Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

NOTA: Il protocollo qui descritto per l&#39;utilizzo di guaina CE-MS per gli studi di profili metabolici è solo per uso in laboratorio. Le procedure descritte di seguito si basano su 4,5 lavoro di recente pubblicazione. Ulteriori dettagli sperimentali possono essere trovati in questi documenti. Prima di utilizzare questo protocollo, consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS). Si prega di utilizzare tutte le procedure di sicurezza di laboratorio appropriate, tra cui occhiali di sicurezza, camice da laboratorio e guanti, quando conduce gli esperimenti descritti in questo protocollo. 1. Preparazione dei reagenti Solutions e Campioni <ol><li> Preparazione del fondo elettrolita (DTF) <ol><li> Preparare una nuova soluzione BGE (10% (v / v) di acido acetico, pH 2.2) ogni giorno. </li><li> Aggiungere 9,0 ml di acqua in una fiala di vetro da 10 ml e aggiungere 1,0 ml di acido acetico in acqua in una cappa aspirante. Miscelare la soluzione accuratamente con un vortice. </li></ol></li><li> Preparazione del metabolita standarmiscela d <ol><li> Sciogliere 50 ml di una miscela standard di 50 micron cazione contenente 60 metaboliti cationica in 50 ml di acqua e mescolare accuratamente la soluzione. Conservare a -80 ° C quando non in uso. </li><li> Sciogliere 50 ml di un anione miscela standard 50 micron contenente 30 metaboliti anionici in 50 ml di acqua e mescolare accuratamente la soluzione. Conservare questa soluzione, in aliquote per evitare cicli di congelamento / scongelamento della stessa miscela standard, a -80 ° C quando non in uso. NOTA: Il metabolita miscele standard sono stabili per 3 mesi se conservato correttamente a -80 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione di estratti dalla linea cellulare di glioblastoma <ol><li> Lavare le cellule U-87 mg di glioblastoma aderenti umani tre volte con 1 ml ghiacciata 0,9% soluzione di cloruro di sodio 21. </li><li> Aggiungere 2 ml di soluzione di metanolo / acqua ghiacciata (8/2, v / v) per le cellule aderenti e raschiare con una gomma con punta raschietto cella 21. </li&gt; <li> Raccogliere la soluzione di metanolo / acqua in un tubo e ultrasonicate per 2 min. </li><li> Aggiungere cloroformio per la frazione di metanolo / acqua (rapporto finale 8/8/2, v / v / v) e centrifugare il campione per 10 minuti a 16.100 xg e 4 ° C. </li><li> Raccogliere lo strato metanolo / acqua e si evapora questa frazione usando un concentratore a vuoto. Ricostituire il materiale essiccato in 50 microlitri di acqua per l&#39;analisi mediante guaina CE-MS. Quando non in uso conservare il campione a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Impostazione del CE-MS Sistema senza guaina <ol><li> L&#39;installazione della cartuccia silice fusa nudo con l&#39;emettitore punta porosa <ol><li> Inserire una nuova cartuccia silice fusa nudo con un emettitore punta porosa (lunghezza 30 micron di diametro interno x 90 cm totale) nello strumento CE. </li><li> Applicare un risciacquo in avanti a 50 psi per 15 minuti con il software di controllo dello strumento CE utilizzando il 100% di metanolo e controllare visivamente se il liquido fluisce fuori dal CAPILpresa lary durante questa fase di risciacquo. effettuare anche un risciacquo in direzione opposta a 50 psi per 5 minuti utilizzando la soluzione BGE esaminare visivamente che il liquido scorre fuori dal capillare conduttivo. </li><li> Ripetere passaggio 2.1.2 ad una pressione di 100 psi in caso nessuna formazione goccia liquido è stato osservato in uscita capillare. Installare una nuova cartuccia di silice fusa nudo se non è stata osservata formazione di gocce di liquido durante questa fase. </li><li> Risciacquare il capillare di separazione con acqua a 50 psi per 10 minuti, seguita da 0,1 M NaOH a 50 psi per 10 minuti, poi con acqua a 50 psi per 10 minuti e infine con BGE a 50 psi per 10 min. NOTA: I passaggi 2.1.1 fino a 2.1.4 sono necessari solo per l&#39;installazione di una nuova cartuccia capillare. </li></ol></li><li> Accoppiamento del capillare porosa punta emettitore di ESI-MS NOTA: Prima di accoppiare il capillare CE a MS, assicurarsi che lo strumento è stato calibrato MS e collegato al sistema CE. Impostare la tensione ESI per0. Montare lo strumento MS con una fonte nanospray. Gas 1, gas 2 e la temperatura del riscaldatore dell&#39;interfaccia non sono stati applicati come ESI a portate molto basse avviene semplicemente applicando la tensione di spruzzatura ione impostato a 1500 V. Impostare la tenda a 5 psi. <ol><li> Rimuovere la punta spruzzatore della cartuccia silice fusa dal tubo dell&#39;acqua e installarlo nella adattatore di origine nanospray per accoppiare allo strumento MS. Assicurarsi che l&#39;altezza delle fiale BGE nello strumento CE corrisponde l&#39;altezza della punta spruzzatore. </li><li> Controllare il flusso di liquido attraverso il capillare conduttivo mediante risciacquo con BGE a 50 psi per 5 min. Durante questo passo risciacquo deve rilevare una formazione goccia alla base dell&#39;ago spruzzatore ESI. </li><li> Lavare il capillare di separazione con BGE a 50 psi per 10 minuti nella direzione in avanti. formazione di gocce deve essere osservata alla punta della punta emettitore poroso (punta spruzzatore) durante questa fase. </li><li> Posizionare la punta emettitore poroso per l&#39;ingresso della bocca MS ad una distanza di circa 2 a 3 mm. </li><li> Applicare una tensione di 30 kV utilizzando un tempo di rampa di 1 min e cominciare ad acquisire i dati MS nel range m / z da 65 a 1.000 m / z per gli studi di profili metabolici utilizzando prima una tensione ESI di 0. NOTA: Lo spettro di massa fosse nulla di segnale come non ci dovrebbero essere elettrospray. </li><li> Impostare la tensione ESI a 1.000 V, mentre portare avanti la misurazione dei dati. Aumentare la tensione ESI con incrementi di 200 V fino a quando un segnale di fondo costante si registra per almeno 15 minuti. </li><li> Ottimizzare la punta posizione emettitore poroso rispetto al centro della bocca MS muovendolo in x, y, z direzione per vedere quale posizione fornisce il massimo ed il segnale MS più stabile (totale elettroferogramma ion). </li><li> Dopo ottimizzare la posizione dell&#39;emettitore punta porosa e determinare la tensione ottimale ESI, impostare la tensione ESI a 0 V e diminuire la tensione CE da 30 kV a 1 kV utilizzando un tempo di rampa di 5 min. </li><li> Creare un metodo usin MSg la tensione ottimale ESI e un metodo CE sullo strumento CE per l&#39;analisi degli standard metaboliti e campioni biologici. </li></ol></li></ol> 3. Analisi del metabolita standard e dei campioni biologici <ol><li> La valutazione delle prestazioni del sistema-CE MS guaina <ol><li> Trasferimento 20 microlitri della miscela standard metabolita anionico in un vuoto 100 microfiala ml (PCR flaconcino) che si inserisce in una fiala CE e mettere questo vial nel vassoio campione di ingresso. NOTA: Il volume minimo richiesto nella microprovetta per un&#39;iniezione affidabile è di 2 ml. <ol><li> Avviare il metodo modalità di ioni negativi di acquisizione MS creato durante la fase 2.2.9 e successivamente avviare la sequenza CE utilizzando il software che controlla lo strumento CE. </li><li> Risciacquare il capillare di separazione con BGE a 50 psi per 3 min seguita da iniezione a 2.0 psi per 60 sec (20 nl corrispondente al 3% del volume capillare) e poi per iniezione BGE a 1,0 psi per 10sec. NOTA: In seguito, l&#39;acquisizione dei dati MS viene attivato. </li><li> Applicare una tensione di -30 kV con un tempo di rampa di 1,0 min con una pressione di 0,5 psi per 30 min in ingresso. Dopo 30 min separazione elettroforetica, interrompere acquisizione dati MS e diminuire la tensione CE a -1 kV utilizzando un tempo di rampa di 5 min (una graduale diminuzione della tensione CE dopo la separazione elettroforetica migliora la durata della punta porosa capillare emettitore). </li></ol></li><li> Tra le iniezioni del campione, sciacquare il capillare con acqua, 0,1 M di idrossido di sodio, acqua e BGE ciascuno a 30 psi per 3 min. </li><li> Analizzare i dati registrati mediante la determinazione dei tempi di migrazione e l&#39;intensità della miscela metabolita anionico analizzato segnale. </li><li> Valutare se le norme metaboliti anionici appaiono nella regione tra 10 e 28 min. </li><li> Controllare se tre isomeri strutturalmente affini, vale a dire, D-glucosio-1-fosfato, D-glucosio-6-fosfato e D-fruttosio-6-fosfato sonoparzialmente separata, cioè, la risoluzione tra i primi due picchi è circa 0,75 e degli ultimi due picchi è circa 0,50 (vedi Figura 1). NOTA: Una risoluzione di 1.5 indica una separazione di base di due picchi adiacenti. </li><li> Ripetere i punti 3.1.1 e 3.1.2 per la miscela metabolita cationico. Assicurarsi che il rilevamento MS è ora in modalità ioni positivi e la tensione CE è +30 kV. </li><li> Analizzare i dati registrati mediante la determinazione dei tempi di migrazione e l&#39;intensità della miscela metabolita cationico analizzato segnale. </li><li> Valutare se le norme metabolita cationici appaiono nella regione tra 8 e 22 min. Controllare se isoleucina e leucina stanno migrando tra il 15 e il 15,5 min e determinare se la risoluzione è di circa 0,5. </li></ol></li><li> Analisi di campioni biologici <ol><li> Ripetere i punti 3.1.1 e 3.1.2 per anionico profili metabolici dell&#39;estratto della linea cellulare di glioblastoma. NOTA: L&#39;aria metabolicatenda ottenuto dopo pretrattamento campione corrisponde ad una densità cellulare di circa 20 cellule / nl, quindi, una iniezione nl 20 è l&#39;equivalente di 400 cellule per analisi. . </li><li> Crea un elettroferogramma ioni estratti per l&#39;acido lattico metabolita (m / z 89,0243) con 5 MDA accuratezza di massa e verificare se l&#39;intensità del segnale è al di sopra di 100.000 conteggi. </li><li> Ripetere i punti 3.1.1 e 3.1.2 per cationica profili metabolici dell&#39;estratto della linea cellulare di glioblastoma. NOTA: A altamente ricco di informazioni elettroferogramma totale di ioni deve essere osservato per 20 iniezione nl in questa modalità. </li><li> Dopo analisi o quando non in uso, risciacquare il capillare con acqua a 50 psi per 15 min e memorizzare la parte di ingresso del capillare in un&#39;acqua flaconcino contenente e la sezione poroso (parte presa) in una provetta contenente anche acqua. </li></ol></li></ol>

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We have nothing to disclose.

Una guaina Metodo CE-MS utilizzando un emettitore punta porosa è stata presentata per l&#39;analisi dei metaboliti altamente polari e cariche. Una caratteristica unica di questo approccio è che i metaboliti anionici o cationici possono essere profilate da un solo passaggio MS rilevamento e la tensione CE polarità. Una vasta gamma di metaboliti altamente polari e cariche in campioni biologici possono essere analizzati con una elevata efficienza di separazione, che è di fondamentale importanza per i metaboliti strutturalmente simili, e con limiti di rilevabilità nel (basso) gamma nanomolari. Il protocollo presentato focalizzato sull&#39;uso di guaina CE-MS per profili metabolici degli estratti cellulari per esemplificare l&#39;utilità del metodo di profili metabolici di un campione biologico. L&#39;approccio qui descritto può essere utilizzato anche per profili metabolici di altri tipi di campioni biologici, quali urina umana 5, dato che una corretta procedura di pretrattamento del campione viene utilizzato. La guaina CE-MS method è basato su un emettitore punta porosa che permette l&#39;utilizzo della struttura intrinsecamente bassa portata di CE. In questo contesto, un segnale stabile ESI è un pre-requisito per gli studi di profili metabolici riproducibili. Pertanto, è importante che la punta spruzzatore sia correttamente posizionato davanti all&#39;ingresso MS. In questa configurazione, il processo ESI dipende principalmente dalla natura del BGE e quindi, ottimizzazione BGE è critica. La configurazione senza guaina è meno versatile rispetto alla guaina-liquido sistemi CE-MS in cui possono essere aggiunti tutti i tipi di composizioni guaina-liquido per migliorare l&#39;efficienza di ionizzazione. L&#39;ago guaina spruzzatore ESI ha bisogno di essere completamente riempita di liquido conduttivo (ad esempio, la soluzione BGE). Un segnale ESI instabile può derivare da un capillare parzialmente o completamente collegato. Risciacquo ad alta pressione con BGE può risolvere questo problema. Altrimenti il ​​capillare di separazione deve essere sostituito. Prima di valutazione delle prestazioni analitiche, un segnale di fondo ESI stabiledovrebbe essere generato prima che sia coerente da un giorno all&#39;altro. Le prestazioni analitiche della guaina metodo di CE-MS per gli studi di profili metabolici deve essere controllato quotidianamente utilizzando miscele standard metabolita. Nelle stesse condizioni sperimentali, tempi di migrazione coerenti, cioè, variazione di sotto del 3% per entro giorni (n = 10) e tra giorni (n = 5) utilizzando una iniezione da 20 nl di una miscela standard metabolita (12.5 mM), picco altezze / aree (variazione inferiore al 15%) e targhe (comprese tra 60.000 e 400.000) dovrebbero essere ottenuti. Limiti di rilevazione dovrebbero essere nella gamma nanomolari per la maggior parte standard metaboliti. Solo quando vengono soddisfatti questi criteri è il metodo pronto per profili metabolici di campioni biologici. In caso contrario, lo strumento MS ha bisogno di essere sintonizzati e ricalibrato o poroso punta capillare emettitore deve essere cambiato. Una fase di risciacquo efficace tra CE-MS analisi è di grande importanza, non solo perprevenire potenziali riporto ma anche per mantenere le prestazioni di separazione. riporto potenziale può essere causato da fiale BGE contaminati con il campione e quindi risolti con la sostituzione con nuove fiale BGE. Quando il metodo CE-MS guaina non è in uso, è importante scollegare il capillare separazione e memorizzare il lato di ingresso del capillare in acqua e l&#39;esterno sommerso con il manicotto protettivo in una provetta contenente acqua per prolungare la vita capillare. In sintesi, la guaina metodo di CE-MS proposto mostra un forte potenziale di profili metabolici di campioni biologici se utilizzato secondo le modalità riportate nel presente protocollo. In questa fase, i dati di confronto inter-laboratorio sono sicuramente necessaria per guaina CE-MS al fine di valutare la (a lungo termine) la riproducibilità e la robustezza di questo approccio per la metabolomica. Questo protocollo può stimolare un tale studio. devono ancora varie sfide di analisi da considerare. Per perf ottimaleormance, l&#39;attuale CE dovrebbe essere mantenuta preferibilmente al di sotto 5 μA e in questa fase i capillari porosi emettitori di punta vengono forniti solo a una lunghezza di 91 centimetri, che possono ostacolare lo sviluppo di test high-throughput. Inoltre, un buffer partire separazione pH è stato usato per anionico profili metabolici che non può essere il più ottimale per ottenere una separazione di base di fosfati zucchero strutturalmente correlati. Altrettanto importante è che solo metaboliti anionici possono essere analizzati che sono (parzialmente) caricato negativamente alle condizioni di separazione usati. Il passo successivo è quello di valutare l&#39;utilità del metodo sheathless CE-MS per studi clinici profili metabolici come attualmente, un singolo porosa punta capillare emettitore può essere utilizzato solo per l&#39;analisi di un massimo di 100 campioni biologici. Nel complesso, l&#39;ulteriore sviluppo nell&#39;approccio guaina CE-MS si aprirà una nuova direzione nel campo della metabolomica, vale a dire, verso una comprensione più profonda delle funzioni biologiche in scasi ampie limitato.

In metabolomica contemporanei, di fascia alta tecniche di separazione analitica sono utilizzati per analizzare una vasta gamma di classi metaboliti per ottenere un rappresentante lettura fuori dello stato fisiologico di un organismo 1. L&#39;obiettivo finale di uno studio metabolomica è quello di ottenere una risposta ad una determinata questione biologica / clinica. Allo stato attuale, il database metaboloma umano è composto di oltre 40.000 voci di metaboliti che rappresentano composti sia endogeni ed esogeni (quest&#39;ultimo originari di sostanze nutritive, microbiota, droghe e altre fonti) 2. Data la grande diversità nelle proprietà fisico-chimiche e gamma di concentrazione di questi metaboliti, molteplici tecniche analitiche con diversi meccanismi di separazione dovrebbero essere usati in combinazione per profilo come molti metaboliti possibili in un dato campione biologico. Ad esempio, Psychogios et al. Ha utilizzato una combinazione di cinque tecniche di separazione analitiche per il prof metabolicailing di siero umano conseguente rilevazione di oltre 4.000 chimicamente diversi metaboliti 3. In questo lavoro, l&#39;attenzione sarà rivolta alle strategie di recente sviluppo CE-MS per profili metabolici di campioni biologici 4,5. In CE, elettroforesi più specificamente capillare zona (CZE, normalmente chiamato come CE), i composti sono separati sulla base del loro rapporto carica-dimensioni e, di conseguenza, questa tecnica analitica è particolarmente adatto per l&#39;analisi dei metaboliti polari e cariche. Il meccanismo di separazione del CE è fondamentalmente differente da tecniche cromatografiche-based, fornendo così una vista complementare sulla composizione metabolico di campioni biologici 6-8. Soga e collaboratori sono stati i primi a dimostrare l&#39;utilità del CE-MS per la profilazione globale di metaboliti in campioni biologici 9,10. Fino ad ora, la fattibilità e l&#39;utilità di CE-MS per la metabolomica è stato ampiamente dimostrato 11-15.CE è generalmente accoppiato a MS mediante una guaina liquida tecnica 16,17 interfacciamento; tuttavia, a causa della diluizione dell&#39;effluente capillare dalla guaina-liquido, la sensibilità di rilevazione è intrinsecamente compromessa. Recentemente, è stato dimostrato che l&#39;uso di un&#39;interfaccia sheathless migliorato significativamente la copertura di rivelazione di metaboliti presenti nei vari campioni biologici rispetto a CE-MS utilizzando una classica interfaccia sheath-liquido 5,18,19. Ad esempio, circa 900 caratteristiche molecolari sono stati rilevati nelle urine umane da guaina CE-MS, mentre circa 300 caratteristiche molecolari sono stati osservati con guaina-liquido CE-MS 5. L&#39;interfaccia di guaina utilizzata si basava su un emettitore punta porosa, che è stato inventato da Moini 20, permettendo l&#39;uso efficace della proprietà intrinsecamente basso flusso di CE in combinazione con nano-ESI-MS. Al fine di stimolare l&#39;uso di guaina CE-MS nel campo della metabolomica,un protocollo è presentato descrive come questo approccio può essere utilizzato per l&#39;analisi dei metaboliti altamente polari in campioni biologici, come esemplificato per l&#39;analisi di estratti dalla linea cellulare glioblastoma. E &#39;dimostrato che il metodo sheathless CE-MS per la profilatura dei metaboliti cationici può essere utilizzato anche per la profilatura dei metaboliti anionici utilizzando esattamente le stesse condizioni capillari e separazione, riducendo così i tempi di analisi e fornendo una piattaforma analitica unico per la profilatura globale metaboliti cariche. Il protocollo descrive anche una strategia per l&#39;allineamento efficace della guaina poroso emettitore punta con lo strumento MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

In metabolomica, una vasta gamma di tecniche analitiche viene utilizzato per la profilatura globale (endogeni) metaboliti in campioni complessi. In questo documento, un protocollo è presentato per l&#39;analisi dei metaboliti anionici e cationici in campioni biologici mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa (CE-MS). CE è ben adatto per l&#39;analisi dei metaboliti altamente polari e cariche come composti vengono separati sulla base del loro rapporto carica-size. Una guaina interfacciamento progettazione sviluppata di recente, vale a dire, una interfaccia punta porosa, è usato per l&#39;accoppiamento CE a ionizzazione electrospray (ESI) MS. Questo approccio interfacciamento consente l&#39;uso efficace della struttura intrinsecamente bassa portata di CE in combinazione con MS, causando limiti di rilevazione nanomolari per una vasta gamma di classi di metaboliti polari. Il protocollo qui presentata si basa sull&#39;impiego di un capillare in silice fusa nudo con un emettitore punta porosa in condizioni di separazione basso pH per l&#39;analisi di unvasta gamma di classi di metaboliti in campioni biologici. Si dimostra che lo stesso metodo sheathless CE-MS può essere utilizzato per la profilatura dei metaboliti cationici, compresi aminoacidi, nucleosidi e piccoli peptidi, o metaboliti anionici, tra fosfati zucchero, nucleotidi e acidi organici, soltanto commutazione del rilevamento MS e tensione di polarità separazione. Altamente ricchi di informazioni profili metabolici in vari campioni biologici, come ad esempio urina, fluido e estratti della linea cellulare di glioblastoma cerebro-spinale, possono essere ottenuti da questo protocollo in meno di 1 ora di analisi CE-MS.

Il metodo guaina CE-MS proposto è in grado di fornire altamente efficiente, cioè, numeri di lastra che vanno da 60.000 a 400.000, profili per metaboliti anionici e cationici a limiti di rivelazione nanomolari con acido acetico al 10% (pH 2,2) come BGE. Il rendimento di separazione del metodo per l&#39;analisi dei metaboliti anionici altamente polari è dimostrato per tre strutturalmente correlate isomeri zucchero fosfato (Figura 1). Sebbene una separazione di base non è stato ottenuto per questi tre analiti, una parziale separazione è sufficiente a permetterne la rivelazione selettiva da MS come questi analiti hanno la stessa massa esatta. Il potenziale del metodo CE-MS guaina, per profili metabolici del numero limitato di cellule, cioè, una iniezione nl 20 corrisponde a 400 cellule (densità delle cellule è di circa 20 cellule / nl), è dimostrata per l&#39;analisi dei metaboliti cationici in un estratto della linea cellulare glioblastoma (Figura 2), in cui sono stati individuati oltre 300 caratteristiche molecolari sopra S / N-ratio ≥ 5. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Figura 1. Analisi di isomeri zucchero fosfato dalla guaina CE-MS. Elettroferogramma ioni estratti per tre isomeri di fosfato di zucchero (25 micron) ottenute con guaina CE-MS in modalità ioni negativi. Condizioni sperimentali: BGE, 10% di acido acetico (pH 2,2); tensione separazione, -30 kV (+0,5 psi applicata all&#39;ingresso del capillare CE); iniezione del campione, 2,0 psi per 60 sec. Riprodotto con il permesso 4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi di isoleucina e leucine da guaina CE-MS. elettroferogramma ioni Estratto di due isomeri aminoacidi (25 micron) ottenute con guaina CE-MS in modalità ioni positivi. Condizioni sperimentali: BGE, 10% di acido acetico (pH 2,2); tensione separazione, +30 kV; iniezione del campione, 2,0 psi per 60 sec. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Figura 3. Potenziale di guaina CE-MS per profilatura metaboliti cationici in un estratto di linee cellulari. Profilo metabolico (totale elettroferogramma ion) osservata in un estratto di una linea cellulare di glioblastoma con guaina CE-MS in modalità ioni positivi. Condizioni sperimentali: BGE, 10% di acido acetico (pH 2,2); tensione separazione, +30 kV; iniezione del campione, 2,0 psi per 60 sec. Riprodotto con il permesso 4 </sup&gt;. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Un protocollo per profili metabolici di campioni biologici da elettroforesi capillare-spettrometria di massa con un design di interfaccia punta porosa guaina è presentato.

Guaina elettroforesi capillare-spettrometria di massa per metaboliche Profiling di campioni biologici

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

sheathless-capillary-electrophoresismass-spectrometry-for-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.6K Views.  Leiden University.  Un protocollo per profili metabolici di campioni biologici da elettroforesi capillare-spettrometria di massa con un design di interfaccia punta porosa guaina è presentato. 

Video: Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Ricerca

Biochimica

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and isobaric labeling multiplexing capacity. Here, we introduce a deep-proteomics profiling protocol that combines 10-plex tandem mass tag (TMT) labeling with an extensive LC/LC-MS/MS platform, and post-MS computational interference correction to accurately quantitate whole proteomes. This protocol includes the following main steps: protein extraction and digestion, TMT labeling, 2-dimensional (2D) LC, high-resolution mass spectrometry, and computational data processing. Quality control steps are included for troubleshooting and evaluating experimental variation. More than 10,000 proteins in mammalian samples can be confidently quantitated with this protocol. This protocol can also be applied to the quantitation of post translational modifications with minor changes. This multiplexed, robust method provides a powerful tool for proteomic analysis in a variety of complex samples, including cell culture, animal tissues, and human clinical specimens.

We present a protocol to accurately quantitate proteins with isobaric labelling, extensive fractionation, bioinformatics tools, and quality control steps in combination with liquid chromatography interfaced to a high-resolution mass spectrometer.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of redox-regulated signaling in biological settings. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is the only direct method to assess free radicals unambiguously. Its advantage is that it detects physiologic levels of specific species with a high specificity, but it does require specialized technology, careful sample preparation, and appropriate controls to ensure accurate interpretation of the data. Cyclic hydroxylamine spin probes react selectively with superoxide or other radicals to generate a nitroxide signal that can be quantified by EPR spectroscopy. Cell-permeable spin probes and spin probes designed to accumulate rapidly in the mitochondria allow for the determination of superoxide concentration in different cellular compartments.
In cultured cells, the use of cell permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) along with and without cell-impermeable superoxide dismutase (SOD) pretreatment, or use of cell-permeable PEG-SOD,&#160;allows for the differentiation of extracellular from cytosolic superoxide. The mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) allows for measurement of mitochondrial ROS (predominantly superoxide).
Spin probes and EPR spectroscopy can also be applied to in vivo models. Superoxide can be detected in extracellular fluids such as blood and alveolar fluid, as well as tissues such as lung tissue. Several methods are presented to process and store tissue for EPR measurements and deliver intravenous 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin probe in vivo. While measurements can be performed at room temperature, samples obtained from in vitro and in vivo models can also be stored at -80 &#176;C and analyzed by EPR at 77 K. The samples can be stored in specialized tubing stable at -80 &#176;C and run at 77 K to enable a practical, efficient, and reproducible method that facilitates storing and transferring samples.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is an unambiguous method to measure free radicals. The use of selective spin probes allows for detection of free radicals in different cellular compartments. We present a practical, efficient method to collect biological samples that facilitate treating, storing, and transferring samples for EPR measurements.

Uso di risonanza paramagnetica elettronica in campioni biologici a temperatura ambiente e 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of the RNA produced during a brief period of labelling. This is done by attaching a biotin moiety to the incorporated thio group and affinity purifying, using streptavidin coated beads. Achieving a good yield of pure, newly synthesized RNA that is free of pre-existing RNA makes shorter labelling times possible and permits increased temporal resolution in kinetic studies. This is a protocol for very specific, high yield purification of newly synthesized RNA. The protocol presented here describes how RNA is extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the protocol for purification of thiolated RNA from total RNA should be effective using RNA from any organism once it has been extracted from the cells. The purified RNA is suitable for analysis by many widely used techniques, such as reverse transcriptase-qPCR, RNA-seq and SLAM-seq. The specificity, sensitivity and flexibility of this technique allow unparalleled insights into RNA metabolism.

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

The use of thiolated uracil to sensitively and specifically purify newly transcribed RNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae.

Etichettatura metabolica estremamente rapida e specifica dell'RNA In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...