Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-Messico (CONACYT-Messico) (82614, 153998, 253549, e 178.359 in Investigación Científica Básica e 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) e dalla Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).</li><li>Jaeger, K. E., Eggert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipases+for+biotechnology.">Lipases for biotechnology.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).</li><li>Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+lipids+in+membranes.">Functional roles of lipids in membranes.</a> Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).</li><li>Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+membrane+phospholipid+diversity:+why+are+there+so+many+lipids?.">Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?.</a> Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).</li><li>De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+meliloti+mutants+deficient+in+phospholipid+N-methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine.">Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).</li><li>Geiger, O., R&#246;hrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulator+gene+phoB+mediates+phosphate+stress-controlled+synthesis+of+the+membrane+lipid+diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine+in+Rhizobium+(Sinorhizobium)+meliloti.">The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti.</a> Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).</li><li>Klug, R. M., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+enzymes+of+diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine+biosynthesis+are+encoded+by+btaA+and+btaB+in+the+purple+bacterium+Rhodobacter+sphaeroides.">Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).</li><li>Zavaleta-Pastor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinorhizobium+meliloti+phospholipase+C+required+for+lipid+remodeling+duringphosphorus+limitation.">Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).</li><li>Pech-Canul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FadD+is+required+for+utilization+of+endogenous+fatty+acids+released+from+membrane+lipids.">FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids.</a> J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).</li><li>Banerji, S., Flieger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patatin-like+proteins:+a+new+family+of+lipolytic+enzymes+present+in+bacteria?.">Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?.</a> Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).</li><li>Sahonero-Canavesi, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-releasing+activities+in+Sinorhizobium+meliloti+include+unusual+diacylglycerol+lipase.">Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase.</a> Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).</li><li>Fischer, M., Pleiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lipase+Engineering+Database:+a+navigation+and+analysis+tool+for+protein+families.">The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families.</a> Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).</li><li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+continuing+developments+at+PROSITE.">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+-+new+capabilities+and+interfaces.">Primer3 - new capabilities and interfaces.</a> Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes.">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in Molecular Genetics. , (1972).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method for total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).</li><li>Molecular Dynamics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phosphorimager SI User&#180;s Guide. , (1994).</li><li>Dixon, M., Webb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzymes: Third Edition. , (1979).</li><li>Rudolph, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+characterization,+and+mutagenesis+of+the+Yersinia+pestis+murine+toxin,+a+phospholipase+D+superfamily+member.">Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member.</a> J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).</li><li>Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+a+novel+lipolytic+enzyme+YvdO+from+Bacillus+subtilis.">Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).</li><li>Peppelenbosch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome+profiling.">Kinome profiling.</a> Scientifica (Cairo). , (2012).</li><li>Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+and+chromogenic+substrates+used+in+bacterial+diagnostics.">Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics.</a> Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).</li><li>Kuznetsova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+genomics:+Application+of+general+enzymatic+screens+to+discover+new+enzymes.">Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes.</a> FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).</li><li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria.">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel corso degli ultimi 20 anni, genomi di molti organismi sono stati sequenziati e anche se una ricchezza di dati sequenza del genoma è stato generato, interpretazione funzionale è in ritardo e ostacola quindi la nostra comprensione della funzione del genoma. funzioni geniche in genomi sono spesso assegnati in base alla somiglianza con geni di funzione nota o di insorgenza di motivi conservati. Tuttavia, la precisa funzione di un dato gene spesso non è noto. Soprattutto, previsto geni strutturali per enzimi non possono essere facilmente esplorato con tecniche omic dovuto al fatto che la maggior parte degli enzimi catalizzano reazioni complesse che coinvolgono due substrati e due prodotti. Attualmente, sembra più fattibile per esplorare specificità di substrato per gruppi di enzimi in cui almeno un substrato è fisso e dove l&#39;altra può essere variata. Ad esempio, negli eucarioti maggior motivi fosforilazione di proteine ​​sono noti e peptidi consenso per chinasi sono stati avvistati su supporti solidi per generare peptide arRaggi. L&#39;uso di tali array e ATP radioattivo, specificità di substrato e livelli di attività di chinasi distinti di un organismo può essere determinato che permette la creazione di un profilo kinome e definire le specificità del substrato 24. Idrolasi comporre un altro grande gruppo di enzimi per i quali un substrato, acqua, è fisso, ma per i quali la precisa natura della (altro) substrato da idrolizzati spesso non è conosciuta. Il fatto che per un nuovo enzima condizioni di analisi ottimali non sono noti né, converte il rilevamento di una nuova attività enzimatica in un problema multivariabile. Si può quindi contribuire a poter fissare il substrato essere idrolizzato per definire le condizioni in cui l&#39;enzima funziona meglio. Nel presente manoscritto, si descrive l&#39;ottimizzazione delle condizioni di analisi per prospettico (fosfo) lipasi con specificità di substrato sconosciuti e elaboriamo come impiegare queste condizioni ottimali nella ricerca per il substrato naturale del reprospettiva (fosfo) lipasi. Il significato della presente tecnica consiste nel fatto che l&#39;idrolisi dei substrati artificiali fluorogenici o cromogeni,, che imitano substrati naturali in una certa misura, può essere seguito mediante spettrofotometria 25 e che questi test sono facilmente applicabile a larga scala studi 26. A causa della sensibilità di tali dosaggi e la loro semplicità di monitorare la reazione, possono essere facilmente ottimizzate per un dato enzima. Ovviamente, per substrati artificiali ci si potrebbe aspettare costanti cinetiche meno favorevoli (vale a dire, ad alta K M, a basso k cat) per un enzima specifico che per substrati naturali 1,21. In pratica, tuttavia, la disponibilità facile e rilevabilità di substrati artificiali operare da substrati (cattivo) per interi gruppi di enzimi spesso più che compensare gli svantaggi. Una volta aver incontrato le condizioni per un enzima di lavorare (con il substrato artificiale), lo farà con la naturAl / substrato fisiologico pure. Poiché la preparazione e l&#39;isolamento di potenziali substrati lipidici possono essere laborioso e richiede molto tempo, è importante avere la certezza che un enzima è pronto a lavorare quando si combinano e incubando con substrati preziosi. È importante sottolineare che la procedura di ottimizzare prima le condizioni per un enzima di lavorare, consentirà una più rapida identificazione del substrato fisiologico per un nuovo (fosfo) lipasi. Come prova di concetto, abbiamo impiegato con successo questo metodo per la caratterizzazione delle specificità di substrato di lipasi SMc00171, SMc00930 e SMc01003 8,11. Al contrario, molti metodi tradizionali, alternativi istituiscono saggi di attività (fosfo) lipasi coinvolgono reazioni in cui il substrato e di prodotto sono già noti. Ovviamente, modifiche di metodi per la determinazione dell&#39;attività enzimatica ottimale può includere l&#39;uso di altri fluorogenico, cromogenica, o in altro modo substrati artificiali marcate, la variazionedi enzima concentrazione, tipo e concentrazione di buffer o altri additivi (ad esempio, detergenti o cationi bivalenti). Se nessuna attività enzimatica viene rilevata con substrati artificiali, il rispettivo enzima semplicemente non potrebbe funzionare con questo substrato, ma la risoluzione dei problemi in questi casi certamente dovrebbe includere per avere la certezza che fossero state adottate tutte le precauzioni che avrebbe potuto essere necessario per mantenere l&#39;attività enzimatica intatto (vale a dire, la memorizzazione estratti privi di cellule a 4 ° C o temperature inferiori fino al momento dell&#39;uso e, se necessario, l&#39;aggiunta di un cocktail di inibitori delle proteasi ad estratti privi di cellule, al fine di evitare la degradazione proteolitica dell&#39;enzima di interesse) 27. Limiti della tecnica presentata in questo manoscritto sono dovuti al fatto che il substrato artificiale e il substrato naturale sono diversi l&#39;uno dall&#39;altro e di conseguenza bioenergetica per la reazione catalizzata sarà pure 1. I vari parameters per le condizioni ottimali di attività enzimatica dovrebbero essere stabiliti anche per il substrato naturale (variando pH, tipo di tampone, tampone forza, concentrazioni di NaCl e detergenti come Triton X-100, l&#39;assenza o la presenza di diversi cationi bivalenti), come potrebbero rivelarsi un po &#39;diversa dalle condizioni ottimali riscontrate per il substrato artificiale. Un&#39;altra limitazione importante è che probabilmente non tutti (fosfo) lipasi sono rilevabili mediante l&#39;uso di substrati cromogeni artificiali. Ad esempio, l&#39;artificiale p -nitrophenyl residui dei substrati esterei semplicemente potrebbe essere troppo ingombranti, o presentare altre proprietà chimiche che impediscono che un tale substrato può ottenere l&#39;accesso al sito attivo di un enzima. È stato osservato che il DAG lipasi SMc01003 visualizzata attività bassi con tutti i substrati p -nitrophenyl esterei di diverse lunghezze di catena 11. Con la conoscenza che DAG è il substrato naturale per SMc01003 e che ha un DAG reltivamente piccolo gruppo testa polare, composto da glicerolo solo 11, è facilmente immaginabile che l&#39;ingombrante residuo p -nitrophenyl è semplicemente troppo grande per un facile accesso al sito attivo della SMc01003. Tuttavia, i dettagli molecolari per cui p esteri -nitrophenyl non sono buoni substrati per SMc01003 non sono noti, a questo punto. Passaggi critici all&#39;interno del protocollo comprendono tutte le disposizioni adottate per garantire che l&#39;enzima studiato ha accesso al rispettivo supporto. Ad esempio, nella ricerca per il substrato lipidico fisiologico, è fondamentale che il substrato lipidico è fornito in una forma solubilizzata. Pertanto, quando si imposta tali saggi enzimatici (descritto in 5 del protocollo), substrati lipidici, generalmente disciolti in miscele di metanolo: cloroformio, deve essere miscelato con una soluzione acquosa di un detergente, cioè, Triton X-100, prima dell&#39;essiccazione giù la miscela con azoto gassoso. Questa procedura garantisce che, dopo aver aggiunto gli altri ingredienti per il saggio, il potenziale di substrato lipidico è incorporato in micelle detergenti e come tale accessibili per l&#39;enzima durante il dosaggio. Principalmente, la tecnica qui presentata dovrebbe essere ampiamente applicabile in futuro per la scoperta di nuovi (fosfo) lipasi e per la definizione dei loro substrati naturali. La tecnica è facilmente espandibile per altre classi di idrolasi, ma potrebbe essere più complicato per sviluppare saggi con substrati artificiali per nuovi enzimi che richiedono due, di solito sconosciuti, substrati per completare il loro ciclo catalitico. Per lipasi previsti (fosfo) o fosfatasi né il substrato corretto è conosciuto né le condizioni di saggio in cui l&#39;enzima funziona bene. Pertanto, potrebbe essere utile studiare se alcuni composti da una batteria di composti artificiali, quali i composti contenenti -nitrophenyl distinta p (p -nitrophenyl fosfato, bis- p -nitrophenyl fosfato, <em&gt; p -nitrophenyl decanoato, o p -nitrophenyl palmitato), potrebbe funzionare come substrato. La scoperta di attività enzimatiche iniziali con substrati artificiali ha aperto la strada per risolvere tale SMc00171 è una specifica fosfolipasi C-PC 8, che SMc01003 è un lipasi DAG 11, e ha contribuito a definire le condizioni alle quali SMc00930 agisce come un idrolasi 11. Ovviamente, il substrato naturale di SMc00930 è al momento ancora sconosciuto e contesti fisiologici di SMc00930 e SMc01003 sono ancora da risolvere. Pertanto, il compito di proporre una funzione fisiologica per una lipasi previsto è impegnativo e non sempre immediatamente incontrato con successo. Utilizzando i mutanti carenti del gene della lipasi previsto e confrontandoli con il rispettivo ceppo wild-type potrebbe dare evidenza sperimentale che la lipasi agisce con la specificità nel suo sfondo nativo ceppo che è stato postulato in parte 4) del protocollo. Chiaramente, l&#39;affermazione di una nuova sh attività della lipasiould essere supportato da prove in vitro che un certo substrato viene convertito mediante idrolisi in prodotti definiti. A volte la funzione fisiologica postulato potrebbe colmare le lacune in vie metaboliche o spiegare il comportamento fisiologico dell&#39;organismo che produce, ma in altri casi non è sufficiente ancora potrebbe non essere sufficiente conoscenze biochimiche per dare un senso di alcune attività. Nel corso dei nostri studi, abbiamo identificato numerosi enzimi che agiscono sui lipidi di membrana intrinseche polari di batteri loro degradanti e, in alcuni casi, convertendoli in un giocatore in cicli lipidi complessi. Ad esempio, combinando la nuova conoscenza che SMc00171 è uno specifico PC fosfolipasi C (PLCP) 8 che è indotta in condizioni di fosforo di limitazione della crescita, con i dati preesistenti, si può postulare un romanzo ciclo DAG che potrebbero esistere in molti proteobacteria ambientale e che dà luogo alla formazione di lipidi di membrana privo di fosforo quando fosforo è crescita limitativo. in contrast, quando le forniture di fosforo sono abbondanti, DAG è rephosphorylated ad acido fosfatidico entrando de novo biosintesi dei fosfolipidi, chiudendo così il ciclo lipidico e garantendo che principalmente (glycero) fosfolipidi sono presenti nella membrana 8,28.

Lipidi glicerolo-based come trigliceridi e fosfolipidi (glycero) costituiscono importanti e probabilmente il più noti classi di lipidi 1. Trigliceridi (tag) sono grassi o oli, che di solito fungono da lipidi di stoccaggio, e quindi come potenziali fonti di energia e di carbonio. TAG possono essere degradati dalla lipasi, che sono spesso secrete dall&#39;organismo produzione di digerire variabili esterne e renderli disponibili come fonti di carbonio. Inoltre, lipasi sono stati ampiamente studiati negli anni, grazie alle loro importanti applicazioni biotecnologiche 2. A causa della loro natura anfifilica e la loro forma quasi cilindrica, proprietà di membrana formante (glycero) fosfolipidi esporre e generalmente costituiscono i principali componenti lipidici di membrana doppo strato 3. In microrganismi semplici, come il batterio Escherichia coli, solo tre varianti principali del gruppo testa, fosfatidilglicerolo (PG), cardiolipina (CL), e phosphatidylethanolamine (PE) è riscontrabile, anche se si deve essere consapevoli che ciascuno di essi può essere sostituito con un considerevole numero di differenti catene grassi acil al sn -1 o sn posizione -2 dando luogo ad un grande numero di differenti specie molecolari 4 . Altri batteri possono avere altri fosfolipidi in aggiunta o al posto. Ad esempio, Sinorhizobium meliloti, un batterio del suolo, che è in grado di formare una radice nodulo simbiosi azotofissatrice con l&#39;erba medica legume (Medicago sativa), contiene in aggiunta al PE un secondo fosfolipide zwitterionico, fosfatidilcolina (PC) 5. Inoltre, i lipidi non contenenti fosforo o glicerolo potrebbe essere parte anfifilico e la forma della membrana cellulare. Ad esempio, dalle condizioni di crescita fosforo limitativo, in S. meliloti, (glycero) fosfolipidi sono in gran parte sostituiti da lipidi di membrana che non contengono fosforo, cioè, sulfolipids, lipidi ornitina, e diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. Nei batteri, DGTS è formata da diacilglicerolo (DAG) in un percorso in due fasi 7, ma la fonte per la generazione di DAG non era chiaro. Esperimenti di pulse-chase suggerito che il PC potrebbe essere un precursore per DGTS 8 e utilizzando la metodologia descritta in questo manoscritto abbiamo potuto identificare un fosfolipasi C (PLCP, SMc00171) che si forma in condizioni di fosforo-limitante e che può convertire il PC in DAG e phosphocholine 8. In uno studio separato, abbiamo scoperto che un sintetasi acil-CoA (FADD) mutante -carente di S. meliloti o di Escherichia coli accumulato acidi grassi liberi entrando fase stazionaria della crescita 9. Sebbene questi acidi grassi sembravano essere derivato da lipidi di membrana, la fonte precisa per gli acidi grassi liberi o l&#39;enzima (s) liberandoli non erano noti. Anche in questo caso, utilizzando la strategia delineata in questo manoscritto, due 10 (fosfo) lipasi Patatin-like (SMc00930 e SMc01003), che ha contribuito alla formazione di acidi grassi liberi a S. meliloti 11 sono stati previsti. Sorprendentemente, SMc01003 utilizzato DAG come substrato convertirlo monoacilglicerolo e infine glicerolo e acidi grassi liberi 11. Pertanto, SMc01003 è una lipasi DAG (DGLA). Sebbene un certo numero di algoritmi esistenti per prevedere il potenziale (fosfo) lipasi 12,13, la loro funzione precisa e ruolo fisiologico non è generalmente noto. Qui descriviamo un protocollo, per clonare e iperespressione di lipasi (fosfo) previsti o potenziali. Questo manoscritto spiega come saggi enzimatici possono essere sviluppati e ottimizzati per la (fosfo) lipasi sovraespresso utilizzando substrati cromogeni artificiali. Forniamo esempi di come con un metodo enzimatico ottimizzato il vero (fosfo) substrato lipasi può essere incontrato e di come queste scoperte potrebbero arricchire la nostra comprensione della fisiologia microbica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9180-03</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9507-05</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9309-02</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32203</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bidistilled water</td>
			<td>&#160;ANY</td>
			<td>&#160;NA</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9535-02</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>ANY</td>
			<td>NA</td>
			<td>Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TY broth</td>
			<td>ANY</td>
			<td>NA</td>
			<td>Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2 H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1332-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8885</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221279</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipase A2 snake venom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0790</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipase C Clostridium perfingrens</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7633</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>07422AH</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl stearate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3627</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl dodecanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>61716</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl decanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0252</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl palmitate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N2752</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9876</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl octanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21742</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, sodium salt [1-14C]</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC084</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9224-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105547</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer UV/VIS Lambda 35</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 820 Phosphorimager</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>NA</td>
			<td>Photostimulable Luminescence scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>NA</td>
			<td>Radioactivity Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>ThermoSpectronic</td>
			<td>NA&#160;</td>
			<td>Breakage of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatography paper 3MM Chr</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030917</td>
			<td>TLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinorhizobium meliloti 1021our</td>
			<td>reference 34</td>
			<td></td>
			<td>studied strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69451</td>
			<td>protein expression strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET9a vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69431</td>
			<td>protein expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET17b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69663</td>
			<td>protein expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352057</td>
			<td>radiolabeling of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125.15</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9135</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine, dipalmitoyl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6267</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-monopalmitin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1640</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining substrate specificities for lipase and phospholipase candidates

I microrganismi producono un ampio spettro di lipasi (fosfo) che vengono secreti per rendere substrati esterni disponibili per l&#39;organismo. In alternativa, altri (fosfo) lipasi possono essere fisicamente associate con l&#39;organismo producendo causando un turnover di lipidi intrinseche e spesso dando origine ad un rimodellamento delle membrane cellulari. Sebbene potenziali (fosfo) lipasi possono essere previsti con un certo numero di algoritmi quando la sequenza del gene / proteina è disponibile, prova sperimentale delle attività enzimatiche, specificità di substrato e potenziali funzioni fisiologiche è spesso non è stata ottenuta. Questo manoscritto descrive l&#39;ottimizzazione delle condizioni di analisi per i potenziali (fosfo) lipasi con specificità di substrato sconosciute e come impiegare queste condizioni ottimali nella ricerca per il substrato naturale di un rispettivo (fosfo) lipasi. Usando substrati cromogeni artificiali, come i derivati p -nitrophenyl, può aiutare a rilevare un minoreattività enzimatica per un (fosfo) lipasi previsto in condizioni standard. Avendo riscontrato un attività enzimatica tale minore, i parametri distinti di un saggio enzimatico possono essere variate per ottenere un&#39;idrolisi più efficiente del substrato artificiale. Dopo aver determinato le condizioni in cui un enzima funziona bene, una varietà di potenziali substrati naturali devono essere analizzati per la loro degradazione, un processo che può essere seguita con metodi cromatografici distinti. La definizione di specificità di substrato per nuovi enzimi, fornisce spesso ipotesi per un potenziale ruolo fisiologico di questi enzimi, che poi possono essere testati sperimentalmente. Seguendo queste linee guida, siamo stati in grado di identificare una fosfolipasi C (SMc00171) che degrada fosfatidilcolina di phosphocholine e diacylglycerol, in una fase cruciale per il rimodellamento delle membrane nel batterio Sinorhizobium meliloti dalle condizioni di fosforo-limitante della crescita. Per due predetto patatin-come fosfolipasi (SMc00930 e SMc01003) dello stesso organismo, potremmo ridefinire le loro specificità di substrato e chiarire che SMc01003 è una lipasi diacilglicerolo.

Attività di specifici PC fosfolipasi C SMc00171 con Bis- p -nitrophenyl fosfato Estratti privi di cellule ottenute da E. coli BL21 (DE3) pLysS x, che avevano smc00171 espressi, sono stati studiati per la loro capacità di idrolizzare bis- p esteri -nitrophenyl fosfato, utilizzando un saggio enzimatico spettrofotometrica, misurando la -NP p formata. Nessuna attività idrolitica era presente in estratti privi di cellule ottenute da E. coli BL21 (DE3) x pLysS ospitare un vettore vuoto pET9a (dati non riportati) quando bis- p -nitrophenyl fosfato è stato impiegato come substrato. Corsi di tempo per la -NP p formata indicano che vi è una forte dipendenza dalla quantità di estratto cellulare (da E. coli BL21 (DE3) pLysS x, che aveva smc00171 espresso) aggiunto al test (Figura 2A). Se la quantità di prodotto P -NP formata dipenderebbe solo dalla concentrazione dell&#39;enzima, va osservato una correlazione lineare tra enzima (proteina) concentrazione impiegato e prodotto formatosi dopo un certo tempo. Chiaramente, questo non è il caso per gli estratti privi di cellule ottenute da E. coli BL21 (DE3) pLysS x, che aveva smc00171 espresso (Figura 2B). Sebbene ci potrebbero essere diverse ragioni per una dipendenza esponenziale dell&#39;attività enzimatica sulla concentrazione proteica 21, un motivo frequente è che al momento la diluizione di un estratto proteina enzimatica contenente, altri componenti estratto che possono essere limitanti per l&#39;attività enzimatica, cioè potenziali cofattori , sono diluiti pure. In questi casi, attività enzimatiche inaspettatamente bassi sono registrati con estratti privi di cellule diluite. Includendo una concentrazione saturante di 3 mM MnCl 2 nel saggio enzimatico, il p<html> Prodotto -NP formata dopo un certo tempo dipende esclusivamente dalla quantità di enzima aggiunto (dati non mostrati) che indica che MnCl 2 era un componente limitante per l&#39;attività SMc00171 in estratti privi di cellule di E. coli. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54613/54613fig2.jpg" /> Figura 2. Determinazione della SMc00171 (fosfolipasi) l&#39;attività utilizzando il substrato artificiale bis- p -nitrophenyl fosfato. Il corso di tempo per la formazione p -NP è dimostrato impiegando cell-free estratti di proteine (● 10 ug / ml, ■ 15 mg / ml, ▲ 20 ug / ml) in cui era stato espresso SMc00171 (a). p -NP formato dopo 40 min di incubazione con diverse quantità di proteine estratti privi di cellule in cui era stato SMc00171 espresse (B). Le barre di errore indicano la deviazione standard..jove.com / files / ftp_upload / 54613 / 54613fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Attività del predetto Patatin simile fosfolipasi SMc00930 e SMc01003 con p -Nitrophenyl Acil Esteri di diverse lunghezze a catena Dopo espressione di smc00930 o smc01003 in E. coli BL21 (DE3) x pLysS, estratti privi di cellule sono stati ottenuti e studiati per la loro capacità di idrolizzare p -nitrophenyl esteri grassi acile. Durante il saggio enzimatico, il -NP p formatosi è stato determinato in uno spettrofotometro. Attività idrolitici minori erano presenti in estratti privi di cellule ottenute da E. coli BL21 (DE3) x pLysS con un vettore vuoto pET17b (Tabella 4) quando esteri p -nitrophenyl acilici di differelunghezze della catena nt sono stati impiegati come substrati. Quando smc01003 è stato espresso, gli estratti ottenuti hanno mostrato un aumento di idrolisi di esteri p -nitrophenyl di diversa lunghezza di catena. SMc01003 degradato il decanoato -nitrophenyl catena p ambientale nonché la catena lunga p -nitrophenyl palmitato e p -nitrophenyl stearato (Tabella 4). Come SMc01003 è un contributo importante per la formazione di acidi grassi liberi a catena lunga in S. meliloti durante la fase stazionaria 11, era sorprendente che SMc01003 sembrava agire altrettanto bene su catena media che sulla catena lunga esteri p -nitrophenyl acil (Tabella 4). Inaspettatamente, SMc01003 agisce anche su substrati a catena corta, come butirrato p -nitrophenyl o p -nitrophenyl ottanoato (dati non riportati). Tuttavia, queste ultime substrati sono anche degradati da attività presenti negli estratti privi di cellule di E. coli (vale a dire, l&#39;ospitare il vect vuotoo pET17b) senza esprimere alcun gene in più e con substrati a catena corta (C4), la metà del substrato è già degradato da E. enzimi intrinseci coli (dati non riportati). Chiaramente, SMc01003 ha bisogno di essere purificato, al fine di chiarire se SMc01003 funziona altrettanto bene su supporti breve, medio e lungo la catena. In generale, gli esteri p -nitrophenyl acilici non sembrano essere buoni substrati per SMc01003 che potrebbero essere comprensibile sapendo che SMc01003 è in realtà una lipasi DAG 11. Estratti privi di cellule, in cui era stato espresso smc00930, mostrano attività enzimatiche molto più elevati con gli esteri p -nitrophenyl (Tabella 4). Inoltre, SMc00930 è in grado di idrolizzare gli esteri p -nitrophenyl acile di diverse lunghezze di catena (C10, C12, C14, C16 e C18), anche se p -nitrophenyl palmitato (attività specifica 5.5 mmol NP min - 1 mg di proteina - 1) è chiaramente il migliore substrato per SMc00930. Ad oggi, il physiologico substrato per SMc00930 non è noto. Esplorando se Polar Lipids può funzionare come substrati per prevista (fosfo) lipasi Una volta che un (fosfo) saggio lipasi enzimatico è stato ottimizzato con substrati artificiali, miscele di lipidi radioattivi o lipidi puri possono essere testati come potenziali substrati. Quando saggiare SMc00171 contenenti estratti privi di cellule con 14 PC C-marcato in condizioni ottimali, abbiamo potuto dimostrare che SMc00171 degrada PC a DAG, un risultato che è stato confermato da studi di spettrometria di massa 8. SMc00171 degrada anche 32 PC P-marcato per phosphocholine e quindi funge da fosfolipasi C specifica-PC (PLCP) 8, che è indotta in condizioni fosforo limitativo di crescita. quandosaggiare SMc00930- o SMc01003 contenenti estratti privi di cellule con 14 C o 32 lipidi polari totali P-marcato in condizioni ottimali, abbiamo potuto dimostrare che nessuno dei fosfolipidi è degradata da SMc00930 o SMc01003 in condizioni in cui gli esteri p -nitrophenyl acilici funzionato come substrati 11. Al contrario, una fosfolipasi commerciale A 2 dal veleno di serpente era in grado di degradare una tale miscela di fosfolipidi 11. Questi risultati sono stati sorprendenti e inaspettati come sia, SMc00930 e SMc01003, sono stati previsti per essere Patatin-come fosfolipasi. Quando saggiare SMc00930- o SMc01003 contenenti estratti privi di cellule con 14 C-diacilglicerolo etichettato (DAG) in condizioni ottimali, abbiamo potuto dimostrare che DAG non è degradata da SMc00930 o dagli estratti privi di cellule di E. coli, mentre SMc01003 degrada DAG e forma composti che migrano come gli acidi grassi liberi (Figura<html> 3). Recentemente abbiamo potuto dimostrare che SMc01003 funge da lipasi DAG che possono degradare DAG o monoacilglicerolo a glicerolo e acidi grassi liberi 11 (figura 4). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54613/54613fig3.jpg" /> Figura 3. SMc01003 degrada diacilglicerolo. Estratti privi di cellule di E. coli BL21 (DE3) pLysS × esprimere SMc01003, SMc00930 o contenenti il vettore vuoto pET17b, o di tampone sono stati incubati con 14 C-DAG (ottenuto da S. meliloti) per 24 ore. Alla fine dei rispettivi periodi di incubazione, lipidi radiomarcati sono stati estratti e separati da 1D-TLC usando la fase mobile per separare i lipidi polari neutri (vedi 4.3.2). FA, acidi grassi; DAG, diacilglicerolo. Questo dato è stato modificato da [Sahonero-Canavesi et al. 2015] 11.3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54613/54613fig4.jpg" /> Figura 4. enzimatica funzione del diacilglicerolo lipasi DGLA (SMc01003). Diacilglicerolo (DAG) lipasi SMc01003 degrada DAG a monoacilglicerolo e un acido grasso, e poi monoacilglicerolo degrada ulteriormente a glicerolo e un altro acido grasso. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54613/54613fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligonucleotide Nome </td><td colspan="3"> Sequenza (5&#39;-3 &#39;) </td><td> Gene di interesse </td><td> enzima di restrizione sito aggiunto</td><td> Vettore per l&#39;espressione </td></tr><tr><td> oLOP149 </td><td colspan="3"> AGGAATA CATATG CTGAACTGGACATTCACG </td><td> smc01003 </td><td> Nde I </td><td> pET17b </td></tr><tr><td> oLOP150 </td><td colspan="3"> ACGG CTCGAG TCAACGGGACAGCGGTTC </td><td> smc01003 </td><td> Xho I </td><td> pET17b </td></tr><tr><td> oLOP151 </td><td colspan="3"> AGGAATA CATATG ACGGAGGTGGCGATGG </td><td> smc00930 </td><td> Nde I </td><td> pET17b </td></tr><tr><td> oLOP152 </td><td colspan="3"> AAA GGATCC TTATATCCCTTTCCTCCACC </td><td> smc00930 </td><td> Bam HI </td><td> pET17b </td></tr><tr><td> cgpho171u </td><td colspan="3"> AGCT CATATG GCGGCGGCATCGGCACCCCACAG </td><td> smc00171 </td><td> Nde I </td><td> pET9a </td></tr><tr><td>cgpho171d </td><td colspan="3"> ACGT GGATCC TCAGGCGGCCTGCGGTGCGAACC </td><td> smc00171 </td><td> Bam HI </td><td> pET9a </td></tr><tr><td colspan="7"> Le lettere in grassetto indicano siti di restrizione. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Oligonucleotidi usato per amplificare e clone previsto fosfo (lipasi) geni in pET17b o pET9a vettoriale. Oligonucleotidi primer sono stati progettati utilizzando il software descritto 15. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td> Assay per SMc00171 </td><td> Assay per SMc01003 </td><td> Assay per SMc00930 </td></tr><tr><td> Azione </td><td> Componente </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><strong&gt; 2 M </td><td> Tris-HCl, pH 8,5 </td><td></td><td></td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 2 M </td><td> Tris-HCl, pH 9,0 </td><td></td><td> 25 ml </td><td></td></tr><tr><td> 1 M </td><td> dietanolammina-HCl, pH 9.8 </td><td> 50 microlitri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 M </td><td> NaCl </td><td> 40 ml </td><td> 150 ml </td><td> 150 ml </td></tr><tr><td> 1% </td><td> Triton X-100 </td><td></td><td> 200 ml </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 50 mm </td><td> p- nitrofenil palmitato </td><td></td><td> 12,5 ml </td><td> 12,5 ml </td></tr><tr><td> 200 mM </td><td> bis- fosfato nitrofenil p- </td><td> 2,5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cell-libero estratto (1 mg Protein / ml) con il gene candidato espresso </td><td></td><td> 20 microlitri </td><td> 100 pl </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td></td><td> acqua bidistillata </td><td> 887.5 ml </td><td> 512.5 ml </td><td> 611.5 ml </td></tr><tr><td> volume finale </td><td></td><td> 1 ml </td><td> 1 ml </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Sistemi di pipettaggio per saggi enzimatici ottimizzati con p artificiale substrati -nitrophenyl estere. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td> Saggio per smc00171 -encoded fosfolipasi C </td><td> Assay per smc01003 - codificato DAG lipasi </td><td> Saggio Ottimizzato per fosfolipasi Un&#39;attività </td></tr><tr><td> Azione </td><td> Componente </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 M </td><td> Tris-HCl pH 8.5 </td><td></td><td></td><td> 2,5 ml </td></tr><tr><td> 2 M </td><td> Tris-HCl pH 9,0 </td><td></td><td> 2,5 ml </td><td></td></tr><tr><td> 100 mM </td><td> MnCl 2 </td><td> 3 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 M </td><td> Dietanolammina-HCl pH 9.8 </td><td> 5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 M </td><td> NaCl </td><td> 4 pl </td><td> 15 ml </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> 1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 2 ml </td><td> 20 microlitri </td><td> 20 microlitri </td></tr&gt; <tr><td></td><td> 14 C-marcato lipidi (fosfolipidi) </td><td></td><td></td><td> 20 l (5000 cpm) </td></tr><tr><td></td><td> 14 C-marcato lipidi (PC) </td><td> 20 l (5000 cpm) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 C-marcato lipidi (DAG) </td><td></td><td> 20 l (5000 cpm) </td><td></td></tr><tr><td> 10 mg / ml </td><td> estratto proteico con geni candidati espressi </td><td> 0,5 ml </td><td> 5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> acqua bidistillata </td><td> 87,5 ml </td><td> 77.5 ml </td><td> 77.5 ml </td></tr><tr><td> Volume finale </td><td></td><td> 100 pl </td><td> 100 pl </td><td> 100 pl </td></tr></tbody></table> tavolo3. schemi di pipettaggio per saggi enzimatici (ottimizzate per fosfo) lipasi con substrati lipidici radioattivi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> l&#39;attività è espressa in unità (mmol nitrofenolo / mg di proteina x min) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Numeri in grassetto indicano acile lunghezza della catena di p substrato -nitrophenyl estere </td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 14 </td><td> 16 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> E. coli estratto (sullo sfondo) </td><td> 16 ± 0.3 </td><td> 10 ± 1.1 </td><td> 13 ± 0.3 </td><td> 11 ± 0.8 </td><td> 10 ± 0,6 </td></tr><tr><td> SMc00930 espresso in E. estratto coli </td><td> 1.839 ± 283 </td><td&gt; 1.839 ± 283 </td><td> 2.873 ± 117 </td><td> 5.517 ± 394 </td><td> 3.402 ± 65 </td></tr><tr><td> SMc01003 espresso in E. estratto coli </td><td> 43 ± 2.1 </td><td> 29 ± 2 </td><td> 20 ± 0.7 </td><td> 25 ± 1.5 </td><td> 22 ± 0.9 </td></tr><tr><td> SMc00930 meno sfondo </td><td> 1.823 ± 283 </td><td> 1.829 ± 283 </td><td> 2.860 ± 117 </td><td> 5.506 ± 394 </td><td> 3.392 ± 65 </td></tr><tr><td> SMc01003 meno sfondo </td><td> 27 ± 2.1 </td><td> 18 ± 2 </td><td> 7 ± 0.7 </td><td> 14 ± 1.5 </td><td> 12 ± 0.9 </td></tr></tbody></table> Tabella 4. p esteri -Nitrophenyl acile come substrati per lipasi Patatin simile SMc00930 e SMc01003.

Watch this Scientific Journal Video about Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates at JoVE.com

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

defining-substrate-specificities-for-lipase-phospholipase

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.9K Views.  Universidad Nacional Autónoma de México. Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

Video: Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Ricerca

Biochimica

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and paleoenvironmental research from recent historical periods back to over 10 million years ago. Bulk approaches provide a representative sample for the period of enamel mineralization, while sequential samples within a tooth can track dietary and environmental changes during this period. While these methodologies have been widely applied and described in archaeology, ecology, and paleontology, there have been no explicit guidelines to aid in the selection of necessary lab equipment and to thoroughly describe detailed laboratory sampling and protocols. In this article, we document textually and visually, the entire process from sampling through pretreatment and diagenetic screening to make the methodology more widely available to researchers considering its application in a variety of laboratory settings.

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been used as a proxy for individual diet and environmental reconstruction. Here, we provide a detailed description and visual documentation of bulk and sequential tooth enamel sampling as well as pretreatment of archaeological and paleontological samples.

Campionamento e pretrattamento dello smalto dei denti carbonato per carbonio stabile e analisi di isotopi di ossigeno

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Misurare e interpretare i tassi di consumo di ossigeno in tutto Vola testa segmenti

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human cancers, is processed by farnesylation and carboxymethylation due to the presence of a &#39;CAAX&#39; box motif at the C-terminus. An engineered baculovirus system was used to express farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in insect cells and has been described previously. Here, we describe the detailed, practical purification and biochemical characterization of the protein. Specifically, affinity and ion exchange chromatography were used to purify the protein to homogeneity. Intact and native mass spectrometry was used to validate the correct modification of KRAS4b and to verify nucleotide binding. Finally, membrane association of farnesylated and carboxymethylated KRAS4b to liposomes was measured using surface plasmon resonance spectroscopy.

Prenylation is an important modification on peripheral membrane binding proteins. Insect cells can be manipulated to produce farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in quantities that enable biophysical measurements of protein-protein and protein-lipid interactions

KRAS4b ricombinante completamente elaborato: isolamento e caratterizzazione delle proteine di Farnesylated e Metylated

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as oxaloacetate decarboxylase in mitochondria. This article presents a series of methods for the extraction and purification of FAHD1 from swine kidney and mouse liver. Covered methods are ionic exchange chromatography with fast protein liquid chromatography (FPLC), preparative and analytical gel filtration with FPLC, and proteomic approaches. After total protein extraction, ammonium sulfate precipitation and ionic exchange chromatography were explored, and FAHD1 was extracted via a sequential strategy using ionic exchange and size-exclusion chromatography. This representative approach may be adapted to other proteins of interest (expressed at significant levels) and modified for other tissues. Purified protein from tissue may support the development of high-quality antibodies, and/or potent and specific pharmacological inhibitors.

This protocol describes how to extract fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) from swine kidney and mouse liver. The listed methods may be adapted to other proteins of interest and modified for other tissues.