Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere R01AI077610.

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institute of Health (NIH) e sono stati approvati dal Comitato Johns Hopkins University Animal Care e Usa (JHUACUC). Le procedure specifiche sono state eseguite sotto la protocolli ACUC approvato MO13M292 e MO13M370. 1. donatore Harvest pelle <ol><li> Anestetizzare il mouse donatore con isoflurano (vaporizzatore induzione a 4%, manutenzione a 1 - 2% attraverso il cono del mouse). Utilizzare la punta pizzico di ritiro reflex per monitorare la profondità dell&#39;anestesia. </li><li> Usando un rasoio elettrico, radere dorso dell&#39;animale e disinfettare con 10% di iodio povidone (ad esempio, Betadine). </li><li> Utilizzando forbici sterili, guanti e tecnica asettica, pelle di nuovo raccolto donatore dal fianco al collo, con scollamento a livello del tessuto connettivo areolare. </li><li> Eutanasia dell&#39;animale da dislocazione cervicale dopo la raccolta delinnesto di pelle. </li><li> Sotto un microscopio, separare il tessuto connettivo, tessuto adiposo, e pannicolo carnosus dalla pelle indietro con le forbici tenotomy sottili. Il carnosus pannicolo è un sottile, trasparente muscoli responsabili dei movimenti contrazioni della pelle. </li><li> Usando una tecnica strumenti sterili, tagliare innesti 15 mm x 15 mm dalla pelle indietro per un 10 mm x 10 mm per 15 mm letto trapianto x 15 mm. </li><li> Conservare gli innesti su garze imbevute con sterile tampone fosfato salino (PBS) in una capsula di Petri sul ghiaccio. NOTA: 8 - 10 innesti può essere ottenuta da un topo donatore. </li></ol> 2. trapianto di pelle <ol><li> Anestetizzare il mouse destinatario con isoflurano (vaporizzatore induzione a 4%, manutenzione a 1 - 2% attraverso il cono del mouse). Utilizzare la punta pizzico di ritiro reflex per monitorare la profondità dell&#39;anestesia. </li><li> Somministrare 0,02 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per alleviare il dolore post-operatorio. </li><li> Shave lato del dorso dell&#39;animale in cui l&#39;innesto will essere inserito e disinfettare con il 10% di iodio povidone. </li><li> Utilizzando le forbici, tagliare un 10 mm x 10 mm per 15 mm x 15 mm quadrato di pelle. La dimensione difetti dovrebbe essere leggermente più grande (10%) rispetto al trapianto. Tagliare come superficialmente possibile. Fare attenzione a preservare la carnosus pannicolo e vasi. La carnosus pannicolo può essere distinto dal fascia sottostante per la sua mobilità e dei vasi sanguigni che corrono superficiale ad esso. </li><li> Posizionare l&#39;innesto sul letto graft, evitando pieghe lungo i bordi. </li><li> Mettere 8 punti di sutura sugli angoli e sul centro di ciascun bordo. Per ciascuna di sutura, passare l&#39;ago attraverso l&#39;innesto e poi attraverso la carnosus pannicolo dell&#39;innesto letto sotto la pelle del destinatario circostante. </li><li> Rimuovere la maschera anestetico e lasciare che l&#39;animale recupera parzialmente da anestesia prima di applicare il cerotto. </li><li> Avvolgere il mouse destinatario in un bendaggio adesivo con garza piegata sopra l&#39;innesto. Effettuare la benda dalla combinazione di due bende, tagliola parte adesiva di uno e posizionare i due tamponi assorbenti insieme. </li><li> Monitorare il mouse da vicino durante il recupero per garantire che il bendaggio non sta limitando torace escursione e la respirazione. Togliere la benda se la frequenza respiratoria diminuisce o l&#39;animale comincia a boccheggiare o alito superficialmente. </li></ol> 3. Cura postoperatoria <ol><li> Somministrare enrofloxacina 5 mg / kg dopo l&#39;intervento chirurgico per la profilassi delle infezioni. </li><li> Posizionare il mouse trapiantato in una gabbia pulita su una piastra elettrica per microonde fino a quando non recupera completamente dall&#39;anestesia. </li><li> Osservare il mouse per 1 ora dopo l&#39;intervento prima di ritornare alla struttura alloggiativa. </li><li> Sette giorni dopo l&#39;intervento, anestetizzare il mouse come al punto 2.1. Rimuovere il bendaggio tagliando solo attraverso il lato ventrale della benda. </li><li> Osservare e palpare il trapianto il giorno successivo per i segni di formazione di croste, la contrazione, o la durezza. Se presente, l&#39;innesto può non aver raggiunto la corretta vascularizazione e deve essere considerato un guasto tecnico. </li><li> Daily Monitor per i segni di rigetto. Considerare innesti respinto quando ≥90% del tessuto trapianto diventa necrotico. </li><li> Eutanasia gli animali rifiutati e li raccolto per l&#39;analisi. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dalla sua introduzione da Medawar, prima in studi sull&#39;uomo e poi nei conigli e topi, il trapianto di pelle è stato un modello prezioso per lo studio delle risposte immunitarie allogeniche 6,7. In questo manoscritto, vi presentiamo un modello di grandi dimensioni, non vascolarizzato, il trapianto a tutto spessore della pelle con la pelle posteriore superiore e inferiore. Vari metodi alternativi, tra cui l&#39;uso della pelle coda o la pelle dell&#39;orecchio del mouse come fonte innesto di tessuto, sono stati segnalati fino ad oggi 8,9. Questi modelli presentano il vantaggio della semplicità tecnica e consentono il throughput alto volume. Il deficit relativo di cellule di Langerhans epidermiche e cellule dendritiche dermiche in trapianti di pelle coda, tuttavia, porta a ritardo rifiuto nonché all&#39;accettazione innesto facilitato dall&#39;host, particolarmente in minori modelli disallineamento MHC 10,11. Pertanto, tutto spessore innesto cutaneo tronco è considerato un modello più robusto e più adatto per lo studio delle cellule T-mediaTed rigetto acuto 12. Inoltre, il nostro modello utilizza tecniche semplici e non richiede abilità microchirurgia avanzata. Il tempo di funzionamento è breve (~ 10 min per mouse dal l&#39;insorgenza di anestesia al completamento della procedura), e la morbilità e la mortalità postoperatoria è trascurabile. La mortalità operatoria globale (morte entro 24 ore dopo l&#39;intervento chirurgico più la morte prima della rimozione del bendaggio) è stato segnalato per essere 3,8% 13. La maggior parte delle complicazioni derivano da overdose di anestesia o bende eccessivamente restrittivi, che può essere facilmente prevenuta con un attento monitoraggio della funzione respiratoria durante il periodo post-operatorio immediato e da una rapida rimozione del bendaggio ai primi segni di distress respiratorio 6,17. Il fattore più critico nel processo di attecchimento è la rivascolarizzazione del tessuto dell&#39;innesto dalla crescita interna dei vasi di accoglienza per l&#39;innesto 6. La pelle raccolto richiedes preparazione accurata, e la dissezione del carnosus pannicolo è un passaggio fondamentale. Preferiamo rimuovere le carnosus Pannicolo al microscopio. Si raccomanda di iniziare la dissezione da uno dei bordi e per avanzare lentamente spingendo il muscolo separandola dalla pelle con la lama di un tenotomia curva leggermente inclinato. Il sito del letto innesto dovrebbe essere lontano da articolazioni e la colonna vertebrale. Prima di effettuare incisioni nel mouse ricevente, la spalla e l&#39;anca devono essere spostati per visualizzare le pieghe della pelle che contribuiscono a delimitare il livello delle articolazioni. Quando si rimuove la pelle ricevente, è importante per evitare di danneggiare i vasi sanguigni che corrono superficiale al carnosus panniculus. In caso di emorragia, applicare la compressione locale e rimuovere il sangue e coaguli che possono interferire con l&#39;attecchimento. Infine, il bendaggio non dovrebbe causare difficoltà respiratorie che il recupero compromesso, anche se deve essere sufficientemente limitano a impedire lo spostamento del trapianto e auto-muventila- durante il processo di rivascolarizzazione. Strisce di plastica cerotti sono aderenti e abbastanza forte per questo scopo. Uniamo due bende per avvolgere completamente i waist mouse e per consentire il posizionamento di una garza piegata tra la benda e l&#39;innesto (figura 1). Il bendaggio viene rimosso tagliando la parte ventrale di esso, e il resto viene rimosso dall&#39;animale, al fine di evitare di interrompere l&#39;innesto nel tentativo di rimuovere il bendaggio manualmente. In sintesi, il trapianto tutto spessore della pelle è un modello ben consolidato con abbondanti riferimenti nella letteratura. La procedura è facile da eseguire, il tempo di funzionamento è breve, e le complicazioni postoperatorie sono limitati. I punti critici sono riportate meticolosa raccolta pelle donatore e il corretto posizionamento del bendaggio destinatario. Gli studi futuri che coinvolgono biomateriali che promuovono l&#39;angiogenesi e la riparazione dei tessuti possono migliorare ulteriormente il tasso di successo della procedura.

Il trapianto di organi è il trattamento di scelta per i pazienti con insufficienza terminale d&#39;organo, ed i risultati hanno migliorato notevolmente con i progressi nelle procedure chirurgiche e protocolli immunosoppressione. Tuttavia, immunosoppressione a lungo termine è associato ad effetti collaterali significativi, e lo sviluppo di nuove strategie che promuovano la tolleranza rimane l&#39;obiettivo della ricerca trapianti moderna. Numerosi modelli animali sono stati sviluppati per la ricerca di base nel trapianto, per studiare i meccanismi di rigetto e per testare immunosoppressione approcci per prevenire il rigetto del trapianto e per promuovere la tolleranza a lungo termine 1-3. modelli di topo sono diventati il ​​cardine della ricerca immunologica grazie alla disponibilità esclusiva e vasta di anticorpi diagnostici e terapeutici e ceppi inbred e transgenici ben definiti. Il trapianto della pelle è una procedura semplice che non richiede particolari competenze di microchirurgia e puòessere facilmente monitorati dopo l&#39;intervento. Nel loro insieme, il trapianto di pelle del mouse è stato uno strumento eccezionale per studiare molti aspetti coinvolti nella risposta alloimmune, tra cui la consegna antigene, il traffico delle cellule, e la distruzione dei tessuti durante rigetto del trapianto 4,5. Qui, vi mostriamo la procedura passo-passo per il trapianto a tutto spessore della pelle utilizzando il modello di topo, e descriviamo i passi importanti necessari per un attecchimento di successo della pelle trapiantata.

<table><tbody><tr><td>Straight micro forceps</td><td>Sigma</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>Curved micro forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD333R</td><td></td></tr><tr><td>Curved Stevens tenotomy scissors</td><td>Aesculap</td><td>BC905R</td><td></td></tr><tr><td>Mayo dissecting scissors</td><td>Sigma</td><td>S3146</td><td></td></tr><tr><td>Micro needle holder</td><td>Aesculap</td><td>BM563R</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze</td><td>Covidien</td><td>441218</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Nylon suture</td><td>MWI</td><td>31849</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Strips Band&amp;#45;Aid</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td></td><td>Obtained from pharmacy</td></tr><tr><td>10 cm Petri dish</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119069131</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td>DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy</td></tr><tr><td>Enrofloxacin</td><td>Bayer Health Care</td><td>186599</td><td></td></tr></tbody></table>

murine full-thickness skin transplantation

Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello in vivo consolidata per studiare alloimmune risposta e rigetto del trapianto. Nonostante la sua limitata applicazione per gli esseri umani, il trapianto di pelle nei topi è stato ampiamente impiegato per la ricerca sui trapianti. La procedura è facile da imparare ed eseguire, e non richiede tecniche microchirurgiche delicate né una formazione completa. Inoltre, il rigetto in questo modello si verifica in una reazione immunologica molto riproducibili ed è facilmente monitorato mediante ispezione diretta e palpazione. Inoltre, il trapianto di pelle secondario con innesti donatore corrispondenza o pelle di terze parti può essere eseguita su più modelli di trapianto complessi come un metodo alternativo e semplice per valutare la tolleranza specifici per donatore. Le complicazioni sono bassi e sono in genere limitati a overdose anestesia o distress respiratorio dopo la procedura. fallimento Graft, invece, si verifica comunemente come a causa della scarsa preparazione del gra poppa, errato posizionamento nel letto trapianto, o il posizionamento inadeguato del bendaggio. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo per il trapianto di pelle a tutto spessore nei topi e descrivere i passi importanti necessari per una procedura di successo.

Il posizionamento del bendaggio sul mouse destinatario è un importante passo della procedura. L&#39;innesto di pelle è posizionato sul tronco destinatario, tra la spalla, anca e colonna vertebrale (Figura 1). La benda è realizzata con garza piegata e la combinazione di due bende adesive plastica. Il mouse destinatario è posizionato con l&#39;innesto giù sopra la garza sul centro della benda. Utilizzando due micro pinze curve, l&#39;estremità inferiore della benda è tirato prima, e poi la parte superiore della benda è avvolto sopra il mouse per l&#39;addome. Nei modelli di mismatch completi, tutto spessore innesti cutanei sono di solito respinte 8 a 12 giorni. Nei modelli disallineamento minori, risposte di rigetto sono più lenti, più variabile, e la comparsa innesto di pelle è caratterizzata da cambiamenti distinti meno, come contrazione o la perdita di capelli (Figura 2). trapianto rigetto acuto generilly inizia con gonfiore ed eritema del trapianto. Questi eventi sono seguiti da trapianto essiccazione, restringimento, e formazione di crosta (Figura 2B e C). A seconda del grado di MHC disadattamento e il protocollo immunosoppressione, rifiuto può avvenire mediante un processo subacuto, caratterizzato da cambiamenti sottili come la perdita di capelli, pigmentazione, creste dermiche, e il volume dell&#39;innesto. In questi casi, un innesto respinto appare lucido, bianco, e senza peli, con bordi irregolari (Figura 2F) 14. Utilizzando questo modello di trapianto di pelle, abbiamo studiato un nuovo approccio mira il metabolismo delle cellule T per evitare rigetto del trapianto 15. E &#39;ben noto che la segnalazione di percorsi metabolici giocano un ruolo critico nel dettare i risultati delle risposte delle cellule T 16. cellule T naive basano su fosforilazione ossidativa mitocondriale per generare l&#39;energia necessaria per la sorveglianza immunitaria base. Però,dopo l&#39;attivazione, le cellule T effettrici metabolicamente riprogrammare per glicolisi aerobica e mostrano un aumento del metabolismo della glutammina 16,17. Utilizzando Balb / c come donatori e C57BL / 6 come destinatari, abbiamo osservato che l&#39;inibizione glicolisi e fosforilazione ossidativa metabolismo (2DG + metformina) o glutammina da sola (DON) prolungato con la pelle del trapianto di sopravvivenza, ma bloccando i tre percorsi contemporaneamente ha portato in modo significativo, aumento del trapianto sopravvivenza (Figura 3C). Inoltre, la terapia metabolica tripla era più efficace di ciclosporina convenzionale o rapamicina (Figura 3A e B). accettazione permanente non è stato raggiunto, e ulteriori strategie, tra cui la terapia esaurimento, costimulation blocco, o nuove terapie metabolici, può favorire una migliore induzione della tolleranza del trapianto. Tuttavia, lo studio ha fornito due nuovi approfondimenti: l&#39;uso di inibitori non specifici per colpire le cellule immunitarie selettive con aumentate richieste metaboliche, nonché il requisito t<html> o bloccare i tre percorsi metabolici contemporaneamente per ottenere immunosoppressione più robusto nel rigetto del trapianto. inibitori della calcineurina e bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR inibitori) costituiscono la maggior parte della terapia immunosoppressiva convenzionale utilizzato nei trapianti clinica. i tassi di sopravvivenza del trapianto mediani dei Balb / c per C57BL / 6 trapianti di pelle trattati con ciclosporina e rapamicina sono stati 17 e 16 giorni, rispettivamente. In confronto, i destinatari trattati con inibitori metabolici che inibiscono la glicolisi delle cellule T, fosforilazione ossidativa mitocondriale e metabolismo della glutammina avevano prolungato la sopravvivenza: la sopravvivenza del trapianto mediana è stata di 29 giorni. Inoltre, l&#39;istologia di innesti cutanei del gruppo di terapia metabolica esposto allineamento dei tessuti più intatti e meno infiltrato infiammatorio linfocitica (Figura 4). 105 / 55105fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Il rivestimento della Graft con il bendaggio. Graft (A) Pelle posizionato sul tronco destra. (B) fasciatura fornito con una garza piegato e due strisce bende plastica. Mouse (C) Destinatario posta sulla garza. (DF) Bandage avvolto intorno al mouse. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55105/55105fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55105/55105fig2.jpg" /> Figura 2: Skin Graft Aspetto durante acuta e rigetto cronico. (A) Balb / c per C57BL / 6 (mancata corrispondenza completa) il trapianto a tutto spessore della pelle, senza evidenza di rifiuto (giorno 8). (B) Balb / c per C57BL / 6 trapianto di pelle a tutto spessore con il 50% rigetto del trapianto (giorno 13). (C) Balb / c per C57BL / 6 trapianto a tutto spessore della pelle con il rigetto del trapianto completo (giorno 18). (D) il trapianto di pelle a tutto spessore Singenico (giorno 8). Il trapianto (E) Singenico a tutto spessore della pelle (giorno 30). (F) C57BL / 10 a C57BL / 6 (mancata corrispondenza minore) il trapianto a tutto spessore della pelle con rigetto cronico (giorno 100). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55105/55105fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55105/55105fig3.jpg" /> Figura 3: Balb / c per C57BL / 6 Pelle sopravvivenza del trapianto. (A) Il trattamento con ciclosporina (25 mg / kg QD). (B) Il trattamento con rapamicina (3 mg / kg QD). (C) Il trattamento con inibitori metabolici, 2-deossi-D-glucosio (2DG) 500mg / kg QD, metformina 150 mg / kg QD, e 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) 1,6 mg / kg QOD. Tutti i trattamenti sono stati somministrati dal giorno del trapianto fino a rifiuto. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55105/55105fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55105/55105fig4.jpg" /> Figura 4: ematossilina e eosina (a destra, X100, sinistra, X200) di pelle innesta con metabolica terapia postoperatoria al 7 ° giorno. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55105/55105fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello consolidato per studiare il rifiuto in un ambiente alloimmune. Qui, mettiamo a disposizione un tutorial di ogni passo coinvolti in esecuzione di un BALB / c -&gt; C57BL / 6 a tutto spessore trapianto di pelle.

Murine tutto spessore trapianto della pelle

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

murine-full-thickness-skin-transplantation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.0K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine.  Murino di trapianto a tutto spessore della pelle è un modello consolidato per studiare il rifiuto in un ambiente alloimmune. Qui, mettiamo a disposizione un tutorial di ogni passo coinvolti in esecuzione di un BALB / c -> C57BL / 6 a tutto spessore trapianto di pelle. 

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Trapianto di pelle murina

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Biologia

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modello murino di guarigione delle ferite

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Medicina

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Tissue tritata in Compressed Collagene: A Biotransplant cellulare contenente per la riparazione singolo-messa in scena Ricostruttiva

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Immunologia e infezioni

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Biologia dello sviluppo

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational research in skin immunology. Murine and human skin differ substantially in anatomy and immune cell composition. Therefore, traditional mouse models have limitations for dermatological research and drug discovery. However, successful xenotransplants are technically challenging and require optimal specimen and mouse graft site preparation for graft and host survival. The present protocol provides an optimized technique for transplanting human skin onto mice and discusses necessary considerations for downstream experimental aims. This report describes the appropriate preparation of a human donor skin sample, assembly of a surgical setup, mouse and surgical site preparation, skin transplantation, and post-surgical monitoring. Adherence to these methods allows for maintenance of xenografts for over 6 weeks post-surgery. The techniques outlined below allow maximum grafting efficiency due to the development of engineering controls, sterile technique, and pre- and post-surgical conditioning. Appropriate performance of the xenograft model results in long-lived human skin graft samples for experimental characterization of human skin and preclinical testing of compounds in vivo.

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

The present protocol describes how to graft human skin onto non-obese diabetic (NOD)-scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) mice. A detailed description of the preparation of human skin for transplant, preparation of mice for transplant, transplantation of split-thickness human skin, and post-transplantation recovery procedure are included in the report.

Modello cutaneo di xenotrapianto per manipolare le risposte immunitarie umane in vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Un modello Murine di una ferita da ustione ricostruita con un innesto di pelle allogenica

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

A Technique for Human Skin Grafting in a Mouse Model

Source: Moss, M. I. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/64040">Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses&#160;In Vivo.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for grafting human skin onto an immunodeficient mouse with a suppressed neutrophil response. The method involves applying human split-thickness skin to the mouse&#39;s graft bed, sealing it, and covering it for recovery. Eventually, the human skin adheres to the mouse&#39;s skin, establishing vascularization and circulation, resulting in a successful skin xenograft.

Una tecnica per l'innesto di pelle umana in un modello murino

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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