Name: longitudinal in vivo imaging of the cerebrovasculature: relevance to cns diseases
Uploaded: 2016-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
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Gli autori vorrebbero riconoscere la Ligue Francaise contre l&#39;épilepsie (a MA-L), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale di Grant AVENIR R12087FS (a FJ), concedere presso l&#39;Università di Montpellier (a FJ) e Grant dalla Federazione pour la Recherche sur le Cerveau (a NM). Riconosciamo l&#39;assistenza tecnica di Chrystel Lafont al IPAM in impianto piattaforma di base imaging in vivo di Montpellier. Ringraziamo anche Mary Vernov (Weill Cornell Medical College) per la correzione del manoscritto.

I topi è consentito l&#39;accesso ad libitum a cibo, acqua, e mantenuti in un ciclo luce-buio di 12 ore. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali da laboratorio conformi alle leggi nazionali ed europee e sono stati approvati dal Ministero dell&#39;Istruzione e della Ricerca Scientifica (CEEA-LR-00.651-01) francese. Un totale di 6 transgenici 5xFAD e topi di controllo 4 littermate tipo selvatico (WT) sono stati utilizzati per questa procedura. Preparazione 1. Pre-operatorio <ol><li> Intraperitoneale (IP) iniettare Metossi-X04 (10 mg / kg) 48 ore prima dell&#39;intervento chirurgico per etichettare depositi Ap 11. </li><li> Preparare sterile del liquido artificiale cerebrospinale (aCSF) (120 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mm MgCl2, 10 mM glucosio, bolla con il 95% O 2/5% di CO 2 prima aggiungendo 2.5 mM CaCl 2). </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici (forbici, pinze, lama di rasoio e bit trapano), con autoclave o uno sterilizzatore a caldo tallone prima asetticachirurgia. </li><li> Pulire la panca e il microscopio piastra chirurgica con il 70% di etanolo e coprire con un panno assorbente pulito. </li><li> Iniettare ketamina / xilazina (75 mg / kg e 10 mg / kg, rispettivamente) e il ketoprofene analgesico (2,5 mg / kg) IP. </li><li> Controllare il livello adeguato di anestesia con la zampa o di coda pizzichi. </li><li> Applicare sterili pomata oftalmica per gli occhi e accorciare il pelo (naso per le orecchie), evitando i baffi. Una crema depilatoria può essere utilizzato fintanto che è seguito da risciacquo con acqua accuratamente per evitare irritazioni della pelle. Accorciare il pelo rimanente con una lama di rasoio. Sterilizzare la pelle con soluzione antisettica iodopovidone. </li><li> Posizionare il mouse sotto il microscopio binoculare e fare una incisione cutanea dalle orecchie al naso. Tirare la pelle lateralmente per esporre il cranio. Incidere il periostio e ripetutamente lavare il cranio con sterili aCSF per fermare eventuali sanguinamenti. </li></ol> 2. Vasculature Etichettatura e diluito SkullFinestra Preparazione (40 min) <ol><li> Rimuovere l&#39;unguento occhio con una punta di cotone. Applicare una goccia di anestetico topico oftalmico (tetracaina 1%) e la pressione delicatamente la pelle intorno alla cavità oculare per raggiungere la sporgenza. </li><li> Iniettare fluoresceina isotiocianato (FITC) coniugata con destrano (70 kDa) (100 mg / kg o 50 ml di una soluzione 50 mg / ml; ipodermico insulina) nel plesso retro-orbitale seguendo la procedura descritta da Yardeni e colleghi 12. Applicare sterili pomata oftalmica per gli occhi. </li><li> Assicurarsi che la pelle è ritratto e il cranio è pulita e secca intorno l&#39;area di esposizione selezionata. Applicare una piccola quantità di colla cianoacrilato attorno alla finestra della testa montare il dispositivo (comprensivi di lamette impilati, vedi Figura 1), e colla intorno alla regione bersaglio applicando una leggera pressione per alcuni secondi 10. </li><li> Tirare le estremità della pelle al bordo della finestra della testa montare il dispositivo, assicurandosi che la zonasecco. Fissare la pelle e il bordo della finestra con una piccola quantità di colla grado cianoacrilico veterinario e attendere secco (Figura 1). </li><li> Fissare l&#39;animale in fase di utilizzo del dispositivo head-mount. Risciacquare con aCSF sterile e assicurare che il pozzo tra la pelle e il dispositivo di testa di montaggio è perfettamente sigillato. Avvolgere il mouse in una coperta di sopravvivenza per mantenere normotermia. </li><li> Eseguire assottigliamento del cranio in soluzione aCSF come descritto in precedenza 10. Si noti che il cuoio capelluto non viene completamente rimosso. Regolarmente cambiare il aCSF per eliminare i residui di osso e per evitare il surriscaldamento dei tessuti. Qualsiasi detriti osso residuo può essere rimosso con sbuffi d&#39;aria brevi. La soluzione aCSF attenua le vibrazioni create dalla foratura. NOTA: Lo spessore del mouse cranio varia da 80 a 150 micron a seconda dell&#39;età dell&#39;animale e la regione di interesse. </li><li> Utilizzando un trapano dentale (a velocità media e una fresa 0,7 mm) avviare diradamento la superficie del cranio in un&#39;area 1.0 mm di diametro con un normale movimento verticale parallelo al cranio e rimuovere la maggior parte dell&#39;osso spugnoso (primo 40 - 70 micron). ricordarsi di sostituire aCSF ogni 20-30 secondi e limitare la perforazione ininterrotta a 3-4 sec. Si noti che l&#39;osso vicino a punti di sutura è altamente vascolarizzato. Applicare aCSF presoaked Gelfoam per fermare eventuali emorragie. </li><li> Utilizzare una lama di microchirurgia oftalmica usa e getta tagliente per continuare con l&#39;assottigliamento del cranio, facendo attenzione a non applicare una pressione eccessiva. La regione finale è di circa 0,5 mm di diametro, con uno spessore di 20 - 35 micron. NOTA: A causa di ricrescita ossea e cicatrici, è necessario ulteriormente sottile finestra ad ogni sessione di imaging. </li></ol> 3. microscopia a due fotoni (45 min) <ol><li> Se necessario, iniettare con 19 mg / kg di ketamina per mantenere un&#39;adeguata anestesia. </li><li> Trasferire il mouse (fissato alla fase headmount) al microscopio laser a due fotoni. Utilizzando un immersione in acqua obj 20Xcace con un&#39;apertura numerica di 1,0, individuare la finestra del cranio assottigliata al centro del campo ottico utilizzando la lampada epi-fluorescenza. Assicurarsi che l&#39;obiettivo è sempre immerso in aCSF. </li><li> Inizia scansione laser con una modalità bloccata laser pulsato (Ti-zaffiro 680-1040nm). Impostare lunghezza d&#39;onda di eccitazione a 750 nm rispettivamente per rilevare la fluorescenza emessa del metossi-XO4 e FITC-destrano nei canali blu e verde. NOTA: Il microscopio è dotato di due divisori di fascio a 506 nm e 555 nm. La luce blu viene catturato da un rivelatore NDD dotata di filtro 470 ± 12 nm. La luce verde è catturata da un rivelatore GaAsP alta sensibilità dotato di filtro nm 525 ± 25. La potenza del laser massima emessa dal obiettivo non deve superare i 10 mW per evitare danni ai tessuti indotta da laser. </li><li> Acquisire una pila basso ingrandimento (500 micron x 500 micron, 512 x 512 pixel; 2 micron) a passo uno zoom 0,7X numerica per creare una mappa 3D per la precisa rilocalizzazione del ROIin momenti successivi. </li><li> Acquisire un mosaico di 4 immagini digitali ad alta ingrandimento con uno zoom 2X numerico (200 micron x 200 micron, 512 x 512 pixel; 1 micron passo). Utilizzando il software di imaging spostare la finestra in 200 micron passi per catturare tutte le regioni. Profondità di pile è tipicamente di 250 micron, a partire dalla superficie piale in ogni immagine del mosaico. </li><li> Prima di rimuovere il mouse dal microscopio, scattare una foto o fare una mappa 2D del sistema vascolare piale per il futuro rilocalizzazione del campo dell&#39;imaging disegnati a mano. </li></ol> 4. Recupero e Re-Imaging <ol><li> Rimuovere il dispositivo head-montaggio applicando una trazione mentre si tiene il cranio sotto. Se la colla rimane attaccato al cranio o la pelle, raschiare fuori con attenzione con una pinza sottile. Suturare la cute e posizionare il mouse in una gabbia riscaldata per monitorare il recupero dall&#39;anestesia prima di tornare alla gabbia a casa. Applicare crema antibiotica topica alla sutura e iniettare ketoprofene (2,5 mg / kg) IP i seguenti 2 giorni. </li><li> Ripetere i passaggi 1,1-2,5 per le sessioni di imaging ripetuti. Se necessario, radere l&#39;osso con una lama microchirurgica per garantire la qualità ottimale dell&#39;immagine. NOTA: assottigliamento supplementare con il trapano dentale può essere necessaria quando l&#39;intervallo tra le sessioni di imaging è più di un mese. </li><li> Posizionare il mouse sotto il microscopio a luce epifluorescente secondo la mappa 2D del sistema vascolare piale preso dalla sessione precedente (punto 3.6). </li><li> Inizia scansione laser a due fotoni e regolare palco microscopio per raggiungere l&#39;allineamento su scala micrometrica utilizzando la mappa 3D ottenuto nel passaggio 3.4. Procedere al immagini dettagliate come descritto al punto 3.5. </li></ol> 5. post-acquisizione tridimensionale ricostruzione e Image Analysis <ol><li> Ottenere ricostruzioni tridimensionali del sistema vascolare e le deposizioni amiloide utilizzando il software di analisi delle immagini 3D, come Imaris (versione usata 8.0 e 7.7.2). </li&gt; <li> Utilizzare il plug strato Normalize dal menu di elaborazione delle immagini e il cambiamento sottomenu contrasto per ottenere contrasto ideale dei due canali in tutta la profondità della pila. </li><li> Aprire le immagini dalla stessa regione in tutti i tempi e allo stesso tempo sempre elaborarli in parallelo al fine di confrontare i diversi punti di tempo. </li><li> vasi traccia utilizzando il modulo filamento tracciante. <ol><li> Fare clic sull&#39;icona del filamento di creare un nuovo filamento, salta il tracciante automatico e scegliere il metodo di auto-percorso. </li><li> Assicurarsi che il canale selezionato corrisponde all&#39;immagine vascolare e utilizzando la funzione di selezione del puntatore, cliccare una biforcazione vaso che si conserva attraverso le sessioni di imaging Tenendo premuti i tasti Maiusc + Ctrl per stabilire un punto di partenza. Utilizzare la funzione di selezione del puntatore e fare clic tenendo premuto il tasto shift per selezionare i punti finali dei filamenti. NOTA: Il confronto del ottescheletri NED mostreranno cambiamenti strutturali del sistema vascolare. </li></ol></li><li> Eseguire piano dall&#39;analisi aereo per tracciare nuove placche. Applicare modulo di superficie per il canale blu per il monitoraggio della crescita delle placche Ap. Fare clic sull&#39;icona di superficie per creare una nuova superficie e procedere con la creazione di superfici automatizzato. Utilizzare il metodo soglia per impostare e sottrarre il segnale di fondo. Il menu delle statistiche fornisce dati relativi alla superficie dei singoli depositi di amiloide. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

La tecnica aperta cranio in vivo microscopia a due fotoni offre il vantaggio di sessioni di imaging illimitate di grandi campi di imaging 13,14. Tuttavia, questa tecnica produce anche infiammazione nella regione di interesse 14, spesso incompatibili o impatto neuro-vascolari read-outs 15. Al contrario, la tecnica cranio transcranial assottigliata non comporti neuro-infiammazione, permettendo l&#39;imaging affidabile delle strutture cerebrovascolari e accumulo di placca 10,14. Un secondo vantaggio presentato da questa tecnica è che il tasso di successo finestra assottigliato-teschio può arrivare fino al 80% al 90% per un manipolatore esperto. Una battuta d&#39;arresto importante per il successo è la mancanza di apprezzamento di spessore osseo che porta al diradamento eccessivo e frattura finale; esperienza ed eccellenti ottica del microscopio binoculare limiteranno questo problema. Un certo numero di limitazioni incidono questa tecnica però. Innanzitutto, la profondità imaging è co limitatampared alle procedure di open-cranio. In secondo luogo, nel tempo, il tessuto cicatriziale che ricopre l&#39;osso può diminuire la qualità dell&#39;imaging transcranica. In terzo luogo, è difficile procedere a più di 4 sessioni di imaging dato che il cranio deve essere diluito un po &#39;più ad ogni sessione. Pertanto, è importante determinare il numero di sessioni di imaging all&#39;inizio di un esperimento, per ottimizzare l&#39;incremento diradamento tra le sessioni. In alternativa, una finestra transcranica cronica costituito da un preparato assottigliato-teschio incollato con un coprioggetti è stata precedentemente descritta per limitare la ricrescita del tessuto osseo nel tempo 16. Anche se efficace, abbiamo scoperto che questa tecnica solo ritardato la ricrescita ossea per diverse settimane alla fine di interferire con la qualità, la profondità e la risoluzione subcellulare di immagini quando ri-immagini dopo lunghi periodi di tempo (Margarita, Arango-Lievano e Freddy Jeanneteau, dati non pubblicati). Nonostante i suoi limiti, a due fotoni microsc transcranicaopy attraverso preparati cranio assottigliate ripetuti è un metodo di scelta per tenere traccia marcatori fluorescenti in modelli di malattia cronica in cui si verificano cambiamenti neuro-vascolare e l&#39;infiammazione. Un assottigliamento ottimale del cranio rappresenta un importante passo tecnica, la pressione applicata alle ossa dovrebbe essere minimizzato per evitare il sanguinamento e garantire una finestra cranio piatto. Sanguinamento e una finestra cranio irregolare può facilitare cicatrici e la ricrescita irregolare dell&#39;osso. diradamento eccessiva durante la prima sessione di imaging, surriscaldamento dopo la foratura eccessiva o danni laser può anche compromettere la chiarezza del segnale attraverso la finestra cranio. Questi ultimi problemi possono essere controllati variando periodicamente il mezzo aCSF durante la perforazione, raffreddando la preparazione, foratura intermittente, e usando strumenti puliti taglienti durante la lucidatura l&#39;osso. Ulteriori fasi critiche comprendono (i) la fissazione del cranio alla testa piastra di montaggio per ridurre il movimento associato con la respirazione, (ii) retro-orbitale iniezione e la visibilità affidabile di tutte le navi, (iii) mappatura della regione di interesse per il futuro trasferimento, e (iv) il pre-, per- e assistenza post-operatoria tra le sessioni di imaging. La metodologia riassunto qui consente di studi per valutare l&#39;efficacia e la sicurezza del sistema nervoso centrale farmaci destinati strutture neuro-vascolare, ad esempio, le molecole ridurre o prevenire deposizioni amiloidi nel parenchima cerebrale e sulle navi. Inoltre, longitudinale microscopia a due fotoni del cervello vivente consente il monitoraggio di amiloidogenesi e il suo impatto sulla neurovasculature nelle fasi iniziali di AD, prima della comparsa di deterioramento cognitivo. La mancanza di spazio di grandi placche amiloidi può avere effetti deleteri sul sistema vascolare del cervello, aggravando la malattia fisiopatologia 17. L&#39;avvento di nuovi coloranti vitali fluorescenti di etichettare i corpi di Lewy, synucleopathy, aggregati da prioni, aggregati di huntingtina, supporta futuro raggiungibilità di neurovasculature REMODeling studi durante la progressione di altre patologie neurodegenerative 18. Questa tecnica è adatta a diversi ceppi di topo, che conciliano coloranti (SR101, Metossi-X04, destrani, lectine) e marcatori genetici (thy1YFP, CX3CR1-GFP, NG2-DsRed) per studiare le interazioni cellulari in vivo e in modelli in cui la struttura e la funzione sperimentali del neurovasculature devia dalla fisiologia normale.

Il vascolare cerebrale è una struttura multi-cellulare, che è anatomicamente e funzionalmente accoppiato ai neuroni. Un rimodellamento dinamica dei vasi si verifica durante lo sviluppo del cervello e durante la progressione di patologie del sistema nervoso centrale (CNS) 1,2. E &#39;ampiamente accettato che il danno cerebrale è una caratteristica di molte malattie del sistema nervoso centrale, tra cui l&#39;epilessia, il morbo di Alzheimer (AD), trauma cranico e encefalite 3,4. Pertanto, il rilevamento delle modifiche cerebrovascolari in vivo diventa significativo quando si modellano le malattie del sistema nervoso centrale, dall&#39;esordio e in fasi croniche. Come modifiche cerebrovascolari si verificano spesso in concomitanza con un danno neuronale o la plasticità, l&#39;imaging del neuro-vascolare rappresenta un punto di ingresso chiave per decifrare le malattie del sistema nervoso centrale fisiopatologia. Questo protocollo descrive una procedura basata due fotoni longitudinale per monitorare il rimodellamento della cerebrovasculature in un modello murino diDC, una patologia progressiva caratterizzata da difetti cerebrovascolari su grandi e piccoli vasi di calibro a causa di deposizione della placca amyloidogenic 5-7. Questa procedura permette la visualizzazione dei depositi amiloidi e inseguimento della loro posizione e della crescita rispetto al rimodellamento neurovascolari tutto il corso della malattia. Coloranti fluorescenti vitali vengono iniettati prima di ogni sessione di imaging per la visualizzazione delle cerebrovasculature e amiloide placche in topi transgenici AD 8. Sessioni di imaging ripetute di un ROI attraverso una finestra cranio transcranica assottigliata è non invasiva e il metodo di scelta per valutare il rimodellamento neurovascolare nel cervello di topo vivente 2,5,9,10. La procedura che segue illustra il protocollo chirurgico, acquisizione ed elaborazione delle immagini. La progressione precoce di angiopatia amiloide cerebrale (CAA) per lo più in generale leptomeningeo e arteriole penetranti è caratterizzata.

<table><tbody><tr><td>methoxy-X04</td><td>tocris</td><td>4920</td><td>use 10 mg/kg</td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70 Kda</td><td>sigma</td><td>46945</td><td>use 100 mg/kg</td></tr><tr><td>gelfoam/Bloxang</td><td>Bausch and Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micorsurgical blade</td><td>surgistar</td><td>6900</td><td>must be sharp and not dented</td></tr><tr><td>povidone-iodine</td><td>betadine</td><td></td><td>antisceptic solution</td></tr><tr><td>binocular stereomicroscope</td><td>olympus</td><td>SX10</td><td>optimal image contrast is crucial for this procedure</td></tr><tr><td>2-photon microscope</td><td>zeiss</td><td></td><td>Zeiss LSM 710mp</td></tr><tr><td>fine scissors-toughcut</td><td>Fine science tools</td><td>14058-09</td><td>this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue</td></tr></tbody></table>

longitudinal in vivo imaging of the cerebrovasculature: relevance to cns diseases

Rimodellamento del sistema vascolare cerebrale è un tratto comune di patologie cerebrali. In vivo tecniche di imaging sono fondamentali per rilevare la plasticità cerebrale o danni che si verificano straordinari e in relazione alle attività neuronale o il flusso di sangue. In vivo microscopia a due fotoni permette lo studio della plasticità strutturale e funzionale di grandi unità cellulari nel cervello vivente. In particolare, la preparazione finestra assottigliato-teschio permette la visualizzazione delle regioni corticali di interesse (ROI) senza indurre fenomeni significativi infiammazione cerebrale. sessioni di imaging ripetitivi di ROI corticale sono fattibili, che fornisce la caratterizzazione dei tratti distintivi della malattia nel tempo durante la progressione di numerose malattie del sistema nervoso centrale. Questa tecnica accedere alle strutture piale entro 250 micron del cervello si basa sul rilevamento di sonde fluorescenti codificati da marcatori cellulari genetici e / o coloranti vitali. Questi ultimi (ad esempio, destrani fluorescenti) vengono utilizzati per mappare la luminal comparto delle strutture cerebrovascolari. Germane al protocollo qui descritto è l&#39;uso di un marcatore in vivo di depositi amiloidi, metossi-O4, per valutare il morbo di Alzheimer progressione (AD). Abbiamo anche descrivere l&#39;elaborazione delle immagini post-acquisizione utilizzato per tenere traccia delle modifiche vascolari e deposizioni amiloidi. Pur concentrandosi attualmente su un modello di AD, il protocollo descritto è rilevante per altri disturbi del sistema nervoso centrale in cui si verificano cambiamenti patologici cerebrovascolari.

Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione del cerebrovasculature e depositi di amiloide straordinari. Coloranti fluorescenti sono state iniettate per etichettare deposizioni amiloide (metossi-XO4) 11 e per riempire il lume cerebrovascolari (FITC-destrano) 1. I moduli software di analisi delle immagini in 3D sono stati usati per creare immagini in 3D di un campo costante di vista catturati in momenti successivi. Immagini rappresentative ottenute nella corteccia somatosensoriale di topi 5XFAD 5 (modello genetico di AD) mostrano che i depositi più Ap appaiono tra 3 e 4 mesi di età, in crescita nel parenchima (Figura 2) e vasi intorno penetranti (Figura 3). Deposizione Plaque avviene simultaneamente rimodellamento significativo ed occlusione occasionale della cerebrovasculature vicina (Figura 2). Sono stati osservati soltanto rari casi di riduzione delle dimensioni della placca, indicando che questo è un processo di placca un<html> ccumulation. Le figure 2 e 3 illustrano che il carico amiloidogeniche nel parenchima e attorno ai vasi è associata con l&#39;angiogenesi e occlusione vascolare nella corteccia somatosensoriale. Il rapporto tra placche amiloidi vascolari e occlusione nave rimane poco chiaro, dato che le placche più vascolari accumulate su grandi arterie penetranti, mentre l&#39;occlusione avvenuta per lo più a piccoli vasi di calibro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54796/54796fig1.jpg" /> Figura 1. setup sperimentale. Impostazioni (A) Capo; Stage è su misura. Supporto capo dispositivo è costituito da lame di rasoio impilati costruiti come descritto in precedenza 10. (B) Veduta del mouse bloccato nella testa dispositivo di montaggio. (C) Veduta del dispositivo e pelle incollati al cranio. I bordi sono centrate sulla regione di destinazione.s / ftp_upload / 54796 / 54796fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54796/54796fig2.jpg" /> Figura 2. Confronto di due ricostruite immagini del microcircolo e amiloide Deposizioni su un mouse 5xFAD a 4 e 5 mesi di età. placche amiloidi sono indicate con un asterisco bianco, nuove placche che appaiono a 5 mesi sono contraddistinte da un asterisco giallo. Un raro esempio di riduzione della placca è indicata con un asterisco arancione microvasi recente formazione sono indicate con una freccia gialla mentre occlusione vascolare è indicato con una freccia rossa. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54796/54796fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54796/54796fig3.jpg"/&gt; Figura 3. Le navi di grandi dimensioni e di piccolo calibro nella corteccia somatosensoriale a 3, 4 e 5 mesi di età. (A) La crescita dei depositi di amiloide vascolari su navi di grandi dimensioni calibro (asterischi bianchi). Placche (B) amiloidi possono essere osservati anche su piccoli vasi calibro (asterischi gialli). Le frecce rosse indicano vasi occlusi. asterischi bianchi indicato in crescita placche amiloidi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54796/54796fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Questo manoscritto descrive una procedura per monitorare il rimodellamento del cerebrovasculature durante accumulo di placca amiloide in vivo utilizzando longitudinale microscopia a due fotoni. Una preparazione assottigliato-teschio consente la visualizzazione di coloranti fluorescenti per valutare la progressione del danno cerebrale in un modello murino della malattia di Alzheimer.

Longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del Cerebrovasculature: Rilevanza per le malattie del sistema nervoso centrale

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

7.1K Views.  Institute of Functional Genomics.  Questo manoscritto descrive una procedura per monitorare il rimodellamento del cerebrovasculature durante accumulo di placca amiloide in vivo utilizzando longitudinale microscopia a due fotoni. Una preparazione assottigliato-teschio consente la visualizzazione di coloranti fluorescenti per valutare la progressione del danno cerebrale in un modello murino della malattia di Alzheimer. 

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A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Ricerca

Medicina

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Non invasiva parenchimale, vascolare e metabolica ad alta frequenza ad ultrasuoni e fotoacustico Rat profonda Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Neuroscienze

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

Laterale cronica cranica finestra Preparazione Attiva<em&gt; In Vivo</em&gt; Condizioni seguito distale Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale nei topi

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivo Duo-colore metodo di Imaging vascolare dinamica dopo la lesione del midollo spinale contusivi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Immunologia e infezioni

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application to elucidate capillary blood flow effects during seizures, driven by mural cells. In vitro and in vivo cortical imaging have shown that capillary constrictions driven by pericytes can result from functional local neural activity, as well as from drug application, in healthy animals. Here, a protocol is presented on how to use pCLE to determine the role of microvascular dynamics in neural degeneration in epilepsy, at any tissue depth (specifically in the hippocampus). We describe a head restraint technique that has been adapted to record pCLE in awake animals, to address potential side-effects of anesthetics on neural activity. Using these methods, electrophysiological and imaging recordings can be conducted over several hours in deep neural structures of the brain.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Whereas multiphoton imaging is only effective at limited depths from the tissue&#8217;s surface, it is possible to achieve 3 &#181;m resolution imaging at any depth via pCLE. Here, we present a protocol to conduct pCLE imaging to measure microvascular dynamics in the hippocampus of ictal and wild-type mice.

Endomicroscopia confocale confocale a scansione laser accoppiata a fibre in vivo (pCLE) dei capillari dell'ippocampo in topi svegli

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

A Needle Model for Vascular Cognitive Impairment Studies in Mice

A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis

Vascular cognitive impairment and dementia (VCID) results from vascular brain injury. Given VCID&#39;s high incidence, which is expected to continue rising as the population ages, it is critical to establish a robust animal model for the disease. This paper presents a novel method of creating a mouse model of VCID that is based on asymmetric bilateral common carotid artery stenosis, which mimics human chronic cerebral hypoperfusion caused by carotid atherosclerosis.
Briefly, common carotid arteries (CCAs) are ligated to different gauge needles (32 G for the right CCA and 34 G for the left CCA) using 7-0 silk sutures followed by immediate needle removal. The remaining suture rings cause persistent blood flow reduction and long-term cognitive impairment associated with white matter injury, microinfarcts, and reactive gliosis, thus closely mimicking the pathogenesis of VCID. Importantly, in this needle model, the clinical representations do not revert with time, providing reliable long-term cognitive impairment. Moreover, the survival rate 24 weeks post surgery was 81.6%, which is higher compared to the other established models of VCID with a similar level of blood flow reduction.
Additional advantages include low material cost and compatibility with MRI to monitor brain injury in live animals since no metal is implanted. The main challenge in employing the needle model of VCID is the requirement for developing advanced surgical skills since mouse CCAs are less than 0.6 mm in diameter and are very fragile. High-quality visual representation of the surgery will thus help researchers to master this technique and advance our understanding of VCID, potentially leading to the development of novel therapeutic modalities to decrease the devastating cognitive decline associated with VCID.

The needle method of asymmetric bilateral common carotid artery stenosis is proposed to create a mouse model for vascular cognitive impairment and dementia. It results in longer-term outcomes compared to previously established models and is compatible with live MRI. Visual representation demonstrating the procedure provides guidance for mastering the surgery.

Vascular cognitive impairment and dementia (VCID) results from vascular brain injury. Given VCID&#39;s high incidence, which is expected to continue ...

Longitudinale

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