forse permettendogli di eludere la repressione dello stress-mediata. Infatti, inizialmente caratterizzato come un repressore della traduzione a causa della sua mancanza di interazione con eIF4G 12, eIF4E2 avvia la traduzione di centinaia di mRNA che contengono RNA elementi di risposta all&#39;ipossia nella loro 3 &#39;UTR durante lo stress ipossico 6,13. Questo mi attivaziones raggiunto attraverso le interazioni con eIF4G3, RNA-binding protein 4 motivo, e il fattore inducibile dall&#39;ipossia (HIF) 2α a costituire un complesso eIF4F ipossica, o eIF4F H 6,13. Come un repressore in condizioni normali, eIF4E2 si lega con GIGYF2 e ZNF598 14. Questi complessi sono stati, in parte, identificati attraverso Agarose-linked m 7 resine GTP affinità. Questo metodo classico 15 è standard nel campo della traduzione ed è i saggi migliore e più tecnica comunemente usata per isolare complessi cap-binding in pull down e in vitro di legame 16-19. Come le macchine di traduzione cap-dipendente sta emergendo come flessibile ed adattabile con le parti tra loro cambiare 6-8,13, questo metodo è un potente strumento per individuare rapidamente nuove proteine di legame della cap coinvolti nella risposta allo stress. Inoltre, le variazioni di eIF4F potrebbe avere vaste implicazioni come diversi sistemi modello eucarioti sembrano utilizzare un omologo eIF4E2 per le risposte di stress talicome A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, e C. elegans 23. L&#39;evidenza suggerisce che le variazioni di eIF4F non possono essere strettamente limitato a condizioni di stress, ma essere coinvolti nella fisiologia normale 24. La fornitura di ossigeno ai tessuti (alle estremità capillari) o all&#39;interno dei tessuti (misurata tramite microelettrodi) varia dal 2-6% nel cervello 25, 3-12% nei polmoni 26, 3.5-6% nell&#39;intestino 27, 4% in il fegato 28, 7-12% nel rene 29, 4% nel muscolo 30, e 6-7% nel midollo osseo 31. Le cellule e mitocondri contengono meno del 1,3% di ossigeno 32. Questi valori sono molto più vicini a ipossia che l&#39;aria ambiente in cui le cellule sono normalmente coltivate. Questo suggerisce che ciò che è stato precedentemente pensato come processi cellulari specifici per ipossia possono essere rilevanti in un ambiente fisiologico. È interessante notare che, eIF4F e eIF4F H </sup&gt; partecipare attivamente al inizio della traduzione di piscine distinte o classi di mRNA in diverse linee cellulari umane differenti esposti all&#39;ossigeno fisiologica o &quot;physioxia&quot; 24. Low ossigeno spinge anche il corretto sviluppo del feto 33 e le cellule hanno generalmente più alti tassi di proliferazione, durata della vita più lunga, meno danni al DNA e meno risposte allo stress generale in physioxia 34. Pertanto, eIF4F H è probabilmente un fattore chiave per l&#39;espressione dei geni selezionati in condizioni fisiologiche. Qui, forniamo un protocollo per le cellule di coltura in condizioni di ossigeno fisiologiche fissi o in un intervallo di fluttuazione dinamica che rischia più rappresentativa di microambienti tissutali. Un vantaggio di questo metodo è che le cellule sono lisate nella workstation ipossia. E spesso non è chiaro come la transizione dalla coltura cellulare ipossica a lisi cellulare avviene in altri protocolli. Le cellule vengono spesso rimossi prima da un piccolo incubatore ipossia esserefore lisi, ma questa esposizione all&#39;ossigeno potrebbe influenzare percorsi biochimici come risposta cellulare a ossigeno è rapida (uno o due min) 35. Alcune proteine di legame della cap richiedono interazioni con una seconda base o possono idrolizzare il GTP m 7, quindi alcuni interattori capitalizzazione possono perdere nel processo di purificazione. Agarosio-linked per analoghi cap enzimaticamente resistenti può essere sostituito in questo protocollo. Esplorare l&#39;attività e la composizione di eIF4F H e altre varianti del eIF4F attraverso il metodo descritto qui farà luce sui complessi macchinari di espressione genica che le cellule utilizzano in condizioni fisiologiche o risposte allo stress.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:380px;">&#947;-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads</td>
			<td style="width:151px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:165px;">AC-1555</td>
			<td style="width:205px;">Agarose-linked m7GTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>877222</td>
			<td>10-cm culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm culture dish</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>130183</td>
			<td>15-cm culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AEBSF Hydrochloride</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0356829</td>
			<td>AEBSF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose Beads</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>AC-0015</td>
			<td>Agarose bead control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP112-25</td>
			<td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>1210-00S</td>
			<td>Used to centrifuge small volumes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495970C</td>
			<td>Used in culturing primary cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined trypsin inhibitor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R007100</td>
			<td>DTI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreital</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172-25</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial cell medium (complete kit)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>4101</td>
			<td>Includes serum and growth factor supplements)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM Guanosine 5&#39;-triphosphate, 1 mL</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>272076-0251M</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 colorectal carcinoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>Human cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human renal proximal tubular epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-010</td>
			<td>HRPTEC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Standard media for human cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Antibiotic component of DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H35 HypOxystation</td>
			<td>Hypoxygen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Hypoxia workstation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Igepal CA-630</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2198596</td>
			<td>Detergent component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5299-100</td>
			<td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disodium phosphate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5369-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail (100 x)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>58715</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56508</td>
			<td>Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>Component of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>2500-067</td>
			<td>Trypsin used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Analisi di Capacità Cap-binding in risposta ad ossigeno di eIF4E e eIF4E2 in un m 7 GTP Affinity Colonna Le figure 1 e 2 rappresentano le macchie occidentali del tipico m 7 GTP affinità purificazione delle due principali proteine di legame della cap in risposta alle fluttuazioni di ossigeno in due linee cellulari umane: umane renale prossimale cellule primarie tubulari epiteliali (HRPTEC) in F IGURA 1 e carcinoma colorettale ( HCT116) in Figura 2. Le cellule sono mantenute al disponibilità di ossigeno indicata per 24 ore per garantire che l&#39;ossigeno disciolto nel mezzo liquido è equilibrata con l&#39;aria all&#39;interno della workstation ipossia. La corsia di ingresso (IN) rappresenta il 10% di tutto il lisato cellulare prima della m vengono aggiunti 7 perline agarosio GTP-linked per catturare le proteine di legame della cap. Questo corsia ingresso è utilizzato come base per misurare arricchimentodi una proteina bersaglio in m 7 GTP pulldown. La corsia GTP è l&#39;eluato dalle m 7 GTP perle che erano eluire con 1 mM GTP. Questa fase consente per la rilevazione di proteine ​​che riconoscono anche GTP non metilato. Le proteine di legame della cap eIF4E e eIF4E2 riconoscono m 7 GTP specificamente, ma il loro omologo eIF4E3 (non mostrato qui) si lega anche a GTP non metilato. La capacità di eIF4E e eIF4E2 di impegnare la struttura di tappo 5 &#39;mRNA (m 7 GTP) può essere misurato comparando l&#39;intensità delle loro bande in m 7 colonna GTP relativa all&#39;intensità nella corsia di ingresso (pool totale disponibile). Tale quantificazione può essere effettuata misurando l&#39;intensità dei pixel delle bande proteiche per tre repliche biologiche con un software di analisi delle immagini, come ImageJ. I risultati sono espressi come mezzo relativo delle unità di densità (RDU) ± errore standard della media. valori grezzi prima di normalizzazioneda campioni sia sperimentali e di controllo sono stati confrontati con t-test non appaiati a due code di Student. P &lt;0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Questo esperimento rappresentativo mostra che le due linee cellulari diverse gamme di ossigeno per un loro utilizzo eIF4E e eIF4E2. La figura 1 mostra che nel HRPTEC solo eIF4E si lega fortemente al m 7 GTP al 8% O 2 (Figura 1A), che sia eIF4E e eIF4E2 sono significativamente associati con m 7 GTP 3-5% O 2 (Figura 1B - C), e che solo eIF4E2 lega fortemente ai m 7 GTP all&#39;1% O 2 (Figura 1D). In figura 2, in cellule HCT116, l&#39;uso di ossigeno-dipendente di queste proteine di legame della cap è differente: solo eIF4E lega significativamente al m 7 GTP a 12% O 2 (Figura 2A), entrambe le proteine di legame della cap legano significativamente al m 7 GTP nell&#39;intervallo 5-8% O 2(Figura 2B - C), e solo eIF4E2 si lega in modo significativo al m 7 GTP al 3% O 2 (Figura 2D). L&#39;assenza di eluizione dalla colonna GTP m 7 con GTP mostra che eIF4E e eIF4E2 sono specifici per m 7 GTP e non riconoscono GTP non metilato. I grafici a barre rappresentano la quantificazione delle tre repliche biologiche utilizzando ImageJ. I nostri risultati dimostrano che due principali proteine di legame della cap, eIF4E e eIF4E2, differiscono nella loro capacità di legare il 7 GTP struttura cap mRNA m in un modo di ossigeno-dipendente. Sulla base di letteratura precedente, che queste due proteine ​​avviare la traduzione di classi uniche di mRNA, questo spostamento dell&#39;attività cap-binding potrebbe comportare diversi proteomi generato per adattarsi ai cambiamenti nella disponibilità di ossigeno. Questa tecnica può essere utilizzata per caratterizzare fattori inizio della traduzione nuove che interagiscono con il tappo mRNA 5 &#39;(o con le proteine di legame della cap) attraverso un approccio mirato Western Blot o un approccio di ampio respiro quali l&#39;analisi di spettrometria di massa di un GTP eluato m 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55112/55112fig1.jpg" /> Figura 1: eIF4E e eIF4E2 attività si sovrappongono durante physioxia in HRPTEC 3-5% O 2. Saggi di acquisire utilizzando m 7 GTP perline in renale prossimale cellule epiteliali tubulare umana (HRPTEC) lisati esposti a (A) 8%, (B) 5%, (C) 3% o (D) 1% O 2 per 24 ore. GTP, lavaggio GTP per misurare specificità per m 7 GTP; m 7 GTP, proteine legate a m 7 perle GTP GTP dopo lavaggio. Western blot rappresentativi sono mostrati e dati di almeno tre esperimenti indipendenti sono stati quantificati da ImageJ ed espressi in unità di densità relativa (RDU) rispetto al 10% di ingresso (IN) del complesso lisato cellulare. * P &lt;0.05 (spaiato due code test t) è stato considerato un cambiamento significativo quando si confrontano l&#39;arricchimento di eIF4E o eIF4E2 nella frazione cap-bound (m 7 GTP) alla IN. Dati, media ± errore standard della media (SEM) di tre esperimenti indipendenti. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. e Uniacke, le cellule umane in coltura J. sotto ossigeno fisiologico utilizzano due proteine ​​di legame della cap per reclutare mRNA distinti per la traduzione. 2016; 291 (20): 10.772-82 24. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55112/55112fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55112/55112fig2.jpg" /> Figura 2. eIF4E e le attività eIF4E2 sovrappongono durante physioxia in HCT116 5-8% O 2. Saggi di acquisire utilizzando m 7 GTP perline in HCT116 colorettale umano lisati carcinoma esposti a (A) 12%, (B) 8%, (C) 5% o (D) 3% O 2 per 24 ore. GTP, lavaggio GTP per misurare specificità per m 7 GTP; m 7 GTP, proteine legate a m 7 perle GTP GTP dopo lavaggio. Western blot rappresentativi sono mostrati e dati di almeno tre esperimenti indipendenti sono stati quantificati da ImageJ ed espressi in unità di densità relativa (RDU) rispetto al 10% di ingresso (IN) del tutto lisato cellulare. * P &lt;0.05 (spaiato due code test t) è stato considerato un cambiamento significativo quando si confrontano l&#39;arricchimento di eIF4E o eIF4E2 nella frazione cap-bound (m 7 GTP) alla IN. Dati, media ± errore standard della media (SEM) di tre esperimenti indipendenti. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. e Uniacke, le cellule umane in coltura J. sotto ossigeno fisiologico utilizzano due proteine ​​di legame della cap per reclutare mRNA distinti per la traduzione. 2016; 291 (20): 10.772-82 24. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55112/55112fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Views.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

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siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Ricerca

Genetica

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Coniugazione saggi di accoppiamento per l&#39;analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

Differenziazione, manutenzione e l'analisi delle cellule dell'epitelio del pigmento retinico umano: un modello di malattia-in-un-piatto per le mutazioni BEST1

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding sites for transcriptional regulators to modulate gene expression. Alterations of CREs have been implicated in various diseases including cancer. While promoters and enhancers have been the primary CREs for studying gene regulation, very little is known about the role of silencer, which is another type of CRE that mediates gene repression. Originally identified as an adaptive immunity system in prokaryotes, CRISPR/Cas9 has been exploited to be a powerful tool for eukaryotic genome editing. Here, we present the use of this technique to delete an intronic silencer in the human RUNX1 gene and investigate the impacts on gene expression in OCI-AML3 leukemic cells. Our approach relies on electroporation-mediated delivery of two preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) complexes to create two double-strand breaks (DSBs) that flank the silencer. Deletions can be readily screened by fragment analysis. Expression analyses of different mRNAs transcribed from alternative promoters help evaluate promoter-dependent effects. This strategy can be used to study other CREs and is particularly suitable for hematopoietic cells, which are often difficult to transfect with plasmid-based methods. The use of a plasmid- and virus-free strategy allows simple and fast assessments of gene regulatory functions.

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Direct delivery of preassembled Cas9/guide RNA ribonucleoprotein complexes is a fast and efficient means for genome editing in hematopoietic cells. Here, we utilize this approach to delete a RUNX1 intronic silencer and examine the transcriptional responses in OCI-AML3 leukemic cells.

Indagine sul ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 di CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein acuta

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Analisi delle proteine di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno