We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.

1. Tejido Recogida y disección <ol><li> En cada vial contiene levadura seca, cultivo de 10 hembra adulta vuela con 10 hombres por 2-3 días. Nota: El mantenimiento de las moscas hembras bien alimentados mejorará la calidad global y el rendimiento de la producción de ovario y facilitar la disección. </li><li> Anestesiar la hembra vuela en un dióxido de carbono (CO2) de la almohadilla de volar. </li><li> Bajo el estereoscopio, coloque varias gotas de medio de RT (medio de Drosophila de Schneider suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS)) sobre una almohadilla de disección. Llevar a cabo todos los procedimientos de disección en el medio para mantener los tejidos vivos y sanos. </li><li> Coge una hembra vuela engordados con unas pinzas finas afilados de nariz en su parte inferior del tórax. Utilice otro juego de pinzas para tirar suavemente en el extremo posterior de la marcha hasta que los tejidos en el abdomen están expuestos. Separar los dos ovarios de otros tejidos (por ejemplo, las tripas). Nota: Cada ovario muestra una estructura opaca que se compongad de 16-20 ovariolas adjuntos. </li><li> Para mejorar la penetración de los reactivos, abrir los ovarios mediante tracción y pasando la punta de la pinza entre cada ovariola un par de veces. Mantener los ovarioles conectados dentro de un ovario para minimizar la pérdida de los tejidos durante los procedimientos siguientes. </li><li> La transferencia de los ovarios inmediatamente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 l de medio de Drosophila de Schneider con 10% de FBS. </li><li> Repita la disección y recoger 10-15 ovarios en cada tubo de microcentrífuga. </li></ol> 2. El etiquetado EdU <ol><li> Aspirar el medio en cada tubo, y reemplazar con 500 l de medio de Drosophila de Schneider con 10% de FBS que contiene 7 afidicolina M. Nota: afidicolina se utiliza para bloquear la síntesis de ADN nuclear mediante la inhibición de la ADN polimerasa α sin afectar la replicación del ADNmt 7, 12. Es posible aumentar la concentración a afidicolina hastaa 70 mM para conseguir una mejor inhibición. La solución madre de afidicolina 3-30 mM en DMSO se puede almacenar en la oscuridad a -20 ° C durante un máximo de 6 semanas. </li><li> Para mantener los ovarios sanos, asegúrese de que están inmersos en virtud de las soluciones mientras se cambia el medio. Utilice medio de Drosophila de Schneider con 10% de SFB al paso 2.6. </li><li> Incubar los ovarios durante 3 horas a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa con una rotación suave. <ol><li> Para el tratamiento de drogas, por ejemplo, mitocondrial carbonilo desacoplador cianuro fenilhidrazona 4-trifluorometoxi (FCCP), añadir la concentración apropiada de fármaco (por ejemplo, 10 M FCCP) en el medio después de 2 h de tratamiento afidicolina. Continuar la incubación durante otra 1 hr. </li></ol></li><li> Retire el medio que contiene afidicolina con o sin drogas. Brevemente enjuagar los ovarios con medio (afidicolina no es necesario) dos veces. </li><li> Añadir 1 ml que contiene 10 mM Edu y 7 afidicolina M medio y continuar incubating a temperatura ambiente durante 2 hr. Almacenar el EdU mM solución de 10 stock (en DMSO) a -20 ° C. </li><li> Retire el medio que contiene Edu y afidicolina. Lavar con medio (sin afidicolina) dos veces durante 3 minutos cada uno. </li></ol> 3. Tejido de fijación y permeabilización <ol><li> Preparar una solución de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4). Nota: Se utilizó paraformaldehído comercial disponible almacenada en ampollas pre-marcado. Abrir una nueva ampolla y se diluye hasta 4% antes de su uso. PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico; Se debe manipular en una campana extractora con la piel y los ojos. </li><li> Fijar ovarios con 4% de paraformaldehído durante 20 min a TA con una rotación suave. </li><li> Retire el fijador y lavar ovarios dos veces en 1 ml de 3% de BSA en PBS durante 5 min cada vez. </li><li> Para permeabilizar los tejidos, eliminar la solución de lavado y se añade 1 ml de 0,5% Triton X-100 en PBS. Incubar a TA durante 20 min. </li><li> Eliminar la solución de permeabilización y lavar dos veces en 1 mlde BSA 3% en PBS. </li></ol> 4. Detección EdU Nota: EdU detección se basa en la química &quot;clic&quot;, un Cu (I) catalizada [3 + 2] cicloadición 13, que añade azidas fluorescentes para el grupo alquino terminal de EdU, y la molécula fluorescente se somete a posterior detección. Desde Cu (I), que se oxida fácilmente a la especie no catalíticos Cu (II), que se requiere para catalizar la reacción, se recomienda reducir el sulfato de Cu (II) in situ para obtener Cu (I). Es decir, Cu sulfato (II) se utiliza en presencia de un reductor tal como ácido ascórbico (en adelante el &quot;buffer aditivo&quot;) para generar de cobre (I). <ol><li> Antes del experimento, preparar la solución de trabajo de la azida Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 azida, Alexa Fluor 555 azida u otros, dependiendo del fluoróforo preferida, que se denomina como &quot;tinte azida&quot; en lo sucesivo), tampón de reacción EdU y tampón EdU aditivo de acuerdo con el fabricante delinstrucciones. <ol><li> Reconstituir la azida colorante en DMSO 70 l. Almacenar la solución de trabajo a -20 ° C hasta por 1 año. </li><li> Preparar tampón reciente reacción EdU diluyendo el tampón de reacción 10x EdU con agua desionizada. Nota: Después de usar, almacenar cualquier solución 1x restante a 4 ° C. La solución 1x es estable durante un máximo de 6 meses. </li><li> Hacer una solución 10x del aditivo tampón EdU disolviendo completamente el polvo en 2 ml de agua desionizada. Nota: Esta solución madre es estable durante hasta 1 año a -20 ° C. Si la solución desarrolla un color marrón, que se ha degradado y debe ser desechado. </li></ol></li><li> Preparar el cóctel de reacción EdU nuevo cada vez, y utilizar dentro de los 15 minutos de preparación. Para obtener resultados reproducibles, asegúrese de que los componentes de la reacción se mantienen en las mismas proporciones. <ol><li> Hacer fresca 1x tampón EdU solución aditiva diluyendo la solución de 10x (preparado en el paso 4.1.3) 1:10 en agua desionizada. Utilice este sOlution en el mismo día. </li><li> Preparar 1 ml de cóctel EdU reacción mediante la combinación de los siguientes ingredientes en este orden: 860 l 1x EdU tampón de reacción, 40 l CuSO 4, 2,5 l de azida de tinte, 100 l 1x EdU aditivo tampón. Nota: Es importante que los ingredientes se añaden con el fin de garantizar un rendimiento óptimo. </li></ol></li><li> Retire el PBS con BSA al 3% y añadir 0,5 ml de cóctel de la reacción EdU a cada tubo. Incubar a TA durante 30 min con rotación suave. Mantener las muestras protegidas de la luz. </li><li> Retire el cóctel de reacción EdU y lavar una vez con 1 ml de BSA al 3% en PBS. </li><li> Lavar las muestras una vez con 1 ml de PBS. </li></ol> 5. El anticuerpo etiquetado Nota: Realice el etiquetado de anticuerpos después de la tinción edu. Si no se desea la tinción adicional, se puede proceder a la de montaje y de formación de imágenes directamente. Es importante que las muestras se protegieron de la luz en todos los siguientes procedimientos. <ol><li> Eliminar la solución de lavado. Bloquear los ovarios en 1 ml de solución de bloqueo que contiene 0,2% de BSA y 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 30 min. </li><li> Retire la solución de bloqueo y reemplazar con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo (por ejemplo, ATP sintasa ratón subunidad α anticuerpo, dilución 1: 1.000). Incubar en la oscuridad a 4 ° CO / N. </li><li> Lavar las muestras con 1 ml de solución de bloqueo 3 veces, 10 min cada vez. Para minimizar el fondo, se lava dos veces más durante 30 minutos cada uno. Retire la solución de bloqueo. </li><li> Incubar con anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo (por ejemplo, cabra anti-ratón de Alexa Fluor 568 anticuerpo secundario, dilución 1: 200) durante 2 horas a RT. Nota: Utilice un color diferente que el que junto a edu. </li><li> Repita los pasos de lavado realizados en el paso 5.3. </li><li> Enjuague con 1 ml de PBS una vez para eliminar el detergente. </li></ol> 6. Montaje e Imagen <ol><li> Retirar con cuidado todo el PBS y immediately cubrir ovarios con 50 l de medio de montaje (con o sin DAPI). Nota: Utilice un medio de montaje que no se endurece mientras que los ovarioles están siendo separados unos de otros. Los ovarios se pueden almacenar en el medio de montaje a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li><li> Corte el extremo de una punta de pipeta y utilizarla para transferir los ovarios con cuidado sobre un portaobjetos de microscopio. </li><li> Completamente separado cada ovariola con unas pinzas finas, nariz afilada bajo el microscopio estereoscópico. Extraer los tejidos de conexión en el extremo posterior y la etapa 14 o cámaras de huevos maduros. Las cámaras de huevos pequeños están en el extremo anterior y transparente. </li><li> Alinear las cámaras de huevo con fórceps de manera que no se superpongan entre sí. </li><li> Lentamente baje un cubreobjetos de vidrio # 1.5 en la parte superior de las muestras. Permitir que el medio de montaje para polimerizar durante varias horas a TA. Sellar con esmalte de uñas transparente. </li><li> Foto se desliza al día siguiente, o se almacena a 4 ° C antes de la imagen. </li><li> Visualizar bajo un mi confocalcroscope con un objetivo de inmersión en aceite 63X. Capturar imágenes tridimensionales Z-pilas. Nota: Hay una fuerte señal EdU en una etapa más avanzada cámaras de huevos y la fluorescencia de fondo en la vaina epitelial. Al examinar el etiquetado EdU en un germarium en particular, se debe evitar germariums que se solapan ni está cerca de otros tejidos o cámaras de huevos de etapa posterior. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

etiquetado EdU es un novedoso y eficiente método para detectar la síntesis de ADN en células proliferantes, que se basa en la incorporación y la tinción de análogos de nucleósidos en el ADN recién sintetizado. Este método es superior al método de etiquetado BrdU en que es más rápido y altamente sensible. Más importante aún, permite una buena conservación estructural y la penetración EdU-dye eficiente de todo el montaje tejidos 9, 10. Históricamente, como una alternativa superior a BrdU etiquetado, etiquetado EdU se utilizó para estudiar la replicación del ADN nuclear durante la fase S de la ciclo celular. Afidicolina es un inhibidor de la ADN polimerasa α, que es la principal de la polimerasa para la replicación del ADN nuclear en la fase S 12 15. la replicación del ADNmt se lleva a cabo por γ ADN polimerasa, que es insensible a afidicolina tratamiento. Por lo tanto, el tratamiento con afidicolina antes de y durante la incubación EdU inhibió significativamente EdU incorporación en el ADN nuclear. Deberíase observó que afidicolina puede ser estable durante varias semanas si se almacena adecuadamente, y la eficacia de afidicolina en la inhibición de la replicación del ADN nuclear fue variable en nuestras manos. Los ovariolas o cámaras de huevos con un fuerte marcaje de ADN nuclear deben ser excluidos de los análisis de datos adicionales. la replicación del ADNmt puede ser visualizado fácilmente como puntos lagrimales en el citoplasma, que también ofrece una forma sencilla de cuantificar el nivel de la replicación del ADNmt contando el número de puntos lagrimales EdU, normalizado con el volumen total de citoplasma. software de imágenes se puede aplicar para identificar automáticamente los puntos lagrimales EdU en imágenes microscópicas, lo cual es especialmente útil para el análisis computacional de grandes conjuntos de datos. Sin embargo, se deben tomar precauciones, debido a la inhibición incompleta de la replicación del ADN nuclear puede dar lugar a la incorporación EdU en distintos loci en el cromosoma y aparecer como puntos lagrimales en el interior del núcleo. También en otros casos, la intensidad de EdU incorporación en replicando ADNmt podría ser débil, mientras que el fondo y el ruido podrían ser altos. Por lo tanto, los parámetros individuales para análisis automático de imágenes deben ser cuidadosamente definidos. También se recomienda que las imágenes deben ser examinados con los ojos entrenados para asegurarse de que los puntos lagrimales adecuada EdU se identifican. La visualización de ADNmt recién sintetizado durante la ovogénesis Drosophila ofrece la oportunidad de investigar la forma en la replicación del ADN mitocondrial se regula en condiciones fisiológicas o patológicas, al llevar a cabo el experimento en las moscas de sometidas a una variedad de perturbaciones farmacológicos o genéticos. En un estudio anterior, ensayo de incorporación de EdU se realizó en un ADNmt mutante Drosophila MT: COI T300I 11. Además, para interrumpir el potencial de membrana mitocondrial, los ovarios fueron tratados con varias concentraciones de desacoplador FCCP mitocondrial o 2,4-dinitrofenol (DNP) antes de la incorporación EdU. Dependiendo de los fines experimentalesy las características de la droga, diferentes métodos podrían ser adoptadas para la entrega efectiva. Para las moscas adultas, los medicamentos pueden presentarse en forma de vapor (por ejemplo, etanol y cocaína) 16,17 o medicamentos se pueden inyectar en el abdomen, donde se difunde rápidamente a través del cuerpo 18. La práctica más común es que los fármacos se añaden a la comida mosca o un papel de filtro de sacarosa / saturada con las drogas. Por ejemplo, el inhibidor de ensamblaje de los microtúbulos, la colchicina, se alimentó a las moscas durante 2-3 días antes de la disección de ovario 19. Por lo tanto, es importante para evaluar el método de administración de fármacos y elegir concentraciones apropiadas. Para garantizar el éxito de imagen de la replicación del ADN mitocondrial en Drosophila ovarios, varios pasos críticos deben ser cuidadosamente ejecutados. Ante todo, preservar la viabilidad y la salud de los ovarios durante la disección y la incorporación a Edu esenciales (pasos 1 y 2). Medio Drosophila de Schneider con FBS necesita ser calentado a RTantes de usar. Se debe minimizar el contacto directo entre las cámaras de huevos y herramientas de disección o puntas de pipeta. Los ovarios se deben sumergir en virtud de soluciones todo momento para evitar la deshidratación. El mal manejo de los tejidos puede conducir fácilmente a desmayarse o no hay señales fluorescentes. Durante la etapa de montaje de tejido, ovarioles deben estar separados el uno del otro y se extienden sobre el portaobjetos de microscopio. Asegúrese de que las cámaras de huevos no están apiladas una encima de la otra. Nos dimos cuenta de que las cámaras de huevos más allá de la etapa 14 muestran poca incorporación edu. Además, debido al tamaño grande, las cámaras de huevo etapa tardía a menudo hacen que las cámaras de huevos más pequeños vecinos sean fuera de foco. Por lo tanto se recomienda que se descartarán las cámaras etapa de huevo finales. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el etiquetado de replicación del ADNmt en los ovarios adultos de Drosophila. Este método permite la cuantificación sencilla de la replicación del ADNmt en diversas perturbaciones genéticas y farmacológicas,y será útil para diseccionar los mecanismos que subyacen a la biogénesis mitocondrial de desarrollo y la herencia del ADNmt.

Además del genoma nuclear, cada célula eucariótica también contiene miles de copias de DNA circular pequeño en la matriz mitocondrial. Mientras que el ADN mitocondrial (ADNmt) codifica subunidades esenciales de la cadena de transporte de electrones, la mayoría de la proteoma mitocondrial, incluyendo todos los factores para la replicación y la transcripción del ADNmt están codificadas por el genoma nuclear. En contraste con el genoma nuclear que sigue las leyes mendelianas de la herencia, el genoma del animal mitocondrial se hereda exclusivamente a través del linaje materno. Por lo tanto, la comprensión de cómo el ADNmt se proliferó y se transmite de una generación a la siguiente a través del ovocito femenino es de fundamental importancia. Sin embargo, hay un continuo debate sobre la forma en la replicación del ADN mitocondrial se regula en la línea germinal femenina. Además, la teoría de cuello de botella ADNmt ampliamente aceptada para la transmisión de ADNmt sugiere que la población de ADNmt en las células germinales primordiales se submuestreada a un número relativamente pequeño during 1 2 desarrollo. También implica que la replicación del ADNmt es temporal y espacialmente regulado durante la ovogénesis. Por lo tanto, la detección in situ de la replicación del ADNmt durante el desarrollo de la línea germinal facilitará la comprensión del mecanismo de ADNmt herencia. Drosophila ovogénesis proporciona un sistema manejable de forma genética para estudiar la replicación del ADN mitocondrial y la transmisión. En cada uno de los dos ovarios de Drosophila, hay 16-20 cadenas independientes de cámaras de huevos llamados ovarioles 3, que son las unidades funcionales de la producción de huevos (véase la Figura 1A). Cada ovariole contiene una organización lineal progresiva de la ovogénesis, donde la punta anterior se compone de una estructura llamada germarium. El germarium se divide en cuatro regiones que contienen células germinales en las etapas de desarrollo distintas. En la región 1, las células madre de línea germinal pasan por división asimétrica para producir células hijas conocidas como cystoblasts. Región 2a contiene los cystoblasts que han completado su división final. Cystoblasts someten a cuatro rondas de grupos de 16 células productoras de división. Las células 16 permanecen conectados entre sí por puentes citoplasmáticos llamados canales de anillo. Sólo una de las células se compromete a la diferenciación como el ovocito, mientras que el otro 15 se desarrollan como células de la enfermera poliploides. Una estructura citoplasmática esencial, conocido como fusome, se propone facilitar con la formación de canales en el anillo, determinar la polaridad del quiste y la enfermera las interacciones célula-ovocito 4,5. A medida que los quistes se mueven hacia la región 2b, las estructuras de quistes abarcan toda la anchura de la germarium, y se vuelven más asociados con las células del folículo. Las estructuras germarium terminan con la región 3 que contiene la primera cámara de huevos en ciernes. Posteriormente, las cámaras de huevos se montan en el extremo posterior de la germarium, que se avanza a través de la ovariola en 14 etapas morfológicamente distintos. El crecimiento de los ovocitos depende de las células de la enfermera, whproteínas de transporte ich, ARNm y estructuras endomembrane (por ejemplo, Golgi) a través de los canales de anillo en el ovocito. Durante la ovogénesis Drosophila, se encontró que una fracción de las mitocondrias dentro de cada quiste de 16 células se asociaron con la fusome, mueve a través de los canales de anillo y se dieron en el único oocito en una gran masa llamada cuerpo Balbiani 6. Se propuso Este fenómeno de contribuir al control de calidad de la herencia mitocondrial a través de ovarios femeninos. La detección de la síntesis de ADN mitocondrial se basa en la incorporación de precursores de ADN marcados en el ADN celular. Tradicionalmente, se utiliza un análogo de nucleósido de timidina 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina (BrdU) para etiquetar la replicación del ADNmt en las células de cultivo de tejidos 7,8. Sin embargo, el etiquetado BrdU basada en anticuerpos presenta varias limitaciones, especialmente para la tinción de tejidos todo el montaje. Una desventaja importante de etiquetado BrdU es que requiere la desnaturalización del ADN para exponerel epítopo BrdU, de modo que pueda ser detectada por el anticuerpo anti-BrdU. Este ejemplar ha de ser tratado en condiciones de desnaturalización agresivos, tales como productos químicos (por ejemplo, ácido clorhídrico o mezclas de metanol y ácido acético), el calor, o la digestión con DNasa, lo que podría alterar la estructura de la muestra y complicar el procedimiento de tinción 9, 10. Aquí, un análogo de la timidina alternativa 5-etinil-2 &#39;desoxiuridina (EDU) se utiliza para etiquetar el ADN mitocondrial replicarse en ovarios adultos de Drosophila. Este método es más rápido y altamente sensible. EdU se incorpora fácilmente en el ADN celular durante la replicación del ADN. La siguiente detección se basa en una reacción de &quot;clic&quot;, un Cu (I) catalizada reacción covalente entre el grupo alquino terminal y una azida fluorescente 10. Debido a que la reacción no requiere la desnaturalización de la muestra, que permite una buena conservación estructural. Además, el tamaño de tinte unazide es solamente 1/500 de la de una molécula de anticuerpo 10, que permite la penetración rápida y eficiente de los tejidos de todo el montaje. Hemos utilizado este método para detectar la replicación del ADN mitocondrial durante la ovogénesis Drosophila y se encontró un patrón espacial llamativa en la región germarium de Drosophila ovario 11, lo que nos lleva a proponer un mecanismo de herencia ADNmt selectiva dependiente de la replicación. Presentamos aquí un protocolo detallado sobre el etiquetado EdU de la replicación del ADN mitocondrial en Drosophila ovarios. Para demostrar la aplicación del protocolo, también a prueba la replicación del ADNmt en un ADNmt mutante Drosophila (MT: COI T300I) 11, así como con el tratamiento diverso de desacopladores mitocondriales, que disipan el potencial de membrana mitocondrial y potencialmente interrumpen la replicación del ADNmt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0781</td>
			<td>Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ATP synthase subunit &#945; antibody, (15H4C4)</td>
			<td>MitoSciences</td>
			<td>Ab14748</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Hts antibody (clone RC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>hts RC</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Elf</td>
			<td></td>
			<td>Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ labeling of mitochondrial dna replication in drosophila adult ovaries by edu staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

El protocolo anterior permite la visualización de las estructuras punteadas asociados con las mitocondrias (Figura 1B-C), que indican la replicación del ADN mitocondrial durante la ovogénesis Drosophila. Los puntos lagrimales EdU localizada con mitocondrias marcados por tinción para ATP sintetasa subunidad alfa (Figura 2). Las señales observadas estaban ausentes en los ovarios tratados con bromuro de etidio 11, un inhibidor de la replicación del ADNmt 14, la validación de que estos puntos lagrimales de hecho etiqueta replicar mtDNA.Aphidicolin se utilizó para inhibir la tinción de ADN nuclear sin afectar a la replicación de ADN mitocondrial (Figura 2). Sin tratamiento afidicolina, intensas señales EdU etiquetar los núcleos, y ADNmt puntos lagrimales apenas se detectaron (Figura 3). Sin embargo, en presencia de afidicolina, la incorporación nuclear se redujo drásticamente y se observaron muchos puntos lagrimales asociados con las mitocondrias. (Figura 1B). Sin embargo, sobre todo, la replicación del ADNmt muestra un patrón espacial en el germarium. Como se indica por el número de puntos lagrimales EdU, hay un nivel moderado de la replicación del ADNmt en la región 1 de la germarium, pero casi no incorporación EdU en la región 2A (Figura 1C). A medida que el quiste se mueve hacia abajo a la región 2B en el germarium, la replicación del ADNmt se reanuda y el número de puntos lagrimales EdU en el quiste posterior de la región de 2B era mucho más alta que en la región 2A (Figura 1C). En concreto, la incorporación intensiva EdU se concentró alrededor de los canales de llamada y las estructuras fusome, como manchado por el Li Tai Hu Shao (HTS) de proteínas. ADNmt mantiene replicar a un alto nivel en la región 3 de la germarium (Figura 1C) Para demostrar la asociación de specifgenes o el tratamiento con la proliferación ADNmt ic, ovarios Drosophila podrían ser objeto de manipulación genética o tratamiento farmacológico. Se han tratado los ovarios con diferentes concentraciones de FCCP, un protonóforo mitocondrial clásico, que disipa el potencial de membrana mitocondrial. Como control, DMSO no tuvo ningún efecto sobre la replicación del ADNmt (Figura 4A). Las dosis altas de FCCP (10 M) están casi agotadas por completo la replicación del ADNmt en todo el germarium (Figura 4D). No obstante, la menor concentración de FCCP (2 ó 5 M) tuvo un impacto menor en la replicación del ADNmt en la región 1, pero inhibió la replicación en las regiones 2B y 3 (Figura 4B-C), lo que sugiere regiones 2b y 3 son más sensibles a la alteración mitocondrial, o mantienen relativos cinética de replicación más lentas. Los resultados anteriores indican que la replicación del ADNmt está asociada con la actividad mitocondrial. En particular, diferentes regiones de la germarium respondieron de manera diferente a imp mitocondrialairment. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> Figura 1. replicación del ADNmt durante la ovogénesis Drosophila. (A) Diagrama de un ovariole Drosophila y una vista ampliada de la germarium. El ovariola ilustra de izquierda a derecha, anterior a posterior, algunas etapas del desarrollo de cámaras de huevos. En el germarium, se muestra la fusome (rojo), las células madre de línea germinal (azul), las mitocondrias (verdes), los ovocitos futuro (línea punteada, reconocido por el posicionamiento, la estructura fusome y grupos mitocondriales), el desarrollo de quistes (melocotón) y cuatro regiones de desarrollo . (B) Representante de proyección z-pila de un ovariola de tipo natural marcado por Edu y el anticuerpo contra la HTS-RC, un marcador de canales de llamada y fusome. En presencia de afidicolina, la EdU se incorporó en el ADNmt (puntas de flecha) y los núcleos (flechas). Barra de escala, 10 micras.(C) Vista ampliada del germaria esbozados en la región en caja en B. Las cuatro regiones de desarrollo se indican. Barra de escala, 5 micras 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> Figura 2. replicación del ADNmt en el germarium Drosophila se visualizó mediante la incorporación EdU con el tratamiento afidicolina (A) -. (D) sección confocal Representante de un germarium tipo salvaje que muestra EdU incorporación (verde, b), las mitocondrias, marcada por la ATP sintasa alfa tinción subunidad (rojo, C), y los núcleos, marcado con tinción DAPI (azul, D) con pre-incubación con afidicolina DNA inhibidor de la polimerasa-α. (A &amp;# 39; -D &#39;) Una imagen ampliada del área de caja en (A) que muestra EdU incorporación (B&#39;), las mitocondrias (C &#39;) y núcleos (D&#39;). En presencia de afidicolina, la incorporación nuclear (flechas) se reduce y muchos puntos lagrimales se localiza dentro de las mitocondrias (puntas de flecha). Las barras de escala, 10 m. La figura ha sido modificado a partir de 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> Figura 3. replicación del ADNmt apenas se detectó en el germarium Drosophila sin tratamiento afidicolina (A) -. (D) sección confocal Representante de un germarium tipo salvaje que muestra EdU incorporación (verde), las mitocondrias, marcada porLa ATP sintasa tinción subunidad alfa (rojo), y los núcleos, marcado con tinción DAPI (azul) en ausencia de la afidicolina DNA inhibidor de la polimerasa-α. &quot;Una imagen ampliada del área de caja en (A) que muestra EdU incorporación (B (A&#39;-D) &#39;), las mitocondrias (C&#39;) y núcleos (D &#39;). Sin afidicolina, intensas señales EdU etiqueta núcleos (flechas), y puntos lagrimales ADNmt apenas se detectan. Las barras de escala, 10 m. La figura ha sido modificado a partir de 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> Figura 4. mitocondrial desacoplador deteriora la replicación del ADNmt. Proyectos pila Z representativo que muestra de tipo salvaje germarium tratados con DMSO(A) o el desacoplador FCCP mitocondrial a concentraciones de 2 mM (B), 5 mM (C), 10 mM (d) durante EdU incorporación. Tenga en cuenta el deterioro de etiquetado EdU en la región 2B tratado con 2 M FCCP (B), y tanto en la región 2B y 3 tratados con 5 M FCCP (esbozado en cajas). Se muestran cuatro regiones de desarrollo. Flechas, el ADN nuclear; puntas de flecha, el ADNmt. Barra de escala, 10 micras. La figura ha sido modificado a partir de 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ marcaje de ADN mitocondrial de replicación en Drosophila ovarios adultos por Edu tinción

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

in-situ-labeling-mitochondrial-dna-replication-drosophila-adult

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

9.0K vistas.  National Institutes of Health. Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Investigación

Genética

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando<em&gt; In Vitro</em&gt; Por el bacteriófago T7 proteínas de replicación

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...