Il lavoro è stato finanziato dal cuore Foundation&#39;and britannico sostenuto dal National Institute for Biomedical Research Centre Health Research al Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust e University College di Londra.

Tutte le ricerche degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali sotto licenza dal Regno Unito Home Office. 1. dissezione e la fissazione di cuori embrionali <ol><li> Euthanize un mouse scaduta incinta sul giorno desiderato utilizzando una tecnica di abbattimento etico approvato, ad esempio, di CO 2 narcosi seguita da dislocazione cervicale, e rimuovere le sacche embrionali 14, ponendole in una capsula di Petri 10 centimetri riempito con tampone fosfato salino (PBS) . </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione e pinze, aprire con cautela le sacche uterine e rimuovere ogni embrione, recidere il cordone ombelicale e la rimozione del sacco vitellino. </li><li> Ai fini di genotipizzazione, rimuovere la coda embrionale e posto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per l&#39;estrazione di lisi / DNA in seguito. </li><li> Per rimuovere cuore, pin ogni embrione sul dorso in un elastomero siliconico rivestito 35 millimetri Petri PBS-riempite, utilizzando perni minutien acciaio inossidabile. Utilizzando una pinza sottile, carefully aprire il torace e tagliare i grossi vasi, anteriore al cuore. Poi raggiungendo dietro il cuore con le pinze, afferrare i vasi dietro il cuore e tirare delicatamente per rimuovere il cuore; polmoni può anche venire via allo stesso tempo. </li><li> Trasferire il cuore ad un fresco 35 millimetri Petri contenenti PBS e utilizzare una pinza sottile per tagliare via il tessuto polmonare, se necessario. Poi il trasferimento cuore in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti riempiti con PBS freddo. </li><li> Dopo aver raccolto tutti i cuori nella piastra 48 pozzetti, aspirare il PBS con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e sostituirlo con 0,5 ml 4% paraformaldeide (PFA). ATTENZIONE: PFA è un noto per essere allergenico, cancerogeno e tossico. <ol><li> Fix E11.5 - 12,5 cuori per 15 min, cuori E13.5 per 20 min e E14.5 - 15.5 cuori per 30 minuti, a 4% PFA a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Aspirare il PFA con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e sciacquare i cuori 2x in PBS freddo. CAUTION: PFA sono pericolosi e devono essere smaltiti secondo le norme istituzionali. </li><li> Se non si utilizza immediatamente per tutto il monte immunostaining (vedere la sezione 2), disidratano i cuori mediante la realizzazione di successivi 5 min lavaggi nelle seguenti soluzioni: 25% di metanolo / 75% PBS, il 50% di metanolo / 50% PBS, il 75% di metanolo / 25 % PBS. ATTENZIONE: Il metanolo è tossico, indossare guanti. Conservare i cuori a -20 ° C in 100% metanolo. </li></ol> 2. monte intero Immunocolorazione di embrionali cuori con Anti-PECAM1 anticorpo NOTA: Gli anticorpi anti-PECAM1 funzionano bene per la colorazione dei vasi coronarici (vedi punto 2.4), ma qualsiasi marcatore pan-endoteliale, che dà un segnale robusto sarebbe adatto. <ol><li> Se si utilizza cuori che sono stati conservati in 100% metanolo, trasferire 1,5 ml provette da microcentrifuga e reidratare effettuando successivi 5 min lavaggi nelle seguenti soluzioni: 75% metanolo / 25% PBS, 50% metanolo / 50% PBS e 25% metanolo / 75% PBS. </li&gt; <li> Permeabilize i cuori effettuando 3 x 10 min lavaggi in 0,5 - 1,0 ml PBST (PBS / 0.1% Tween-20), rotante a temperatura ambiente. </li><li> Bloccare i cuori ruotando per 1 ora a temperatura ambiente in 1,0 ml di 10% siero di capra in PBST. </li><li> Rimuovere tampone bloccante con una plastica pipetta Pasteur a punta fine o 1.000 ml puntale e sostituirlo con 400 - 500 ml di blocco fresco contenente l&#39;anticorpo primario anti-PECAM1 diluito 1:50. Ruotare i tubi notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno successivo, aspirare l&#39;anticorpo blocco / primaria con una pipetta Pasteur di plastica a punta fine o 1.000 ml puntale ed eseguire almeno 6x 1 ora lavaggi in 1,0 ml di PBST, ruotando i tubi a temperatura ambiente. </li><li> Sostituire l&#39;ultimo lavaggio con tampone di bloccaggio fresco contenente l&#39;anticorpo secondario fluoroforo coniugato diluito 1: 500, e incubare una notte a 4 ° C, con rotazione. Proteggere dalla luce avvolgendo i tubi in carta stagnola. </li><li> Il giorno seguente, aspirare il blocco / secanticorpo daria con una punta fine pipetta Pasteur di plastica e di effettuare almeno 6x 1 ora lavaggi in 1,0 ml di PBST, ruotando i tubi a temperatura ambiente. </li><li> Conservare i cuori a 4 ° C (protetto dalla luce) fino a quando necessario. </li></ol> 3. preparazione di soluzioni di compensazione e piatti Microscopia NOTA: Quando l&#39;imaging cuori BABB è vitale che nessuna soluzione BABB entra in contatto con i componenti del microscopio. A tal fine il seguente protocollo contiene le istruzioni per la preparazione di piatti di elastomeri di silicone sigillato adatti per microscopia a fluorescenza, che possono essere preparate in anticipo. L&#39;elastomero siliconico fornisce una barriera per contenere la BABB e impedire che potenzialmente infiltrazioni tra il fondo di vetro ed i lati policarbonato del piatto. <ol><li> Per preparare i piatti elastomero di silicone, prendere piatti ottici con fondo trasparente della cultura e mettere un tappo da un 4 ml con tappo a vite flaconcino (circa 1,5 cm di diametro) Al centro di ogni piatto. NOTA: Questo sarà un bene per il campione quando l&#39;elastomero viene applicata al piatto. </li><li> Riempire i piatti con elastomero siliconico ad una profondità di circa 0,5 cm usando una cartuccia applicatore di mescolare i due componenti sono applicati, in base alle istruzioni del fabbricante. Lasciare curare per almeno 24 ore, facendo attenzione che il tappo del flacone rimane al centro di ogni piatto. NOTA: Usare occhiali di sicurezza per evitare il contatto accidentale del elastomero di silicone con gli occhi. </li><li> Dopo la polimerizzazione l&#39;elastomero, rimuovere il cappuccio della fiala da ogni piatto, Questo lascerà un pozzo centrale dove il campione da acquisire può essere posto a diretto contatto con il fondo di vetro del piatto. NOTA: quando curato l&#39;elastomero deve essere robusto e asciutta al tatto. </li><li> Preparare la soluzione BABB (1 parte di alcool benzilico a 2 parti benzilico benzoato). Questo deve essere conservato in una bottiglia di vetro al riparo dalla luce. ATTENZIONE: BABB è una soluzione tossici, corrosivi. Maneggiare sotto cappa mentre indossa abbigliamento protettivo adeguato. </li><li> Mix BABB e metanolo per ottenere una soluzione 50:50 (1 - 5 ml) in un flacone di vetro. Proteggere dalla luce, ad esempio, avvolgendo la fiala in un foglio. </li></ol> 4. La disidratazione, di compensazione e di montaggio di Cuori per Microscopia confocale NOTA: ingrandita campioni possono essere cancellati in 4 ml fiale di vetro, tuttavia per piccoli campioni (per esempio, cuori fino a E13.5) è meglio effettuare il processo di compensazione direttamente nel piatto microscopia. Questo aiuta a prevenire &#39;perdere&#39; i campioni come i cuori diventano molto trasparente una volta eliminato. Per questi piccoli campioni di compensazione è molto rapida, che si verifica entro pochi minuti. NOTA: Proteggere i campioni dalla luce durante tutte le seguenti fasi di confezionamento / rivestimento tubi e piatti con un foglio. <ol><li> Prima di cancellare, disidratano i-cuori immunostained attraverso una serie di metanolo facendo ruotare i cuori a camera Temperatura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a modifiche successive delle seguenti soluzioni: 25% metanolo / 75% PBS, 50% metanolo / 50% PBS e 75% metanolo / 25% PBS (5 min in ciascuna). Infine, ruotare per 3 x 5 min a 100% di metanolo. </li><li> Per i cuori fino a E13.5, posto al centro del piatto microscopio; al microscopio garantire cuore è orientato con il suo alto lato dorsale. Rimuovere eventuali metanolo da tutto il cuore con una punta fine pipetta di plastica Pasteur. </li><li> Utilizzando un pulito a punta fine di plastica pipetta Pasteur, aggiungere BABB: metanolo 50:50 soluzione in un volume sufficiente per immergere il cuore (circa 300-400 ml). Come il cuore a volte può capovolgere nella soluzione, prova di nuovo l&#39;orientamento mentre i cuori sono ancora opachi. Lasciare nella soluzione per 5 min. </li><li> Rimuovere la soluzione 50:50 a una bottiglia di rifiuti di vetro in cappa e sostituirlo con BABB, ancora una volta con un a punta fine di plastica pipetta Pasteur. NOTA: Un grande volume non è necessaria; aggiungi sufficient modo che il cuore si trova all&#39;interno di una goccia di soluzione. Il cuore deve cancellare entro 5 minuti. </li><li> Per i cuori più grandi, cancellare i campioni in fiale di vetro. NOTA: Un cuore E15.5 dovrebbe risolversi entro 30 minuti-1 ora, ma può essere lasciata durante la notte se necessario. </li><li> Dopo che il campione è chiaro, rimuovere la soluzione e sostituirlo con un volume minimo di BABB. Facoltativamente, coprire il campione con un vetrino, per aiutare a mantenere in posizione, tuttavia questo non è assolutamente necessario. Utilizzare il cuore per l&#39;imaging. </li></ol> 5. Imaging Azzerato Cuori da Microscopia confocale NOTA: Le immagini sono state catturate su un microscopio confocale invertito utilizzando 10X o 20X obiettivi a secco. Sebbene sia possibile utilizzare i piatti su un confocale verticale, particolare attenzione deve essere presa per evitare il contatto dell&#39;obiettivo con la soluzione BABB. <ol><li> Raccogliere un z-scan del cuore 15. A seconda delle dimensioni del cuore, una scansione tegola può essere richiesto di immagine tutto il cuore 16. <br/&gt; ATTENZIONE: BABB è una soluzione corrosiva, indossare guanti puliti e garantire la parte esterna del piatto di microscopia è esente da BABB. Maneggiare il piatto con attenzione e tenere il coperchio sul piatto per minimizzare il rischio di contatto accidentale con il microscopio. </li><li> Se la distanza di lavoro obiettivo permette, utilizzare un ingrandimento maggiore per ottenere immagini ad alta risoluzione di regioni di interesse. </li></ol> 6. Analisi dei dati mediante Fiji Software <ol><li> Aprire la z pila di immagini in Fiji 17. </li><li> Per rendere la proiezione az di tutta la pila o parte di esso, clicca sull&#39;immagine e selezionate Pila, seguito dal progetto Z. Inserisci Start e Stop numeri delle sezioni, e selezionare il tipo di z di proiezione, ad esempio, l&#39;intensità media, intensità max. </li><li> Per evidenziare i singoli vasi all&#39;interno di una pila di fette di immagine utilizzano lo strumento Blow (dal menu di selezione Plugin segmentazione, e poi soffiare / strumento Lazo) e cliccare sulle aree dell&#39;immagine da compilare e bisfetta ch. Utilizzare il comando Fill (fare clic su Modifica, quindi selezionare Fill) per riempire le aree selezionate con il colore di primo piano della scelta (fare clic su Modifica, quindi selezionare Opzioni, seguito da colori e primo piano). </li><li> Progetto Z l&#39;immagine pila come prima. </li></ol> 7. 3D Surface Volume Rendering delle arterie coronarie generato utilizzando Imaris <ol><li> Fare clic sulla vista icona di sorpassare nella parte superiore dello schermo e trascinare il file immagine nella finestra dei dati. Fare clic sulla icona Vista 3D nella parte superiore dello schermo. </li><li> Selezionare l&#39;icona superfici (icona blu) e quindi fare clic sulla scheda Crea. Fare clic nella finestra di dialogo &#39;Skip creazione automatica, modificare manualmente&#39; e cliccare sull&#39;icona Draw (sottile icona della matita). </li><li> Selezionare la scheda Contour, e poi la scheda Modalità. In modalità, cliccare sulla bacchetta magica o le icone ISOLINE. Scegliere la modalità puntatore nella selezione puntatore sul lato destro dello schermo facendo clic su accanto a &#39;Seleziona&#39;, e quindi fare clic su &#39;Draw9; scatola (in basso a sinistra dello schermo). </li><li> Utilizzare lo ISOLINE o strumento bacchetta magica per selezionare i contorni delle arterie a fette successive. Passare dalla fetta di tagliare con il cursore Slice posizione. </li><li> Quando tutti i contorni sono stati selezionati, fare clic sulla casella Crea superficie. Il volume circostante può essere reso invisibile, o resa più o meno opaca utilizzando la modalità di fusione; cliccare sul volume per evidenziarlo e quindi selezionare la scheda Impostazioni, quindi la scheda Modalità. Selezionare Miscela e utilizzare il cursore per modificare l&#39;opacità. </li><li> Cattura immagini utilizzando la funzione Snapshot. </li></ol>

<ol>
	<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries.">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Res. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+lymphatics+are+heterogeneous+in+origin+and+respond+to+injury.">Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury.</a> Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).</li><li>Nam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+veins+determine+the+pattern+of+sympathetic+innervation+in+the+developing+heart.">Coronary veins determine the pattern of sympathetic innervation in the developing heart.</a> Development. 140 (7), 1475-1485 (2013).</li><li>Zhu, D., Larin, K. V., Luo, Q., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+tissue+optical+clearing.">Recent progress in tissue optical clearing.</a> Laser Photon. Rev. 7 (5), 732-757 (2013).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat. Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+of+morphology+and+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos.">Confocal laser scanning microscopy of morphology and apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Methods Mol. Biol. 135, 191-202 (2000).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> J. Vis.Exp : JoVE. (89), (2014).</li><li>Dyer, L. A., Wu, Y., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+isolation+from+the+developing+embryonic+mouse+heart+valve+region.">Protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region.</a> J. Vis.Exp s : JoVE. (91), e51911 (2014).</li><li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart.">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J. Vis.Exp : JoVE. (97), (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis.">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circ. Res. 116 (3), 515-530 (2015).</li><li>Ivins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CXCL12/CXCR4+Axis+Plays+a+Critical+Role+in+Coronary+Artery+Development.">The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development.</a> Dev. Cell. 33 (4), 455-468 (2015).</li><li>Theveniau-Ruissy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stem+development+in+wild-type+and+Tbx1+null+mouse+hearts.">Coronary stem development in wild-type and Tbx1 null mouse hearts.</a> Dev. Dyn : an official publication of the American Association of Anatomists. 245 (4), 445-459 (2016).</li><li>Tomanek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+coronary+vasculature+during+development.">Formation of the coronary vasculature during development.</a> Angiogenesis. 8 (3), 273-284 (2005).</li><li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development.">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> J. Clin.Iinvest. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+formation.+De+novo+formation+of+a+distinct+coronary+vascular+population+in+neonatal+heart.">Vessel formation. De novo formation of a distinct coronary vascular population in neonatal heart.</a> Science. 345 (6192), 90-94 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

vasi coronarici in interi cuori embrionali sono stati ripresi da immunostaining wholemount con anticorpi anti-PECAM1 seguito da gioco ottica e la microscopia confocale. Il metodo semplice qui descritto, per la liquidazione dei cuori embrionali di topo con BABB, aumenta la penetrazione ottica e consente la cattura di immagini ad alta risoluzione dei vasi sanguigni localizzati nelle pareti dell&#39;aorta e ventricolari. Glicerolo a base di reagenti di montaggio, come Vectashield (indice di rifrazione 1,45) sono stati utilizzati anche per l&#39;imaging del sistema vascolare coronarico 22 invece l&#39;indice di rifrazione più elevato di Babb (1,56) riduce la dispersione della luce ancora di più, consentendo la penetrazione nei tessuti più profondi. passaggio Tissue elimina la necessità di più complesse, costose forme di microscopia come multifotonica e microscopia foglio leggero che può essere meno prontamente disponibile per i ricercatori. Il processo di compensazione è estremamente rapido rispetto ad altri metodi 6-9 e per piccoli campioni possono essere caRRied utilizzando piccoli volumi di reagenti direttamente sul piatto microscopia. colorazione robusta della vascolarizzazione è necessaria al fine di ottenere immagini di alta qualità; anti-PECAM1 anticorpo è stato selezionato come segna tutti i tipi di coronarica EC e una serie di anticorpi commerciali sono stati trovati invia opportunamente elevati livelli di colorazione. Inoltre, la colorazione fluorescente appare estremamente stabile in BABB; campioni conservati a temperatura ambiente in BABB (protetti dalla luce) mantenuto la loro segnale fluorescente per diversi mesi. Il fatto che PECAM1 anticorpo marca efficacemente l&#39;endocardio coronarica e vascolare era talvolta problematico, soprattutto durante la cattura immagini del plesso peritruncal. Forte colorazione del lume aortico rispetto al peritruncal EC determinato un rischio di sovra-saturazione in alcune zone delle immagini, il che significa che è stato richiesto un&#39;attenta regolazione dei parametri di imaging. Idealmente, una colorazione anticorpi solo vascolare EC sarebbe stato utilizzato; in pratica,tuttavia, trovare gli anticorpi adatti che producono il livello di colorazione wholemount può essere difficile. Recentemente, acido grasso proteina legante 4 (FABP4) ha dimostrato di essere un indicatore della coronaria EC vascolare 23 e può quindi rappresentare un&#39;alternativa alla PECAM1. Al fine di mantenere la morfologia 3D delle camere aorta e cuore i campioni non erano piatto montato, ma sono stati invece ripreso in piatti con fondo trasparente. La profondità dei campioni da acquisire precluso l&#39;uso di obiettivi ad alto ingrandimento, a causa delle loro brevi distanze di lavoro. Tuttavia immagini ad alta risoluzione erano ancora raggiungibili utilizzando un obiettivo 10X, aumentando il tempo di permanenza dei pixel e con una dimensione di matrice di pixel di almeno 1.024 x 1.024 per la cattura delle immagini. Questo era sufficiente per l&#39;analisi della struttura e distribuzione dei vasi coronarici, tuttavia Un&#39;analisi più accurata struttura cellulare può richiedere piatta montaggio dei campioni. La dissezione di singole parti del cuore per il montaggio,ad esempio, pareti ventricolo o aorta, può anche essere necessario. In alternativa, sovracampionamento dell&#39;immagine seguita da deconvoluzione può essere effettuata al fine di aumentare la risoluzione e la sensibilità; questo però richiede molto più tempo i tempi di scansione e crea file di immagini molto grandi che richiedono molta potenza di calcolo per elaborare. Cuori fino a E15.5 sono stati ripresi con successo utilizzando questo metodo, ed è anche possibile analizzare la vascolarizzazione di embrioni interi (almeno fino a E11.5) utilizzando lo stesso protocollo. Altri tipi di cellule, ad esempio, cellule muscolari lisce sono state anche ripreso nel nostro laboratorio utilizzando questa tecnica. Per i tessuti più spessi, per esempio, cuori di età superiore a E15.5, la penetrazione degli anticorpi può essere un fattore limitante; può essere richiesto incubazione più lunghi e / o un aumento di detergente. Inoltre, quando si raccolgono una grande z pila di immagini intensità del segnale può essere ridotto come i laser penetrano più lontane porzioni di tessuto; tuttavia il confimpostazioni ocal possono essere regolate per aumentare la potenza del laser con l&#39;aumentare della distanza z. Questo metodo facilita l&#39;analisi al microscopio confocale di entrambe le prime fasi della formazione dei vasi coronarici e il patterning delle arterie coronarie in fasi di sviluppo successive. Informazioni dettagliate sulla distribuzione, ramificazione e la struttura dei vasi sanguigni può essere acquisita in breve tempo, rendendo questo un prezioso strumento per lo studio di mutanti genetici di topo con difetti specifici percorsi di angiogenesi.

Creazione di una rete coronarica funzionante è fondamentale per la funzione del cuore e lo sviluppo embrionale, e l&#39;analisi di mutanti genetici del mouse in grado di fornire informazioni preziose in segnali molecolari alla base di questo processo di sviluppo. La capacità di visualizzare plesso coronarie embrionali nel suo complesso, piuttosto che presentato in una serie di sezioni istologiche, è essenziale per facilitare l&#39;analisi di patterning nave in mutanti genetici, ed evita la perdita potenziale di informazioni che possono verificarsi a seguito di meccanico affettatura del tessuto. Vasi destinata a formare le arterie e capillari sono localizzati in profondità all&#39;interno delle mura di entrambi i ventricoli e l&#39;aorta 1-3. Tuttavia, mentre marcatura fluorescente di cellule in combinazione con scansione laser confocale in grado di fornire immagini ad alta risoluzione di navi wholemount marcato superficiali venose / linfatici 4,5, la profondità delle immagini è limitata dalla penetrazione ottica. immagini ad alta risoluzione di tappoillaries e arterie in tutto il tutta la profondità del cuore non è quindi possibile senza una qualche forma di compensazione dei tessuti. Penetrazione ottica scadente è causato dalla alto indice di rifrazione del multiplo cellulare e extracellulare (per esempio, collagene e fibre elastiche) componenti di tessuti spessi. Questo disperde la luce di imaging, causando la sfocatura e una diminuzione del contrasto. gli agenti di compensazione genere corrispondono l&#39;elevato indice di rifrazione di tali tessuti, il che significa che la luce può viaggiare attraverso il campione senza ostacoli e penetrare in profondità nel tessuto. Prima di compensazione, i tessuti sono generalmente disidratati come l&#39;acqua ha un indice di rifrazione relativamente basso. Una pletora di nuovi metodi di compensazione sono stati sviluppati di recente, tuttavia a seconda della tecnica utilizzata, il processo di compensazione può richiedere giorni o settimane e può richiedere costosi reagenti 6-9. BABB (una miscela 1: 2 di alcool benzilico e benzil benzoato) è un agente di compensazione comunemente usato poco costoso, che ha lavantaggio di compensazione campioni in modo estremamente rapido. Tecniche di compensazione BABB-based e di imaging sono stati descritti in precedenza per i campioni neurologici e vari organi 10-13. Qui si descrive una tecnica solida e lineare per la liquidazione BABB di campioni immunostained seguita da microscopia confocale, con specifico riferimento all&#39;esame dei vasi sanguigni nei cuori murini da E (giorno embrionale) 11,5-15,5. Tuttavia, come è stato anche dimostrato, la tecnica può essere ugualmente applicata ad analisi di embrioni interi, così come altri tipi di cellule, purché anticorpi alta qualità ai marcatori di interesse sono disponibili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">PBS</td>
			<td style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:167px;">14190-094</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Forceps</td>
			<td style="width:128px;">FST</td>
			<td style="width:167px;">11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">10cm Petri dishes</td>
			<td style="width:128px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:167px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">35mm Petri dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P5112</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter</td>
			<td style="width:128px;">FST</td>
			<td style="width:167px;">26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Fine tip pastettes&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Alpha Laboratories</td>
			<td style="width:167px;">LW4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">1000ml pipette tips</td>
			<td style="width:128px;">Sorenson</td>
			<td align="right" style="width:167px;">34000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">48-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:167px;">353078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Kwik-Gard</td>
			<td style="width:128px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:167px;">KWIKGARD</td>
			<td>Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Kwik-Gard refill</td>
			<td style="width:128px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:167px;">KWIKGLUE</td>
			<td>Refill cartridges and dispensing tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P6148</td>
			<td>Make up in PBS and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">100% methanol</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:167px;">20847307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Tween&#174;20</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Goat serum</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse</td>
			<td style="width:128px;">BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:167px;">553370</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:167px;">ab28364</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">MA3105</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal</td>
			<td style="width:128px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:167px;">sc-65495</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal</td>
			<td style="width:128px;">Abcam</td>
			<td style="width:167px;">ab14106</td>
			<td>Primary antibody, dilute 1 in 250</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">A11007</td>
			<td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:128px;">Abcam</td>
			<td style="width:167px;">ab173003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:627px;">Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:167px;">A21208</td>
			<td>Secondary antibody, dilute 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Phenolic screw cap</td>
			<td style="width:128px;">Wheaton</td>
			<td align="right" style="width:167px;">240408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Benzyl alcohol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:167px;">402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Benzyl benzoate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Imaris</td>
			<td style="width:128px;">Bitplane Imaging</td>
			<td style="width:167px;">image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Image J software</td>
			<td style="width:128px;">NIH</td>
			<td style="width:167px;">Freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of coronary vessels in cleared embryonic hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

Come il cuore si sviluppa, il miocardio ventricolare è invaso da cellule endoteliali (EC) da varie fonti, e si forma un plesso vascolare. Le navi che si sviluppano all&#39;interno del miocardio ventricolare andranno a formare le reti capillari e arterie che forniscono sangue ossigenato al cuore del tessuto 18. Allo stesso tempo (circa E11.5) coronaria steli cominciare a sviluppare indipendentemente da una rete capillare separata (noto come plesso peritruncal) che circonda il lume dell&#39;aorta 14,19,20. Peritruncal plesso EC inizialmente forma più connessioni con il lume dell&#39;aorta a livello dei seni valvolari, tuttavia definitiva solo vaso persisterà su ciascun lato della aorta, andando a formare le radici delle arterie coronarie destra e sinistra 21. Dalla intorno E13.5 il peritruncal e ventricolare vasi del miocardio si uniscono per formare una rete interconnessa, permettendo il flusso di sangue dal unorta nei vasi coronarici 14,22. La colorazione di EC con anti-PECAM-1 anticorpi, combinato con BABB liquidazione dei cuori intatti, permette l&#39;analisi delle reti coronariche in via di sviluppo dalle prime fasi possibili. Nelle fasi di sviluppo successive alla patterning delle arterie coronarie in scadenza può anche essere esaminato. Questo metodo può anche essere utilizzato per colorare la vascolarizzazione di embrioni interi (fino a E11.5 almeno), e con differenti anticorpi, per esempio, anti-alfa del muscolo liscio actina (Sm22α) e Endomucin. La figura 1 mostra il massimo di intensità z-proiezioni di un cuore E11.5 generata utilizzando il software Fiji. La funzione Tile stato usato per raccogliere più immagini parziali del cuore ed unirle in un&#39;immagine completa; questo è utile per fornire un quadro della colorazione nell&#39;intero campione. A questo anticorpo fase PECAM1 macchie principalmente il rivestimento endocardica del cuore e deflusso vessels, tuttavia alcuni EC può anche essere osservato nella parete ventricolare sinistra (regione scatola in figura 1A, mostrata ingrandita in 1A &#39;). Inoltre, il plesso peritruncal possono essere osservati chiaramente nella parete del tratto di efflusso (OT) (regione scatola nella Figura 1B). In quest&#39;ultimo caso, la riduzione del numero di fette nel z-stack utilizzato per generare la proiezione migliorata la chiarezza dell&#39;immagine, consentendo i collegamenti con il lume dell&#39;aorta da visualizzare più distintamente (Figura 1B &#39;). In figura 2, l&#39;aumentata vascolarizzazione prossimale all&#39;aorta può essere osservato in un cuore E12.5. La Figura 3 mostra il plesso peritruncal in un cuore E12.5. La z sporgenza 12-fetta in figura 3A mostra l&#39;intero plesso, tuttavia, come alcuni vasi sono localizzate ventralmente al lume dell&#39;aorta (che è anche fortemente colorate con anticorpo anti-PECAM1), dividendo la z-stack into una serie di sotto-cataste (Figura 3B-D) fornisce ulteriori informazioni visive. Per esempio, la sotto-mazzetta proiettata nella Figura 3B mostra una nave peritruncal collegamento alla superficie ventrale del lume aortico, che non è visibile nella piena proiezione. La figura 4 mostra una parte di un cuore E15.5; le arterie coronarie sono chiaramente visibili in questa fase (Figura 4A, proiezione 30-slice). Nei 5 slice z proiezioni mostrate nelle figure 4B e C le valvole aortica e polmonare possono anche essere visualizzati da PECAM1 colorazione; i rami e le interconnessioni della rete capillare coronarica sono anche più chiaro in queste proiezioni sub-stack più piccoli. Tecniche di segmentazione manuale sono state utilizzate per evidenziare le arterie coronarie utilizzando Fiji (Figura 4D) o Imaris (Figura 4D ed E). Il volume rendering 3D della superficie delle arterie coronarie / lume aortico u generaticantare Imaris può essere visualizzato con o senza il sistema vascolare circostante (Figura 4E e F). La vascolarizzazione degli embrioni interi può anche essere esaminata usando PECAM1 colorazione / BABB spazio. Figura 4A e A &#39;, mostrano z proiezioni generati dal sotto-cataste dal lato destro (z fette 11 - 65) e sinistra (z fette 66-110) dell&#39;embrione, rispettivamente. Il confronto delle due immagini mostra che l&#39;intensità del segnale fluorescente non diminuiva significativamente con maggiore penetrazione nel tessuto. Nella Figura 4B, PECAM1 (segnale rosso) e Endomucin (segnale verde) anticorpi sono stati combinati per etichettare le arterie intersomitic (ISA) e le vene, rispettivamente, di un embrione E11.5. La figura 4C mostra SM22α (segnale rosso) e PECAM1 colorazione (segnale verde) di ISA in un embrione E11.5. In figura 6, embrioni E11.5macchiato con PECAM 1 sono stati ripresi subito dopo BABB gioco (Figura 4A), oppure dopo un intervallo di circa due mesi (Figura 4B). Il segnale fluorescente era ancora abbastanza forte da un&#39;immagine con successo dopo conservazione prolungata del campione in BABB. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig1.jpg" /> Figura 1. Immunocolorazione di un cuore E11.5 con Anti-PECAM1 anticorpo (rilevato con anti-topo IgG coniugato Alexa 594). (A, B) un&#39;immagine di 2 x 2 piastrellato stati raccolti usando l&#39;obiettivo 10X di un microscopio confocale invertito. anticorpo colora PECAM1 sia endocardici ed ECS vascolare. Le proiezioni (intensità massima) sono stati generati da 22 (A) o 5 (B) z fette ciascuno di 4 micron di spessore, utilizzando il software Fiji. A &#39;e B&#39; sono enlargements delle aree in scatola, rispettivamente A e B. Frecce in A &#39;indicano i vasi sanguigni nella parete del ventricolo; in B &#39;, la staffa indica il plesso peritruncal. OT, tratto di efflusso; LV, ventricolo sinistro, RV ventricolo destro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barre di scala in A e B = 200 micron; barre di scala in A &#39;e B&#39; = 100 micron. Pannello 1B &#39;è stato adattato da Ivins et al. 2015 19. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig2.jpg" /> Figura 2. Immunocolorazione di un cuore E12.5 con Anti-PECAM1 anticorpo. Pannello A mostra la proiezione az (massima intensità) di una scansione 2x2 piastrelle. La regione in scatola in A è mostrato AMPLIAEd in A &#39;; frecce indicano multipli vasi sanguigni prossimale all&#39;aorta (Ao). LV, ventricolo sinistro, RV ventricolo destro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala in A = 200 micron; barra della scala in A &#39;= 100 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig3.jpg" /> Figura 3. Imaging del plesso Peritruncal in un cuore E12.5. immagini confocale di un dell&#39;aorta E12.5 (Ao) colorati con anticorpo anti-PECAM1 sono stati raccolti utilizzando l&#39;obiettivo 10X. La proiezione z (intensità massima) in A è stata generata da 12 fette z (4 micron di spessore); frecce indicano i vasi del plesso peritruncal. BD Il 12 z fette sono stati divisi in tre sotto-cataste come indicato e usato per generare projecti separataons; frecce indicano connessioni formate dal plesso peritruncal al lume dell&#39;aorta. Vasi Peritruncal localizzate ventralmente al lume dell&#39;aorta sono visibili in B e C. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala = 50 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig4.jpg" /> Figura 4. arterie coronarie e capillare plesso in un cuore E15.5. immagini confocale di un cuore E15.5 macchiato con anticorpi anti-PECAM1 sono stati raccolti utilizzando l&#39;obiettivo 10X. Pannello A mostra una proiezione massima intensità z generato da 30 fette z (4 micron di spessore); frecce indicano le arterie coronarie destra e sinistra (LCA e RCA) che si possono vedere il collegamento con l&#39;aorta (Ao). utilizzando different 5 z fetta sub-impila le valvole aortica e polmonare (AOV e PV) possono essere visti rispettivamente (parentesi blu) in B e C. Il capillare del plesso ventricolare è anche più chiaro in queste proiezioni sub-stack più piccoli; vasi sanguigni prossimali alla valvola polmonare (piccola scatola) sono mostrati allargato in basso a destra del pannello C (grande scatola). Fiji è stato utilizzato per evidenziare i vasi sanguigni individuali, ad esempio, per il pannello D il / strumento lazo colpo è stato utilizzato per riempire le arterie coronarie con il colore rosso manualmente in ogni z fetta prima di proiezione. Software Imaris è stato utilizzato per creare immagini in 3D delle arterie (rosso) e lume aortico (verde) in E e F; ancora una volta questo è stato fatto manualmente, utilizzando lo strumento bacchetta magica per creare contorni degli oggetti in ogni z fetta. L&#39;opacità del volume circostante può essere modificata nel modalità di fusione, come in E. In alternativa, l&#39;immagine 3D può essere estratto, come illustrato in F </sTrong&gt;. LV, ventricolo sinistro. Tutte le immagini sono viste frontali. Barra di scala in A = 100 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig5.jpg" /> Figura 5. Imaging di embrionali Vasculature. Pannelli A e A &#39;mostrare immagini confocale di un E10.5 embrione wild type macchiato con anticorpi anti-PECAM1, raccolti con l&#39;obiettivo 10X (scansione piastrelle). Intensità media z proiezioni sono stati generati da z fette 11-65 (A) e 66-110 (A &#39;) di una scansione fetta 120 z (4 micron fette spesse), mostrando solo una leggera perdita di intensità di fluorescenza attraverso lo spessore dell&#39;embrione . Pannello B mostra i vasi intersomitic di un embrione E11.5 colorati con gli anticorpi<html> i contro PECAM1 (segnale rosso da anticorpo secondario 594-coniugato) e Endomucin (EMCN, segnale verde da anticorpo secondario 488-coniugato), che macchiano le arterie intersomitic (freccia) e vene (punta di freccia), rispettivamente (media intensità z proiezione da un piastrellato scansione). Pannello C mostra arterie intersomitic (ISA) da un E11.5 embrione wild type macchiato con anticorpi contro PECAM1 (segnale verde da anticorpo secondario 488-coniugato) e SM22α (segnale rosso da anticorpo secondario 594-coniugato). immagini confocale sono stati raccolti utilizzando l&#39;obiettivo a secco 20X e utilizzati per generare il massimo proiezioni intensità z. Tutte le immagini sono viste sagittali. Barre di scala in A e B = 250 micron, bar scala C = 100 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> d / 54800 / 54800fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. I campioni immunostained sgomberati a Babb Conservare segnale fluorescente per almeno due mesi. embrioni E11.5 sono state colorate con l&#39;anticorpo PECAM1 e liquidati con BABB; embrioni dello stesso lotto sono stati ripresi immediatamente o dopo un intervallo di due mesi. Pannello A mostra le arterie intersomitic dell&#39;embrione imaged immediatamente e il pannello B mostra l&#39;embrione ripreso due mesi più tardi. immagini confocale sono stati raccolti utilizzando l&#39;obiettivo a secco 10X e utilizzati per generare il massimo proiezioni intensità z. dAO, aorta dorsale. Immagini mostrano viste sagittali. Barre di scala in A e B = 100 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts at JoVE.com

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Vi presentiamo un protocollo per l&#39;analisi dei vasi coronarici, in tutto cuori murini embrionali fino a E15.5, usando metodi di colorazione immunologici standard, seguiti da gioco ottica e la microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione dei vasi sanguigni durante tutto cuore senza la necessità di analizzare tempo di sezioni seriali.

Analisi dei vasi coronarici in sgomberati cuori embrionali

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

analysis-of-coronary-vessels-in-cleared-embryonic-hearts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Views.  UCL Institute of Child Health.  Vi presentiamo un protocollo per l'analisi dei vasi coronarici, in tutto cuori murini embrionali fino a E15.5, usando metodi di colorazione immunologici standard, seguiti da gioco ottica e la microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione dei vasi sanguigni durante tutto cuore senza la necessità di analizzare tempo di sezioni seriali. 

Video: Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l&#39;analisi trascrizionale

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Trascrittoma Profiling di<em&gt; In-Vivo</em&gt; Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel<em&gt; C. elegans</em&gt; Linea germinale

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...