Questo lavoro è stato supportato da una Stem Cell Science di New York (NYSTEM C028107) Concessione di GHT.

1. preparare gli animali per la temperatura, la nutrizione e la luce / buio ciclo <ol><li> Ottenere Nematostella vectensis adulti da uno dei numerosi laboratori Nematostella in tutto il mondo, o un fornitore senza scopo di lucro (Tabella 1) </li><li> Mantenere Nematostella a temperatura costante (tipicamente tra 18 e 21 ° C) al buio, in &quot;1 / 3x&quot; artificiale del mare (ASW) ad una salinità di 12 parti per mille (ppt). Mantenere le culture in semplici soda-calce piatti di coltura in vetro, in genere da 250 ml o da 1,5 L di capacità 11. Nota: Queste semplici condizioni di coltura sono comunemente utilizzati tra i laboratori che studiano Nematostella, ma la cura della cultura possono anche essere automatizzati 19. </li><li> Alimentare Nematostella Artemia appena schiusi naupli 2 - 4 volte a settimana. Hatch Artemia cisti a piena forza (36 ppt) o 1 / 3x ASW a 30 ° C, in un poco profondo piatto di vetro rettangolare 20 o inqualsiasi di un certo numero di piccola scala, gli incubatoi di salamoia gamberetti commerciale o fatti in casa. Se un incubatore non è disponibile, il gambero si schiudono a temperatura ambiente, ma lo fanno più lentamente. Nota: Questo richiede spesso più di 24 ore per il completamento. </li><li> Sostituire l&#39;acqua cultura anemone, almeno una volta alla settimana. Per una migliore salute degli adulti, pulire accuratamente (senza sapone) la cultura bocce una volta alla settimana di secrezioni mucose accumulati, che rivestire la ciotola e possono intrappolare resti di cibo e rifiuti, e impigliare gli animali. </li></ol> 2. Selezione e rilassamento degli animali Nutrizionalmente condizionata <ol><li> Selezionare i polipi di dimensioni corrispondenza di circa la stessa lunghezza (3 - 5 cm, quando naturalmente rilassato) e metterli in una ciotola separata dalla colonia per tre giorni prima di amputazione. Nota: Il numero di animali selezionati per il taglio sarà determinata dall&#39;esperimento condotto, naturalmente, ma in generale si consiglia almeno cinque animali per punto di campionamento con sei repliche. Così,in un tipico esperimento un minimo di 30 animali sarebbe preselezionato. In generale, è consigliabile selezionare più di un numero minimo (30) dal amputazioni che sono irregolari (vedi sotto) in seguito possono influenzare punteggio. </li><li> Rimuovere il piatto di animali selezionati dal termostato in luce ambiente almeno un&#39;ora prima amputazione. Nota: L&#39;esposizione alla luce artificiale e vibrazioni di movimentazione probabilmente causerà gli animali a contrarsi, così hanno bisogno di essere adattati o &quot;rilassato&quot; di incubazione sul banco di laboratorio. Animali diventeranno refrattari al tatto e l&#39;esposizione alla luce e, a quel punto può essere spostato delicatamente pipettando. </li><li> Opzionale: Anestetizzare gli animali con l&#39;aggiunta di 7,5% MgCl 2 (in 1 / 3x ASW). Delicatamente aggiungere la soluzione MgCl 2 alla ciotola con uno standard di plastica 5 ml pipetta. Nota: Anche se gli animali finirà per diventare abituati alla luce e alla manipolazione fisica, può essere vantaggioso per anestetizzare gli animali per mantenere o &quot;fissare&quot; tsi rilassò stato dopo la loro entrata 16,21,22 allungata. </li><li> Utilizzare un ampio foro (&gt; 0.5 cm) pipetta di plastica per il trasferimento (in 1 / 3x ASW) cinque animali dalla piscina essere amputata, sul fondo di un piatto sterile taglio del vetro del diametro di 100 mm contenente 12 ppt ASW. Porre la capsula sul palcoscenico di uno stereomicroscopio con ingrandimento variabile tra i 10 - 40X. Nota: Se gli animali non sono stati anestetizzati e rilassato per il taglio, essi possono ancora rispondere al tatto e l&#39;illuminazione stereoscopio, e quindi potrebbe essere necessario qualche minuto per diventare di nuovo rilassato. </li></ol> 3. Amputazione <ol><li> Usando un bisturi sterile, amputazione l&#39;Physa aboral da ciascun polipo, con l&#39;obiettivo di ottenere una sezione del Physa che è circa fintanto che è ampia e non contenente mesentere. Nota: Il sito taglio ideale è solo aboral alla cessazione del mesentere. Al piano di taglio c&#39;è una transizione da mesentere propria sottile lines corrispondente ad ogni inserzione mesenterial (vedere Figura 1, frecce). L&#39;assenza di mesentere è fondamentale perché produce muco che possono facilitare &#39;collegare&#39; il buco 17,30. <ol><li> Posizionare il bisturi in contatto con l&#39;animale al sito desiderato di amputazione. Fate questo sia autonomamente (a mano libera), oppure afferrando delicatamente il corpo dell&#39;animale con un # 5 pinze (stile Dumont o simili). </li><li> Tagliare il tessuto sfruttando la lama curva del bisturi in un movimento &#39;dondolo&#39; in tutto il corpo. Nota: Il tessuto deve recidere pulito come il bisturi viene scosso e liberare la sezione desiderata Physa dal donatore. Tuttavia, se un piccolo pezzo di tessuto collega ancora il corpo e la Physa, tagliare con il bisturi. Non tentare di separare i pezzi collegati tirando, in quanto ciò potrebbe danneggiare il Physa. </li></ol></li><li> Rimuovere ogni &#39;donatore&#39; polipo amputato dal piatto e restituirlo ad un sepaciotola tasso etichettato &#39;amputati messe in comune; data la ciotola e restituirlo al magazzino della cultura. Nota: polipi amputate guarirà la ferita aboral entro un giorno e quindi può essere alimentato normalmente. Saranno rigenerare un normale Physa cercando entro due settimane a questo punto il Physa può essere amputata di nuovo se lo si desidera. </li><li> Risciacquare il Physa asportato che rimangono nel piatto di taglio 12 ppt ASW, quindi trasferire ciascuna Physa ad un pozzo sterile separata in una piastra di coltura cellulare multi-pozzo che ha già 10 mL di 12 ppt ASW in ciascun pozzetto. Nota: Questo esempio utilizza una piastra ben sei, con ogni ben di detenzione di 10 ml di acqua di mare e cinque Physa asportato. In acqua marina generale dovrebbe coprire il Physa in misura sufficiente a evitare l&#39;esposizione all&#39;aria a causa di movimenti durante la movimentazione e il potenziale di evaporazione. La piastra o pozzetti devono avere un coperchio. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,3 per raccogliere almeno 5 Physa in ogni pozzetto riservato per ogni trattamento sperimentale. </li><li> Incubare la Physa ad una temperatura che si provide il miglior tasso di rigenerazione per gli interrogatori sperimentali previste. Posizionare la piastra contenente la Physa in un incubatore temperatura regolata, ad una temperatura fissa determinata dal tasso desiderato di rigenerazione. Nota: Il Physa sarà rigenerare i tessuti mancanti e formare un polipo pieno quando incubate a temperature comprese tra 15 e 27 ° C. Il tasso di rigenerazione dipende dalla temperatura eccezione per le prime due fasi. Il giorno medio per raggiungere la fase 4 per tutte le temperature è 7 d dopo il taglio e questo coincide anche con rigenerazione a 21 ° C. A 27 ° C, la fase 4 è raggiunto circa 3 giorni prima e a 15 ° C, la fase 4 è in ritardo di circa 3 d rispetto alla rigenerazione a 21 ° C (vedi anche Riferimento 10). </li></ol> 4. Valutare rigenerazione con la Staging System Nematostella Regeneration (NRSS) <ol><li> Punteggio ottenuto il Physa utilizzando un microscopio stereo composto con magnifica variabilezione (10 - 80X). Punteggio ottenuto il Physa Nematostella appena tagliata come Stadio 0 e continuare segnando allo stesso tempo ogni amputazione dopo giorno (dpa) utilizzando il NRSS 10. Nota: Per i criteri di stadiazione chiave e informazioni si riferiscono riferimento 10. <ol><li> Punteggio Physa come Stadio 0 (ferita aperta) se un Physa appena tagliata appare come una massa a forma di tazza- simile ad un palloncino flaccida, con un sito ferita aperta è probabile visibile. Nota: I bordi della ferita potrebbe anche stare insieme fin dall&#39;inizio, ma il tessuto sarà ancora crollato e la mancanza di rigidità. I bordi della ferita aperta possono essere osservati in fase di contrazione radiale come la ferita guarisce. </li><li> Punteggio Physa come fase 1 (Wound chiuso) se la ferita amputazione appare chiusa. Nota: posizione della ferita sarà conforme a futuro polo orale. La superficie esterna intorno al futuro polo orale può iniziare a visualizzare archi distinti corrispondenti ai sottostanti radialmente simmetrica endodermico inserimenti mesenterial. </li><li> punteggio physa come Fase 2 (radiali Archi) se la superficie del polo orale appare gonfiato, rivelando otto archi sollevate disposti in uno schema radialmente simmetrica e separate da scanalature. Osservare piccoli, blebs emisferiche all&#39;apice delle arcate. Saranno circa alto come ampia, probabilmente transitoria, e inizialmente composta da un singolo strato di cellule ectodermica. Nota: In alcuni casi, vesciche a doppio strato possono stabilizzarsi. Nota: A questo o poi mette in scena uno strato mucoso può apparire per incapsulare il Physa (figura 2) in una &#39;guaina&#39; membranosa. Questo materiale inglobante dovrebbe essere rimosso per facilitare competenza. </li><li> Punteggio Physa come Fase 3 (Tentacle) se le gemme dei tentacoli contenenti endodermico e ectodermiche strati di tessuto sono stabilmente formate alla fine orale di almeno alcuni archi radiali. Nota: I tentacoli sono più lunghi che larghi e sono minimamente mobili. Il Physa manifestano una maggiore, ma l&#39;inflazione variabile in modo che rudimenti mesentere può diventare visbile estende dall&#39;inserzione mesenterial nella cavità del corpo (coelenteron). </li><li> Punteggio Physa come Fase 4 (Mesenteri lineari) se il Physa contiene otto distinti, mesenteri visibili che si estendono nel coelenteron dal inserimenti nella parete del corpo, con lunghezze orali-aboral che sono più di due volte la loro larghezza radiale misurata dal punto in cui compaiono per la connessione alla faringe alla sua estremità aboral (enterostome). Nota: quattro o meno mesenteri hanno &quot;pieghe&quot; bordi liberi interni. La faringe è visibile. Più di otto tentacoli sono visibili, mobili e talvolta si contraggono nel corpo. </li><li> Punteggio Physa come Fase 5 (prevalentemente Pieghe Mesenteri) se il Physa ha più di quattro mesenteri con pieghe, e la pieghettatura è più piena e sinuosa che in fase 4. L&#39;animale ha un quasi &quot;normale&quot; aspetto adulto, ma non ci sono visibili cellule gonadica. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

L&#39;utilizzo di Nematostella come modello di guarigione delle ferite e la rigenerazione sta diventando sempre più popolare. Pertanto, è importante essere in grado di visualizzare i modelli morfologici di un particolare protocollo prima analisi cellulari e molecolari efficaci possono essere assegnati e confrontati. Nematostella hanno un alto grado di rigenerazione &quot;flessibilità&quot;, potendo riformare quasi ogni struttura mancante amputati in qualsiasi luogo, nelle fasi post-planula di vita. Così, diversi ricercatori hanno esaminato la rigenerazione derivanti da amputazione o ferire in diverse regioni di polipi, a diverse età e dimensioni 7-18. Il sistema di stadiazione descritto qui segue la trasformazione di una sezione morfologicamente uniforme Physa, amputato dalla fine aboral di un adulto, a un polipo giovanile anatomicamente completa manca solo tessuto riproduttivo (non abbiamo ancora deciso quando questi giovani rigenerati diventano sessualmente mtura). Questo approccio esamina la rigenerazione da un semplice rudimento di tessuto ad uno dei vicini massima complessità. Di cui cinque Physa come si raccomanda una dimensione minima di gruppo per normalizzare per il potenziale variabilità individuale e sopravvivenza. Naturalmente, questo numero può essere regolato per adattarsi gli obiettivi sperimentali particolari ma il protocollo NRSS permette 2 ml di terreno per Physa per negare un potenziale &#39;effetto volume&#39; come quello che è stato segnalato per influenzare la rigenerazione in Hydra 23. Altri approcci per studiare la rigenerazione Nematostella hanno usato adulti bisecato a metà del corpo o alla fine per via orale, o giovanile polipi fase 4 tentacoli diviso in due metà del corpo 7,11-18. Due studi hanno esaminato la rigenerazione in Physa liberata da fissione naturale 16,18, e approcci utilizzando Physa amputata sono recentemente emerse con la NRSS 8,9. Ognuno di questi approcci variegati ha i suoi meriti e possono rivolgere domande uniche di regenerative processi che si verificano in diversi regimi di amputazione o ferire, e tra gli animali in modo diverso età. Il protocollo NRSS per Physa amputazione e di punteggio, indicato nel presente studio, genera un insieme relativamente uniforme di Physa per studio sistematico ed evita variazione nelle dimensioni Physa, composizione del tessuto, e la successiva progressione della rigenerazione osservato con la fissione trasversale naturale 18,24. Anche se Physa amputazione corrisponde un po &#39;al modo naturale di riproduzione asessuata in Nematostella, le differenze molecolari sono state notate tra rigenerazione derivante dalla fissione naturale e amputazione a metà del corpo o al Physa 16,18,24. Sia Physa prodotti con il metodo di amputazione descritto qui o fissione spettacolo naturale tali differenze ancora da determinare. Ci sono alcuni problemi che sono cruciali per il successo con l&#39;amputazione di allevamento, e le tecniche di scoring qui descritte. I polipi selezionati per l&#39;amputazione should essere mantenuta alla stessa temperatura, abbinato per dimensioni Physa, storia nutrizionale e, se possibile, l&#39;età (anche se quest&#39;ultimo non è stato testato sistematicamente per determinare se vi è un età effetto sulla variazione di progressione fase). Ottenere una ferita aperta con un bisturi sterile tagliente avente una lama ricurva è importante per le osservazioni morfologiche di guarigione delle ferite tra la fase 0 e Fase 1. Quando il Physa è gonfiato e la lama ricurva del bisturi è scosso il tessuto adulto, si è amputato in un unico movimento e possono essere rapidamente trasferiti al trattamento e dal taglio piatto. Amputazioni che includono mesentere o che sono il risultato di un&#39;ampia manipolazione fisica deve essere eliminata. La pratica messa in scena Physa non trattata per ottenere un senso della variazione individuale nella popolazione in fase di test. Variazione tra Physa individuo è almeno per le prime fasi. Ad esempio, tutti Physa sono in fase 0 a 0 dpa. Allo stesso modo tutti Physa raggiungere Fase1 in sincronia a 1 dpa. L&#39;aspetto della Fase 2 può essere più difficile per l&#39;osservatore discernere perché &#39;inflazione&#39; è una condizione relativa che si ottiene, tuttavia, da 2 dpa con piccole variazioni. La comparsa di vera progressione marchi tentacoli per stage 3. I tentacoli di rigenerazione possono essere oscurati dalla comparsa di un &quot;bozzolo&quot; membranosa che impedisce la visualizzazione del bocciolo tentacolo sotto. Se il rivestimento membranoso non è stato precedentemente rimosso, dovrebbe essere fatto ora. La rimozione della membrana con multa pinzetta a punta libererà il Physa rigenerante. La distinzione tra la fase 4 e 5 è il numero di mesenteri pieghettate. Fase 4 ha quattro o meno mesenteri a pieghe, e la fase 5 ha cinque a otto mesenteri pieghe. Mentre pieghettatura può essere osservato in una vista laterale, il numero esatto di mesenteri pieghettato è meglio osservato con una vista aboral. Una sfida a studiare la rigenerazione Nematostella adulto da un PHYsa rudimentale, e anzi con tessuti tagliati da altri siti amputazione, è variata chiarezza dei tessuti viventi. Il bulbo della Physa è relativamente chiara nell&#39;adulto integro, ma diventa piuttosto opaca a causa della contrazione dei tessuti dopo l&#39;amputazione. Chiarezza ritorna gradualmente (fase 2) una volta che si chiude ferita (fase 1) e l&#39;animale inizia a gonfiare, ma anche allora la regione intorno al sito della ferita, dove i tessuti e le strutture sono attivamente rigenerando rimane un po &#39;oscurate da tessuti densi (soprattutto stadio 3). L&#39;aumento dell&#39;inflazione di solito accompagna la fase 4 e 5. Fissazione seguito da chiarificazione ottica quasi certamente risolvere ciò che sta accadendo alla fine orale, ma più informativo può essere in tensione, i giornalisti transgenici tessuto-specifici che possono essere monitorati per la fluorescenza e più facili da visualizzare 15, 25-30. Un Physa amputata, ovviamente, non può alimentare dal momento che manca tentacoli, bocca e mesenteri (che ospitano ghiandole digestive), quindi requila rigenerazione anello di strutture del corpo mancanti per essere realizzato attraverso la mobilitazione di riserve di sostanze nutritive da fonti non alimentari. Il Physa potenzialmente in grado di raggiungere questo obiettivo è da autofagia, in cui citoplasma, organelli e altri componenti cellulari sono inghiottiti nelle cellule ed elaborati da un meccanismo di lisosoma-dipendente per la produzione di energia e di composti per i processi anabolici 31-33. Troviamo che il trattamento con l&#39;inibitore Physa lisosomi, clorochina, provoca la rigenerazione anomala di mesenteri e tentacoli, e la morfologia generale del corpo, che indica che l&#39;autofagia è necessaria per la normale rigenerazione delle strutture orali e per il corpo. L&#39;autofagia regola staminali funzioni cellulari 34-36, e svolge un ruolo essenziale nella rigenerazione a Hydra, planaria, e zebrafish 37-41. Ulteriori analisi è necessaria per capire come autofagia influenza rigenerazione Nematostella a livello cellulare e molecolare, ma il nostro primo esperimento passaggio dimostra l&#39;utilità di utilizzare il NRSS come metodo di screening rapido per le piccole molecole che potrebbero influenzare la rigenerazione. I processi genetici, molecolari e cellulari che regolano la rigenerazione in Nematostella sono solo in una fase rudimentale di comprensione, ma questo modello emergente per la rigenerazione ha un repertorio sempre crescente di strumenti per l&#39;analisi di espressione genomica e genetica. Con il suo genoma Annotated, una pletora di marcatori genetici regionali e tessuto specifico e metodi robusti per transgenesi, mutagenesi, istologia e microscopia, Nematostella promette di rivelare i meccanismi che regolano antozoo rigenerazione cnidarian e scoprire se i suoi processi rigenerativi sono simili o unico fra cnidari e metazoi in generale.

L&#39;osservazione della rigenerazione in un unico idra è stato l&#39;evento seminale l&#39;avvento della biologia come scienza sperimentale 1,2. Rigenerazione rimane un fenomeno di straordinariamente ampio ricorso al biologo e laico allo stesso modo. Il potenziale di biologi dello sviluppo, medici, scienziati e ingegneri biomedici tessuti per comprendere e superare i limiti di rigenerazione umana rende biologia rigenerazione più di intrinsecamente interessante. Ora, con l&#39;uso di tecnologie emergenti come il sequenziamento del genoma e il guadagno e la perdita di strumenti di funzione, il campo è pronta a prendere in giro i meccanismi rigenerativi a parte e in ultima analisi, per capire come le varie specie in grado di rigenerare, mentre altri non possono. Il grado di comunanza di risposte molecolari, cellulari e morfologiche rimane da chiarire, ma finora sembra che le risposte di base tra gli animali che possono rigenerare è più simile di quanto sarebbe stato Imagined solo un decennio fa 3. Cnidari in particolare, sono facile a rigenerare quasi tutte le loro parti del corpo in mezzo a un ampio spettro di diversità morfologica. Dal solitari polipo acqua dolce, Hydra insieme con i minuscoli polipi marini che costruiscono enormi coralli, alle complesse sifonofore coloniale, come il portoghese Man-O-Guerra, la rigenerazione è spesso una modalità di riproduzione, in aggiunta a un meccanismo di la riparazione o la riforma parti del corpo danneggiate o perse derivanti da un infortunio e predazione. Se le diverse specie di Cnidaria utilizzano meccanismi simili o differenti per la rigenerazione è una domanda interessante fondamentalmente 4-6. Noi e altri abbiamo sviluppato il antozoo, Nematostella vectensis come modello per la rigenerazione 7-17. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema di stadiazione per descrivere la rigenerazione di un intero corpo da un pezzo morfologicamente uniforme di tessuto tagliato in due dai Aboral fine del polipo 10. Mentre polipi Nematostella possono rigenerare quando attraversata a qualsiasi livello, abbiamo scelto di tagliare adulti in posizione aboral nella regione più morfologicamente semplice, il Physa, in parte perché questo è vicino al piano normale della naturale fissione asessuata 18, ed anche perché permessi osservazione e analisi molecolari di come un intero corpo viene ricomposto dai componenti morfologiche semplici. Il Staging System Nematostella Regeneration (NRSS) fornisce una relativamente semplice serie di parametri morfologici che potrebbero essere utilizzati per segnare il progresso di qualsiasi aspetto della rigenerazione da un Physa amputata, in condizioni di coltura normali o sperimentalmente perturbato situazioni come trattamenti di piccole molecole, manipolazione genetica o alterazione ambientale. Come anticipato, il NRSS sta diventando adottato da impalcatura morfologica su cui è possibile fare riferimento gli eventi cellulari e molecolari della rigenerazione10. Infine il nostro metodo di taglio produce un Gaping fori diversi ordini di grandezza superiore alla puntura fenomenale utilizzato in uno studio recente 17, ma entrambe le ferite guariscono in circa 6 ore. Documentare le fasi visivamente arrestando e distinti di chiusura della ferita dovrebbe suggerire approcci sperimentali per spiegare l&#39;apparente indipendenza della dimensione di una ferita e il tempo necessario per chiuderla. Così, una più profonda comprensione visiva del processo di amputazione aboral, fornita da questo protocollo, sarà di aiuto ulteriori indagini in questo sistema di rigenerazione del modello e ampliare l&#39;applicazione di questo sistema di stadiazione utilizzando Nematostella vectensis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nematostella vectensis, adults</td>
			<td>Marine Biological Lab (MBL)</td>
			<td></td>
			<td>non-profit supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Dish, 250 ml</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>741004</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Dish, 1,500 ml</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>741006</td>
			<td>1,500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene transfer pipette, 5ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific&#160;</td>
			<td>1022-2500</td>
			<td>narrow bore, graduated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene transfer pipet, tapered</td>
			<td>Samco</td>
			<td>202-205</td>
			<td>cut off 1 inch of tip to make wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Feather Safety Razor Co. Ltd</td>
			<td>no. 10</td>
			<td>blade should be curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Dumont Fine point tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS5045</td>
			<td>alternative suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dish, 100 mm diameter</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3160</td>
			<td>can substitute other glass petri plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 well plate</td>
			<td>Corning Falcon&#160;</td>
			<td>353046</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12 well plate</td>
			<td>Nunc&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24 well plate</td>
			<td>Cellstar, Greiner bio-one</td>
			<td>662-160</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp hathery kit</td>
			<td>San Francisco Bay; drsfostersmith.com</td>
			<td>CD-154005</td>
			<td>option for growing brine shrimp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyrex baking dish</td>
			<td>common in grocery stores</td>
			<td></td>
			<td>option for growing brine shrimp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial seawater mix 50 gal or more&#160;</td>
			<td>Instant Ocean; drsfoster-smith.com</td>
			<td>CD-116528</td>
			<td>others brands may suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tub for stock ASW preparation</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>common 25 gallon plastic trash can OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Carboy</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>716391</td>
			<td>For working stock of ASW @ 12 ppt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, Graduated, 4,000ml</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>B199</td>
			<td>For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope and light source</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td></td>
			<td>with continuous 1 - 40x magnification&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing complete polyp regeneration from the aboral physa of the starlet sea anemone nematostella vectensis

Cnidari, e in particolare Hydra, sono stati i primi animali indicati per rigenerare le strutture danneggiate o mozzate, e in effetti questi studi probabilmente lanciati indagine biologica moderna attraverso il lavoro di Trembley più di 250 anni fa. Attualmente lo studio della rigenerazione ha visto una rinascita utilizzando entrambi i microrganismi rigenerativi &quot;classici&quot;, come l&#39;Hydra, planaria e urodeli, nonché uno spettro ampliamento di specie che misurano la gamma di metazoi, dalle spugne attraverso mammiferi. Oltre al suo interesse intrinseco come fenomeno biologico, la comprensione di come la rigenerazione lavora in una varietà di specie ci illustrerà se i processi rigenerativi condividono caratteristiche e / o specie comuni o meccanismi cellulari e molecolari specifici al contesto. L&#39;anemone di mare starlet, Nematostella vectensis, è un organismo modello emergente per la rigenerazione. Come Hydra, Nematostella è un membro delle antiche phylum, Cnidaria, ma all&#39;interno di tLa classe Anthozoa, un clade sorella al Hydrozoa che è evolutivamente più basale. Così gli aspetti della rigenerazione in Nematostella sarà interessante mettere a confronto con quelli di Hydra e altri cnidari. In questo articolo, vi presentiamo un metodo per bisect, di osservare e classificare la rigenerazione della fine aboral dell&#39;adulto Nematostella, che si chiama il Physa. Il Physa subisce naturalmente la fissione come mezzo di riproduzione asessuata, e sia la fissione naturali o amputazione manuale del Physa innesca ricrescita e la riforma delle morfologie complesse. Qui abbiamo codificato questi semplici cambiamenti morfologici in un sistema di gestione temporanea Nematostella rigenerazione (il NRSS). Usiamo il NRSS per testare gli effetti di clorochina, un inibitore della funzione lisosomiale che blocca l&#39;autofagia. I risultati mostrano che la rigenerazione delle strutture polipo, in particolare i mesenteri, è anormale quando autofagia è inibita.

La progressione degli eventi morfologici durante la rigenerazione in Physa tagliata è mostrato in figura 1A, che include viste rappresentativi di Physa in ciascuna fase NRSS. Il sito tipico Physa taglio è indicato l&#39;adulto (punte di freccia). Le fotografie di Figura 1A mostrano progressiva rigenerazione delle strutture orali e corpo da Physa appena tagliata attraverso polipo completamente formato. Figura 1B, C mostrano la disposizione dei setti interni, le mesenteri, in fase 4 e fase 5, rispettivamente. Si noti che alcuni mesenteri a Fase 4 mancheranno &quot;plissettatura&quot;, ma per qualificarsi come uno Stage 5 la maggioranza deve aver sviluppato pieghe. Figura 1D mostra una Physa avvolti da una membrana mucosa che può essere rimosso con una pinza (Figura 1E). Anche se di solito non è nocivo per la rigenerazione (a meno che non intrappola irragionevolmente l&#39;animale), la membrana può impedire segnando il Physa e fareing manipolazioni sperimentali, come la microscopia, la fissazione del campione o la raccolta per l&#39;analisi molecolare / biochimica. Questo è meglio rimosso dopo la fase 1, o in seguito, se lo riforme. La figura 2 mostra come il sistema di stadiazione può essere utilizzato per segnare i risultati di un esperimento per valutare gli effetti di inibizione autofagia. Physa sono stati tagliati e trattati con clorochina a 10, 50 e 100 pM, o Physa erano non trattati (controlli). La clorochina inibisce le funzioni lisosomiali, che sono necessarie per l&#39;autofagia. I criteri NRSS stati usati per segnare il Physa nel corso della rigenerazione e risultati sono stati riportati nella Figura 2E. Fotografie di controllo rappresentativi (Figura 2A) e clorochina trattati Physa (Figura 2 B - D) sono state fatte quando i controlli raggiunto la fase 5. Chloroquine animali trattati non progredire oltre la fase 4, e che in genere esposti incomplete rigenerazione mesenteryzione (pieghettatura più mancava), dimensioni tentacolo breve, e in alcuni casi breve lunghezza del corpo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54626/54626fig1.jpg" /> Figura 1. Caratteristiche di rigenerazione. (A) Esempi di Physa rigenerare strutture orali e corpo in scena secondo il NRSS. Pannello etichettato adulto mostra caratteristiche di un animale maturo con tentacoli (t) faringe (ph), mesenteri (m) e inserimenti mesentere (mi). frecce bianche indicano regione in cui pieghe di mesenteri transizione verso l&#39;inserimento mesentere, una cresta di endoderma si estende fino al capolinea aboral. Questa regione costituisce il Physa. Le frecce gialle indicano sito ideale Physa bisezione. Pannello 0 mostra cinque minuti dopo Physa di bisezione, e Panel 0 &#39;è una vista ingrandita di un uno di quelli Physa, con ferita aperta al centro, la definizione di fase 0 delNRSS. Pannello 1 mostra una Physa con la ferita ormai chiuso, che definisce Fase 1. Pannello 2 spettacoli Physa con sollevate archi radiali attorno al polo orale, con i tessuti gonfiati sotto, corrispondente alla fase 2 (pannelli 0-2 sono viste alla fine orale). Pannello 3 mostra gemme tentacolo emergenti al polo orale (verso destra) del Physa allungata e gonfiare, ora in fase 3. Nota elementi rudimentali mesentere sono visibili e la faringe si sta formando nella zona scura alla fine orale. Pannello 4 mostra la nascita di veri e propri tentacoli, così come &#39;blebs&#39; transitori al polo orale, che definiscono Fase 4. mesenteri lineari sono visibili nella Physa gonfiato. La grande massa rotonda visibile all&#39;interno del polipo è di origine ignota e verrà espulso attraverso la bocca. Pannello 5 mostra la rigenerazione quasi completa caratterizzata da più di quattro mesenteri a pieghe, un ph completamente formatoarynx e otto o più tentacoli, che la definisce come Fase 5. (B, C) viste aboral di Physa individuale illustrano la disposizione biradial e la morfologia di mesenteri. In questa prospettiva, mesenteri pieghe sembrano avere un rigonfiamento del tessuto a metà strada (punta di freccia verde). Una Fase 4 Physa ha quattro o meno mesenteri a pieghe, e un Physa fase 5 ha più di quattro (C). Mesenteri con o senza plissettatura sono indicati da frecce verdi o giallo, rispettivamente. Arrowhead nero in (C) indica un mesentere pieghe che ha esteso radialmente. (D, E) Rimozione di una guaina mucoso dal Physa è raffigurato. Le frecce bianche indicano una guaina mucosa che circonda l&#39;Physa (D) che deve essere rimosso come in (E) prima di segnare rigenerazione. A volte tessuto residuo (frecce gialle) può essere intrappolato all&#39;interno della guaina, e anche questo deve essere rimosso. L&#39;asterisco indica pali orali, dove Marked. Dimensioni barre rosse sono 0,5 mm in tutti i pannelli eccetto A5 (1,0 mm). Pannelli B e C di questa figura sono stati modificati e ristampato con il permesso di riferimento 10. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54626/54626fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54626/54626fig2.jpg" /> Figura 2. Effetti della clorochina sulla rigenerazione. Per dimostrare un&#39;applicazione del NRSS, abbiamo testato gli effetti di una clorochina, un inibitore di autofagia. Physa stati amputata e immediatamente posto in 1 / 3x ASW contenente 0,1% DMSO (controllo) o clorochina a 10, 50, 100 pM. Physa sono stati segnati a 24 h intervalli utilizzando il NRSS. (A) le immagini endpoint rappresentative tratte di controlli quando hanno raggiunto la fase 5. <strong&gt; (B - D) Immagini rappresentative della Physa clorochina-trattati che hanno raggiunto un &quot;plateau rigenerativa&quot; di fase 4. La clorochina causato difetti simili a rigenerazione a tutti i dosaggi testati. Il problema più importante è stata la mancanza di una piena rigenerazione di mesenteri e tentacoli. La morfologia del corpo anomalo (ad esempio, arresto della crescita) è stato anche occasionalmente rilevato (C). Presenza (freccia bianca) e la mancanza (freccia nera) di pieghe in un Physa clorochina trattato è mostrato in D (tentacoli sono parzialmente ritirate). (E) I dati di sosta per tutti Physa riportati in funzione del tempo (a 23 ° C). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54626/54626fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54626/54626fig3.jpg" /> Figura 3. Sintesicaratteristiche fondamentali degli stadi NRSS. Questo diagramma mostra i principali cambiamenti morfologici che definiscono ogni fase del NRSS. Direzione dei movimenti sono indicati da frecce rosse e le caratteristiche di punte di freccia verde. Fase 0 raffigura ferita aperta solo dopo il taglio (A), e T). I bordi della ferita subiscono chiusura radiale contrazione verso il centro (B). Fase 1 è caratterizzato da chiusura completa della ferita (C) ed elevazione degli archi tra creste orali rivolti (D); il centro della superficie orale (freccia) è premuto. Fase 2 ha un inarcamento pronunciata della superficie orale (punta di freccia, E); il Physa inizia ad allungarsi e diventare stretta (F) con i germogli tentacolo e vesciche visibili al vertice degli archi (frecce). Fase 3 ha gemme stabili tentacolo (punta di freccia, G) e la faringe rigenerazione può essere visto come una densità al polo orale (massa arancio, punta di freccia in H </strong&gt;). Fase 4 mostra la presenza di mesenteri lineari e plissettature (I) che dovrebbero essere almeno il doppio del tempo in quanto sono alti allo svincolo di faringe (I &#39;). Quattro o meno mesenteri possono essere pieghe al loro bordo interno - il filamento mesenterial (J, J &#39;). Fase 5 è caratterizzato da più di quattro mesenteri pieghettato (K), che possono essere meglio valutati osservando dall&#39;estremità aboral (K &#39;). Re-stampa con il permesso di riferimento 10. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54626/54626fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

inducing-complete-polyp-regeneration-from-aboral-physa-starlet-sea

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

8.4K Views.  Stony Brook University. Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Video: Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Il completo ed aggiornato &quot;Rotifero Metodo Polyculture&quot; per l&#39;allevamento Prima Zebrafish Feeding

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...