Ringraziamo Wendy salmone e Nicki Watson della struttura Keck al Whitehead Institute del MIT per l&#39;imaging.

1. Preparazione di DC2.4 e RAW 264.7 cellule Lines NOTA: La linea cellulare di macrofagi come RAW 264.7 e la linea di cellule dendritiche DC2.4 sono sia di origine murina, e le seguenti condizioni sono stati usati per far crescere le cellule. <ol><li> Grow RAW 264.7 cellule in DMEM (Minimal mezzo di Eagle Dulbecco) supplementato con 10% inattivato siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. </li><li> Crescere le cellule DC2.4 in condizioni simili a quello di RAW 264.7 cellule, tranne l&#39;uso di media RPMI (Roswell Park Memorial Institute) integrata con L-glutammina, invece di DMEM. </li></ol> 2. Preparazione di coniugati fluorescenti Particolato: Beads C. albicans, Zymosan, IgG-rivestite <ol><li> Crescere Candida albicans <ol><li> Seminare C. albicans ceppo SC5314 da uno stock di glicerolo congelato in 25 ml di YPD integrato con Uri (2% Bacto-peptone, 1%estratto di lievito, 2% di glucosio e 80 ug / ml di uridina) notte a 30 ° C. NOTA: Evitare che cresce la cultura Candida più di un OD 600 del 12. </li><li> Prendere 1 ml di C. albicans e spin giù a 2.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con 1 ml di PBS. </li><li> Raccogliere il pellet per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere il punto 2.1.4. </li><li> Calcolare la molteplicità di infezione (MOI) di C. albicans in relazione al numero dei fagociti e procedere con il test fagocitosi come descritto nella sezione 3. Una OD 600 del 1 è equivalente a 2,5 x 10 7 Candida albicans per 1 ml. NOTA: Generazione di Candida-BFP è descritto in riferimento 13. </li></ol></li><li> Preparazione di Zymosan e perline IgG-rivestite NOTA: Zymosan è un β-glucano contenentifungine preparazione carboidrati particolato derivato da Saccharomyces cerevisiae. Zymosan è noto per evocare segnali infiammatori in macrofagi e cellule dendritiche, ed è stato ampiamente utilizzato in studi fagocitosi 13, 14, 15. <ol><li> Brevemente vortice la provetta contenente il particolato, e un&#39;aliquota una quantità sufficiente per un esperimento in una provetta da 1,5 ml. NOTA: in genere usiamo rapporto 1:10 (per una cella, aggiungere 10 particelle zymosan o perline IgG-rivestite). </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS freddo ghiaccio, e raccogliere le particelle mediante centrifugazione per 1 min a 10.000 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS ghiacciato. </li><li> Ripetere i punti 2.2.2-2.2.3 NOTA: Passare al punto 2.2.5 o conservare il tubo a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sonicare particolato per 10 sec a ultrasuoni bagno sonicatore (120 V, 50-60 kHz) per evitare unaggregazione delle particelle NY. </li></ol></li></ol> 3. fagocitosi NOTA: La fagocitosi è un processo complesso che inizia con il legame delle particelle sulla superficie cellulare dei fagociti attraverso l&#39;interazione di PRRs con ligandi sulla superficie della particella. Binding è seguito dal montaggio di actina e le sue proteine ​​associate al sito di contatto, e la formazione di una tazza fagocitaria. Il successivo smontaggio actina avviene al phagosome e provoca la engulfment completo del particolato. Di seguito si descrivono le varie fasi della fagocitosi. <ol><li> binding Assay NOTA: Lo scopo di questo esperimento è quello di monitorare il primo passo di fagocitosi che coinvolge l&#39;interazione tra i ligandi sulle particelle indicativi ei recettori sulle fagociti. <ol><li> Seme circa 5 x 10 4 cellule in una diapositiva camera in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell&#39;esperimento. Alterntivamente, le cellule piastra su vetrini (in 24 o formato a 12 pozzetti) o piastre a 96 pozzetti con fondo di vetro. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2. NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o una tecnica simile. </li><li> Posizionare il vetrino camera (o piastra) a 10 ° C per 10 min. </li><li> Rimuovere delicatamente il supporto da ciascun pozzetto con una pipetta o di aspirazione. ATTENZIONE: Eseguire questo passaggio attentamente ciascun pozzetto di un sistema coprioggetti camerata è piccolo; è facile per perturbare le cellule con la punta di una pipetta o un forte flusso d&#39;aria di un aspiratore. </li><li> Mescolare le polveri fluorescente con un mezzo di coltura cellulare (preparato come descritto sopra). Aggiungere Candida -BFP (ad una MOI di 10), fluorescenza coniugato-zymosan o lattice perline-rabbit IgG-FITC (10 particelle per cella) alle cellule. Utilizzare un volume finale di 200 microlitri mezzi per una camera bene a garantire tutte le cellule sono coperti. </li><li> Spin giù la diapositiva da camera presso 277xg per 3 min a 10 ° C. NOTA: Questo passaggio centrifugazione contribuisce ad aumentare il contatto tra le particelle e le cellule, e sincronizza il processo di associazione. </li><li> Trasferire immediatamente il vetrino camera ad un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2 per 5 min. </li><li> Rimuovere il vetrino da camera dal termostato e aspirare i media. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con PBS ghiacciato. NOTA: controllare la presenza di particelle non legate con un microscopio ottico e lavare più volte con PBS, se necessario. È essenziale per rimuovere le particelle non legate dal pozzo per minimizzare il rumore di fondo durante l&#39;analisi. </li><li> Fissare cellule aggiungendo 500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) diluito in PBS incubando per 30 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Questo passaggio richiede l&#39;utilizzo di PFA 4% che è altamente tossico, corrosivo, e il potenziale carcinogeno. Una corretta si deve usare cautela quando si usa questo liquido. Inoltre, proteggere i campioni dalla luce. </li><li&gt; Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 500 ml di PBS nella camera e aspirare lentamente la soluzione. </li><li> Ripetere 3.1.9 passo due volte. NOTA: A questo punto, riempire ogni flacone immediatamente dopo la rimozione della precedente PBS. </li><li> Arrestare il fissaggio mediante incubazione con 500 pl di 50 mM NH 4 Cl in PBS per 10 min. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS come descritto al punto 3.1.10. </li><li> Permeabilize cellule aggiungendo 250 microlitri tampone di legame (0,1% saponina, 0,2% BSA in PBS) per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Stain F-actina aggiungendo fluorescente falloidina coniugato (diluito 1: 500 in tampone vincolante). Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS come descritto al punto 3.1.10. </li><li> Catturare immagini utilizzando un microscopio confocale (obiettivo 63X e 402 nm e 488 nm laser) e analizzare le immagini utilizzando ImageJ 16. NOTA: legame Una particella successo è caratterizzato dalla presenza di un cu fagocitariap nel luogo dove il contatto particolato cellula fagocitica (Figura 1). Vedere il punto 3.2.5. </li></ol></li><li> Fagocitosi assorbimento Assay NOTA: Questo esperimento è stato progettato per monitorare l&#39;internalizzazione completa di particelle etichettate fluorescenza dai fagociti utilizzando la microscopia confocale (Figura 2). <ol><li> Seme circa 5 x 10 4 cellule in una diapositiva camera in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell&#39;esperimento. In alternativa, le cellule piastra su vetrini (in 24 o formato a 12 pozzetti) o piastre a 96 pozzetti con fondo di vetro. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2. NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o una tecnica simile. </li><li> Conservare le diapositive camera (o piastra) a 10 ° C per 10 min. NOTA: raffreddamento è necessario al fine di bloccare l&#39;endocitosi e fagocitosi indesiderate, e successivamente ad una fagocitosi sincronizzato. </li><li> Perfpassi ORM da 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Trasferire il vetrino camera ad una 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2, e incubare per diversi tempi. Fix cellule dopo l&#39;infezione 30, 60 e 90 min dopo. Osservare C. albicans iniziano a formarsi ife a livello post infezione 60 min; fagociti cominciano a mostrare la morte cellulare (pyroptosis) dopo 90 min 8. NOTA: Questa è una raccomandazione e ottimizzazione è essenziale a seconda del tipo di cellula e del particolato utilizzato. </li><li> Eseguire i passaggi da 3.1.7 a 3.1.15. Analizzare le immagini utilizzando ImageJ 16. NOTA: un assorbimento successo è caratterizzato da una interiorizzazione completa di particolato all&#39;interno del citoplasma di un fagociti (Figura 2). Colorazione fagociti con pennarello superficie cellulare come falloidina contribuisce a delineare il contorno delle cellule. È anche essenziale per eseguire z-stack per determinare se il particolato è destinata a superficie cellulare o completely interiorizzato. </li></ol></li><li> Immagini dal vivo della fagocitosi NOTA: In questo protocollo si descrive l&#39;utilizzo di microscopia confocale per catturare le diverse fasi della fagocitosi utilizzando zymosan fluorescente coniugato. Usiamo la linea di cellule dendritiche DC2.4 che esprime stabilmente mCherry-tag F-actina 8, un biosensore che mostra la distribuzione di actina filamentosa nelle cellule viventi. Poiché fagocitosi è un processo actina-driven vivo imaging in questa cella non solo permette di catturare il movimento e la dinamica di rete F-actina, ma anche di visualizzare i diversi eventi fagociti all&#39;interno delle cellule viventi (Figura 3, Film 1). <ol><li> Seme circa 5 x 10 4 cellule in una diapositiva camera ad una concentrazione in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell&#39;esperimento. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2. NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o untecnica simile. </li><li> Mantenere i vetrini camera su ghiaccio per 10 min. NOTA: raffreddamento è necessario per bloccare l&#39;assorbimento indesiderato, e di avere una fagocitosi sincronizzato. </li><li> Eseguire i passaggi da 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Pre-riscaldare la fase di microscopio a 37 ° C ed equilibrare la camera con 5% di CO 2. Attendere 30-45 min per la temperatura e la CO 2 si stabilizzi prima di iniziare l&#39;imaging. NOTA: Poiché i CO 2 e temperatura livelli sono critici per la fagocitosi, è importante accendere il riscaldamento del microscopio prima dell&#39;esperimento per equilibrare la camera ambientale. </li><li> Posizionare il vetrino camera contenente le cellule nel contenitore microscopio incubatore equilibrata a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Esibirsi dal vivo di immagini 17, 18. NOTA: Le impostazioni per la potenza del laser (guadagno, pinhole, ecc) può variare a seconda del tipo di the microscopio e sonda fluorescente utilizzati. Pertanto, si consiglia di consultare il manuale del microscopio per la condizione ottimale per la vostra imaging dal vivo 17,18. <ol><li> Utilizzare microscopio confocale a scansione laser (e il relativo software) per l&#39;imaging dal vivo. Utilizzare obiettivo olio 63X 1.4NA con un foro stenopeico di 1-1.1 unità Airy. </li><li> Per avviare l&#39;imaging utilizzato il campo luminoso di trovare una regione rappresentante sul vetrino da camera. Avanti, selezionare il campo facendo clic sull&#39;opzione Posizione sulla software. Per rilevare GFP nella pista 1 usato il set di filtri per 488 nm laser con un divisore di fascio a 582 nm, per rilevare le lunghezze d&#39;onda tra 488 e 582 nm. </li><li> In Pista 2 selezionare un filtro set ottimale per mCherry (RFP) utilizzando un divisore di fascio a 578 nm e rilevare le lunghezze d&#39;onda tra 578 e 600 nm. Utilizzare 488 nm e 578 nm laser con il 50% di potenza laser e un&#39;uscita guadagno di 600-700. Ottenere immagini ogni 30 secondi per un totale di 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Janeway, C. A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition.">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li><li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+during+phagocytosis.">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+macrophage+&amp;#34;probing&amp;#34;+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets.">Dynamic macrophage &amp;#34;probing&amp;#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li><li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes.">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li><li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis.">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li><li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans.">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).</li><li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+cholesterol,+lateral+mobility,+and+the+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin.">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li><li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis.">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li><li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li><li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton's+Tyrosine+Kinase+(BTK)+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages.">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance.">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li><li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages.">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis.">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li><li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering.">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li><li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+host-Leishmania+interactions:+significance+in+visceral+leishmaniasis.">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li><li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii.">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

fagociti professionali, come i macrofagi e le cellule dendritiche, inghiottire e di eliminare gli agenti patogeni d&#39;invasione rendendo quindi la fagocitosi una componente importante del sistema di difesa dell&#39;ospite. Durante questo processo fagociti vengono sottoposti a riorganizzazione membrana e riarrangiamento citoscheletro alla loro superficie cellulare 8, 19, 20. Per comprendere meglio questo processo dinamico, visualizzazione delle varie fasi della fagocitosi è essenziale. Qui abbiamo descritto un metodo microscopio basato utilizzato per monitorare le varie fasi della fagocitosi. Il significato principale della tecnica di imaging in tempo reale è che fornisce notevole capacità di monitorare l&#39;interfaccia host-patogeno a livello molecolare. Consentendo la visualizzazione dei passaggi chiave del infezioni microbiche, l&#39;imaging dal vivo offre una visione critica della natura fondamentale della risposta immunitariacontro i patogeni 8, 10, 21, 22. Oltre alla fagocitosi, le tecniche qui descritte possono essere estese per studiare altri tipi di endocitosi mediata da recettori, compresi macropinocitosi 10. Immagini dal vivo è anche un valido approccio per studiare il rapporto ospite-patogeno dei batteri intracellulari come il Mycobacterium tuberculosis e Salmonella typhi, così come i parassiti, tra cui Leishmania e Toxoplasma gondii 22, 23. Ci sono diversi vantaggi di imaging cellulare dal vivo sulle altre tecniche come gli approcci biochimici convenzionali. L&#39;imaging cellulare dal vivo ci permette di monitorare le dinamiche spaziali e temporali di processi cellulari 8. Inoltre, l&#39;imaging dal vivo permette di acquisire informarezione ad una sola risoluzione cella 21. La fagocitosi è un processo cellulare dinamico che coinvolge il raggruppamento di recettori, actina e lipidi di membrana rimodellamento nel giro di pochi minuti 10. Immagini dal vivo ci permette di acquisire tali informazioni in maniera sensibile il tempo, che altrimenti è difficile da realizzare. La maggiore limitazione di questa tecnica è che richiede un&#39;attenta ottimizzazione delle condizioni sperimentali e configurazioni microscopio. Ci sono diversi fattori chiave indispensabili per ottenere con successo le immagini. Le qualità della proteina fluorescente (o biosensore) utilizzato per visualizzare i fagociti (come F-actina) e la natura del colorante usato per etichettare il particolato sono aspetti critici di imaging. Per l&#39;imaging dal vivo, altrettanto importante è l&#39;equilibrio della camera ambientale della messa a punto microscopio. A seconda dello strumento, l&#39;equilibratura può richiedere da 15 minuti a diverse ore. Since CO 2 di alimentazione ha lo scopo di mantenere un pH adeguato all&#39;interno del terreno di coltura, è necessario consentire abbastanza tempo di esecuzione prima di iniziare l&#39;esperimento. Nel caso in cui l&#39;alimentazione di CO 2 è insufficiente e / o irregolare, zwitterionici organica agente tampone HEPES chimico come potrà essere integrata per i mezzi di crescita. L&#39;esposizione a lungo termine di particolato fluorescenti e cellule vive per confocale laser può portare a fototossicità e sbianca. Ottimizzazione potenza del laser (il tempo di esposizione meno il meglio) e fare in modo che le persiane sono chiuse tra le acquisizioni di immagini in grado di ridurre questi problemi. Nel complesso, le tecniche descritte qui sono l&#39;ideale per lo studio della relazione dinamica tra gli agenti patogeni e fagociti durante la fagocitosi.

Nonostante la continua esposizione agli agenti patogeni come batteri, virus e funghi, il nostro corpo è ben attrezzata con sistema immunitario che forniscono protezione contro le infezioni. Il sistema immunitario innato è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori e si basa principalmente su fagociti che riconoscono e interiorizzano obiettivi stranieri. La fagocitosi è un processo cellulare evolutivamente conservato che racchiude il engulfment di particelle indesiderate superiori a 0,5 micron. Fagociti esprimono una vasta gamma di recettori del sistema immunitario (noto anche come recettori pattern recognition, PRR) sulla superficie delle cellule che consentono loro di riconoscere i modelli molecolari associati ai patogeni (PAMPs) presenti sul patogeni prima di engulfment 3. Il legame patogeni è seguito da recettore cluster sulla superficie cellulare e innesca la formazione di una tazza fagocitaria. Ciò si traduce in rimodellamento della membrana actina-driven che sporge in girol&#39;obiettivo, alla fine avvolge e pizzicando-off per formare una discreta phagosomal vacuolo 2, 5. Il phagosome matura poi e acidifica con la successiva fusione con ritardo endosomi e lisosomi che forma fagolisosoma 6. Anche se la fagocitosi è descritto come recettore-mediata e actina-event driven, questo processo si basa anche sulla modifica spazio-temporale dei lipidi che compongono la membrana plasmatica, come fosfoinositidi (PI) e sfingolipidi 7, 8. Mentre polimerizzazione actina è dettato da un accumulo locale fosfoinositolo-4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2) alla base della coppa fagocitica, actina depolimerizzazione dipende dalla conversione di (PI (4,5) P 2 a fosfoinositolo-3,4,5-biphosphate (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Entrambe le modifichesono essenziali come la prima porta a un&#39;estensione di successo del pseudopodi intorno al bersaglio e la Quest&#39;ultimo consente affondamento di particelle nel citoplasma della fagocita 10. Le cellule che hanno la capacità di fagocitare sono o fagociti professionali, come macrofagi / monociti, granulociti neutrofili /, e le cellule dendritiche (DC) o fagociti non professionisti, come fibroblasti e cellule epiteliali 11. Fagocitosi eseguita da tutti i fagociti svolge un ruolo centrale nel mantenimento dei tessuti e rimodellamento, mentre la fagocitosi eseguita da fagociti professionali è responsabile del coordinamento della risposta immunitaria innata e adattiva contro gli agenti patogeni. fagociti professionali non si limitano a fagocitare e uccidere l&#39;agente patogeno, ma anche antigeni presenti alle cellule linfoidi del sistema immunitario adattativo. Ciò contribuisce al rilascio di citochine pro-infiammatorie e ad assunzione di cellule linfoidi, dunque ail successo blocco di infezione 12. tecniche biochimiche convenzionali sono state fondamentali per acquisire conoscenze per quanto riguarda il meccanismo molecolare di diversi processi cellulari durante la fagocitosi, come modificazioni post-traslazionali e varie associazioni ad alta affinità tra proteine. Tuttavia, è difficile ottenere informazioni sulle dinamiche spaziali e temporali di eventi fagocitarie utilizzando i metodi biochimici convenzionali. l&#39;imaging cellulare dal vivo non solo ci consente di monitorare eventi cellulari in modo sensibile il tempo, ma anche ci permette di ottenere informazioni a livello di singola cellula. Qui si descrive un metodo per investigare le diverse fasi della fagocitosi, nonché di analizzare l&#39;intero processo spatiotemporally usando la microscopia confocale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="988">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:253px;">AppliChem</td>
			<td style="width:332px;">A1108</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td>9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP-231-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Minimal Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">FITC-coupled IgG-coated latex beads</td>
			<td style="width:253px;">Cayman</td>
			<td style="width:332px;">500290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943 1 LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-streptomycin (10&#39;000U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;"><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Phalloidin-Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RAW 264.7 cells</td>
			<td style="width:253px;">ATCC</td>
			<td style="width:332px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td>
			<td style="width:253px;">Gibco</td>
			<td style="width:332px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>MT25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Trypsin-EDTA (1X) (0.05%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>&#160;85114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Zymosan-Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:253px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:332px;">Z23374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:315px;">Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>155361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor</td>
			<td>87144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the early stages of phagocytosis

Il corpo dei mammiferi è dotata di vari strati di meccanismi che contribuiscono a difendersi dalle invasioni patogeni. Fagociti professionali del sistema immunitario - come i neutrofili, cellule dendritiche e macrofagi - mantengono la capacità innata di rilevare ed eliminare tali patogeni attraverso fagocitosi 1. La fagocitosi coinvolge eventi coreografia di riorganizzazione della membrana e actina rimodellamento sulla superficie delle cellule 2, 3. I fagociti interiorizzare con successo e sradicare molecole estranee solo quando sono soddisfatte tutte le fasi della fagocitosi. Questi passaggi includono il riconoscimento e vincolante del patogeno dai recettori pattern recognition (PRR) che risiede sulla superficie cellulare, formazione di tazza di fagocitosi attraverso actina-arricchito sporgenze membranose (pseudopodi) a circondare il particolato, e scissione della phagosome seguito da phagolysosome maturazione che risultati dellauccidendo del patogeno 3, 4. Imaging e quantificazione delle varie fasi della fagocitosi è strumentale per chiarire i meccanismi molecolari di questo processo cellulare. La presente manoscritto riporta metodi per studiare le diverse fasi della fagocitosi. Descriviamo un approccio microscopio-based per visualizzare e quantificare la formazione coppa fagocitica vincolante, e l&#39;interiorizzazione di particolato dai fagociti. Come si verifica quando la fagocitosi recettori innate su fagociti incontrano ligandi su una particella bersaglio più grande di 0,5 micron, le analisi che presentiamo qui comprendono l&#39;uso di patogeni funghi Candida albicans e altre particelle, come zymosan e perline IgG-rivestite.

Metodo Microscopio a base di monitorare le diverse fasi della fagocitosi è presentato. Vengono visualizzati i diversi eventi durante la fagocitosi delle varie particelle fluorescenti da parte delle cellule DC2.4. Utilizzando le tecniche qui descritte, abbiamo studiato il ruolo degli sfingolipidi nelle prime fasi della fagocitosi. A questo scopo, DC2.4 cellule dendritiche geneticamente carenti di Sptlc2, l&#39;enzima che catalizza la prima e limitante passo nella via di biosintesi degli sfingolipidi, sono stati utilizzati. Rispetto alle cellule di tipo selvatico, Sptlc2 - / - cellule DC2.4 hanno significativamente il livello degli sfingolipidi tra ceramide, sfingomielina e glucosilceramide 8 ridotto. Sptlc2 - / - cellule DC2.4 sono difettosi in vincolanti, nonché nella diffusione di C. albicans, zymosan e IgG perle di lattice 8. Nella figura 1, il legame delle particelle di fluorescenza coniugate-zymosan in cellule DC2.4 è mostrato (vedi Section 3.1 per i dettagli). Sptlc2 - / - cellule DC2.4 hanno mostrato significativamente meno vincolante di zymosan rispetto alle cellule di controllo DC2.4 (p = 0.0008; Figura 1A). Il numero di particelle zymosan legati per cella era significativamente maggiore per le cellule di controllo che per Sptlc2 - / - cellule DC2.4 (p &lt;0,0001; Figura 1C). Abbiamo poi studiato la capacità di Sptlc2 - / - cellule DC2.4 a fagocitano C. albicans. Sptlc2 - / - cellule DC2.4 mostrato significativamente meno fagocitosi di C. albicans (p &lt;0,0005) rispetto alle cellule di controllo (Figura 2A, 2B). Come previsto, le cellule Sptlc2-deficienti hanno mostrato significativamente più alto numero di cellule non fagocitiche (p &lt;0,05; Figura 1C) e il numero di C. albicans per cella (Figura 1C, D) sono diminuite. Questi risultati sottolineano il ruolo di un intatto biosintesi degli sfingolipidi nel vincolanti, così come in tegli assorbimento di particelle. La figura 3 mostra le immagini time-lapse che dimostrano le prime fasi della fagocitosi (vedi Sezione 3.3 per la procedura dettagliata). Film 1 mostra l&#39;imaging dal vivo di cellule che esprimono stabilmente DC2.4 F-actina, un biosensore che rivela la distribuzione di actina filamentosa nelle cellule (vedi Sezione 3.1 per maggiori dettagli) vivere. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54646/54646fig1.jpg" /> Figura 1: Legatura saggio di zymosan nelle cellule DC2.4. (A) il controllo e Sptlc2 - / - cellule DC2.4 sono state incubate con fluorescente zymosan coniugato, e la loro capacità di legare le particelle esaminate al microscopio confocale. Le frecce indicano i siti di legame. Barra di scala = 100 micron. (B, C) Quantificazione del numero di particelle legati zymosan (B) e il numero di particelle zymosan vincolato per cè mostrato ell (C). particelle Bound sono stati quantificati e presentati come percentuale rispetto al controllo. Tutti i grafici mostrano SD di tre esperimenti indipendenti, e almeno 200 cellule sono state contate per ogni esperimento. Spaiato t-test è stato utilizzato per analizzare la significatività delle differenze osservate. ** P &lt;0.001. Barra di scala = 100 micron. Ristampa con il permesso di Tafesse et al. 2015 8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54646/54646fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54646/54646fig2.jpg" /> Figura 2: fagocitosi di C. albicans nelle cellule DC2.4. (A) Le cellule sono state infettate con C andida -BFP come descritto al punto 3.2. A 90 min dopo l&#39;infezione, le cellule sono state fissate e colorate con fluorescente phalloid coniugatoe ripreso con la microscopia confocale. (B - D) è indicata Quantificazione del numero di Candida -BFP, cellule non fagocitiche internalizzati, e il numero di Candida -BFP per cella. Tutti i grafici mostrano SD di tre esperimenti indipendenti, e almeno 200 cellule sono state contate per ogni esperimento. Spaiato t-test è stato utilizzato per analizzare la significatività delle differenze osservate. ** P &lt;0.001. Barra di scala = 100 micron. Ristampa con il permesso di Tafesse et al. 2015 8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54646/54646fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54646/54646fig3.jpg" /> Figura 3: Time-lapse imaging di C. albicans uptake di visualizzare le prime fasi della fagocitosi. le cellule di tipo selvatico DC2.4 esprimono stabilmente F-actina<html> -mCherry (F-actina) sono state incubate con Candida -BFP (mostrato in rosso) e ripreso usando la microscopia confocale. Le immagini catturate ad intervalli di 30 secondi vengono mostrati. Gli asterischi indicano le diverse fasi di actina rimodellamento durante la fagocitosi. Barra di scala = 100 micron. Ristampa con il permesso di Tafesse et al. 2015 8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54646/54646fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/54646/54646mov1.jpg" /> Film 1: immagini dal vivo. Le cellule di tipo selvatico DC2.4 esprimono stabilmente F-actina-mCherry (mostrato in verde) sono stati infettati con Candida -BFP (in rosso). immagini dal vivo è stata effettuata utilizzando la microscopia confocale come descritto al punto 3.3. Ristampa con il permesso di Tafesse et al. 2015 8.s / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere questo video. (tasto destro del mouse per scaricare).

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Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Views.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Video: Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

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Livelli di simbiosi - Visualizzazione della Comunità hindgut Termite microbica

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To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

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This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

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	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

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Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and memory and learning4,5,6. As the only songbird with a sequenced genome, the zebra finch has great potential for use in developmental studies; however, the early stages of zebra finch development have not been well studied. Lack of research in zebra finch development can be attributed to the difficulty of dissecting the small egg and embryo. The following dissection method minimizes embryonic tissue damage, which allows for investigation of morphology and gene expression at all stages of embryonic development. This permits both bright field and fluorescence quality imaging of embryos, use in molecular procedures such as in situ hybridization (ISH), cell proliferation assays, and RNA extraction for quantitative assays such as quantitative real-time PCR (qtRT-PCR).&#160;This technique allows investigators to study early stages of development that were previously difficult to access.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Dissezione e analisi valle di Zebra Finch embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

Isolamento e cultura degli adipociti maturi umani utilizzando le colture aggregate adipocite mature membrana (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution of specific genes to brain development and function increases. Relying on mouse models to study the role of specific genetic manipulations is not always feasible since transgenic mouse lines are quite costly and many novel disease-associated genes do not yet have commercially available genetic lines. Additionally, it can take years of development and validation to create a mouse line. In utero electroporation offers a relatively quick and easy method to manipulate gene expression in a cell-type specific manner in vivo that only requires developing a DNA plasmid to achieve a particular genetic manipulation. Bilateral in utero electroporation can be used to target large populations of frontal cortex pyramidal neurons. Combining this gene transfer method with behavioral approaches allows one to study the effects of genetic manipulations on the function of prefrontal cortex networks and the social behavior of juvenile and adult mice.

The role of recently discovered disease-associated genes in the pathogenesis of neuropsychiatric disorders remains obscure. A modified bilateral in utero electroporation technique allows for the gene transfer in large populations of neurons and examination of the causative effects of gene expression changes on social behavior.

Una pipeline che utilizza l'elettroporazione bilaterale in utero per interrogare le influenze genetiche sul comportamento dei roditori

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...