Ringraziamo M. Channey, E. Chau, e K. Tomas per la loro assistenza nel progetto. forniture di progetto sono stati in parte finanziati dalla California Polytechnic State University.

1. Media e coltura di ceppi microbici NOTA: Utilizzare tecniche asettiche in tutti gli esperimenti. Utilizzare materiali sterili. Sterilizzare tutti i contenitori, strumenti e reagenti prima dell&#39;uso. Autoclavare tutti i materiali di scarto prima dello smaltimento perché sono considerati a rischio biologico. la temperatura e il tempo Autoclave combinazione è ≥121 ° C x ≥15 min per tutte le seguenti procedure. <ol><li> Per rendere ~ 1-L Tryptic Soy Agar (TSA), prima aggiungere 1 L di acqua deionizzata in una beuta 2-L contenente una ancoretta magnetica. Utilizzare un pallone che è almeno due volte più grande del volume finale. Aggiungere 30 g di polvere di triptico brodo di soia e 20 g di agar granuli nel matraccio. NOTA: Utilizzare 2% agar invece del 1,5% per limitare brulicare di qualche Vibrio spp. <ol><li> Mescolare accuratamente accendendo l&#39;agitatore. Mentre si agita, accendere il fuoco a bollire la miscela. Rimuovere la beuta dal riscaldatore non appena il composto inizia a bollire. Liberamente coprire °e pallone con una carta stagnola. Nastro il foglio per fissarlo al pallone prima autoclave. </li><li> Per fare il brodo di soia trittico (TSB), omettere l&#39;agar dalla ricetta al punto 1.1. NOTA: Può usare bottiglie invece di beuta. </li><li> Per rendere triptico agar di soia integrato con cloruro di sodio 2% o NaCl (TSAS), aggiungere 20 g di NaCl nella miscela prima agitazione e riscaldamento. Per fare il brodo di soia trittico addizionato con 2% NaCl (TSBS), omettere l&#39;agar, aggiungere 20 g di NaCl nella miscela prima agitazione e riscaldamento. </li></ol></li><li> Per rendere infuso cuore cervello (BHI) agar, sospendere 37 g di polvere di BHI e 15 g granulato di agar in 1 L di acqua purificata. Il calore sotto agitazione per sciogliere la polvere. Autoclave. Omettere l&#39;agar per fare BHI brodo. </li><li> Per rendere TCBS agar, sospendere 89 g della polvere TCBS in 1 L di acqua purificata. Di calore con agitazione e far bollire per 1 minuto per sciogliere completamente la polvere. Non sterilizzare in autoclave. </li><li> Per tutti i supporti di agar, raffreddare l&#39;agar caldo per 45-50 ° C in un bagno d&#39;acqua. Disporre le piastre di Petri vuote in pile di cinque o sei piatti. Partendo dal fondo della pila, versare l&#39;agar fuso in ciascuna piastra di Petri per raggiungere circa metà pieno. Chiudere il coperchio piatto Petri dopo avere versato. Lasciare che l&#39;agar solidificare lasciando le piastre siedono a temperatura ambiente. <ol><li> Utilizzare le piastre di agar il giorno dopo o dopo 12 ore. Conservare le piastre inutilizzati in frigorifero per un massimo di due settimane. Prima dell&#39;uso, rimuovere le piastre dal frigorifero e equilibrare a temperatura ambiente per almeno 15 min. NOTA: agar Un litri rende ~ 45 piastre di agar. Lasciare le piastre di agar per asciugare sufficientemente il giorno di preparazione, e portare a temperatura ambiente dopo conservazione frigorifera per ridurre efficacemente la diffusione delle colonie. </li></ol></li><li> Ottenere piastre cioccolato e cromogenico agar e equilibrare a temperatura ambiente prima di ogni esperimento. </li><li> Sottocultura tutti i 54 ceppi microbici indicati nella tabella 1 ogni pochi days. <ol><li> Utilizzare un ciclo inoculo sterile per trasferire le culture da uno stock congelati o un lotto precedente di terreni non selettivi, come BHI, TSB / TSA o agar cioccolato. Grow halophilic Vibrio spp. su TSBS / TSAS. </li><li> Per controllare la purezza della cultura, consecutive tutti i ceppi in un modello che consenta di osservazione di colonie isolate. Ad esempio, utilizzare un modello striature trifase per diluire una grande quantità di batteri per piccole quantità, per ottenere alla fine colonie isolate. </li></ol></li><li> Incubare le piastre a testa in giù a 35-37 ° C per un massimo di 48 ore. Per campylobacter spp., Incubare i tubi o piastre in un vaso chiuso coperchio contenente una sacca di gas per produrre un ambiente microaerofili. Osservare morfologia delle colonie dopo l&#39;incubazione. colture pure dovrebbero produrre colonie che presentano simili morfologia delle colonie. NOTA: Incubare tutte le piastre capovolta per evitare goccioline d&#39;acqua condensate formate sul lato inferiore del coperchio di cadere sul colleOnies. </li></ol> 2. Specie Determinazione mediante PCR <ol><li> Condurre tlh -PCR per confermare l&#39;identità di V. ceppi parahaemolyticus. Utilizzare primer tlh -F (5 &#39;AAA GCG GAT TAT GCA GCA GAA CTG 3&#39;) e tlh -R (5 &#39;GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3&#39;) per amplificare un frammento di 450 bp del gene termolabile hemolysin 20 . <ol><li> Utilizzare un ciclo inoculo sterile per trasferire alcune colonie isolate di ciascun V. parahaemolyticus ceppo da TSAS a 5 ml di TSBS. Incubare a 35-37 ° C per 16-24 ore. </li><li> culture centrifugare a 14000 g per 1 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte con tampone fosfato (PBS). Far bollire la sospensione per 3 minuti a cedere lisato cellulare. NOTA: V. parahaemolyticus è facile essere lisate. Pertanto reagente di lisi non è necessaria. È anche possibile usare un po &#39;di colonia direttamente come modello. </li><li> Eseguire la PCR in una reazione di 25 microlitri volume. Preparare una miscela di reazione contenente una concentrazione finale di 1x tampone PCR, 1,5 mM MgCl 2, 100 mM di ciascun dNTP, 1 mM di ciascun primer, 1 U Taq polimerasi e 1 ml di lisato cellulare. Dopo preincubazione a 94 ° C per 5 min, eseguire 35 cicli di amplificazione di 94 ° C per 30 sec, 58 ° C per 30 sec e 72 ° C per 60 sec 21. </li><li> aliquote di carico di amplicone 5 ml a 1,5% gel di agarosio. Attivare alimentazione per iniziare l&#39;elettroforesi. Visualizzare la presenza o l&#39;assenza di ampliconi sotto illuminazione UV dopo colorazione con etidio bromuro. </li></ol></li></ol> 3. La crescita su selettivo e differenziale media <ol><li> Da due a quattro giorni prima dell&#39;esperimento, striscia tutti i ceppi microbici indicati nella tabella 1 su terreno non selettivo (TSAS, BHI o agar cioccolato) per l&#39;isolamento delle colonie. Incubare le piastre a 35-37 ° C per 48 ore. Controllare la purezza delle culture osservando la morfologia delle colonie dopo incubazione. colture pure dovrebbero produrre colonie che presentano simili morfologia delle colonie. </li><li> Trasferire alcune colonie isolate dal punto 3.1 in 5 ml di brodo. Incubare le provette a 35-37 ° C per 16-24 ore. Nota: utilizzare giovani colonie, che sono meno di quattro giorni, per preparare le culture durante la notte in tutti gli esperimenti. </li><li> Streak un&#39;ansata di culture durante la notte su terreni selettivi e differenziali (TCBS e cromogenico agar) per l&#39;isolamento delle colonie. Incubare le piastre a 35-37 ° C per un massimo di 96 ore. </li><li> Registrare la crescita complessiva di tutti i ceppi esaminando sia la densità coltura su piastra e la dimensione delle colonie isolate. Registrare il colore delle colonie sotto luce ambientale e / o UV. Nota altre caratteristiche della colonia isolata, come l&#39;elevazione, il margine e la forma. </li></ol> Assay 4. Recupero <ol><li> Selezionare un sottoinsieme rappresentativo di V. ceppi parahaemolyticus (n = 14) che comprendono diversi sierotipi e le origini di isolamento <sup&gt; 22. Seminare giovani culture dalle piastre in 5 ml di TSBS. Incubare le provette a 35-37 ° C per 16-24 ore. </li><li> Effettuare un metodo Plate Count standard delle culture overnight come descritto di seguito. <ol><li> Vortex per mescolare bene le culture durante la notte. Fare un 10 volte o 10 -1 diluizione con il trasferimento di 100 microlitri della cultura durante la notte in una provetta contenente 900 ml di PBS. Vortex per mescolare bene. </li><li> Utilizzare un nuovo puntale per trasferire 100 ul dal tubo 10 -1 diluizione ad un altro tubo contenente 900 ml di PBS. Vortex per mescolare bene. Ciò costituisce 10 -2 diluizione. Ripetere il processo sequenziale di ottenere 10 -7 diluizione. </li><li> Utilizzando i tubi di diluizione 10 -4 a 10 -7, piatto 100 ml ciascuno sulle cromogenici, TCBS e CST piastre di agar. NOTA: Il fattore di diluizione (df) sulla piastra diventa 10 -5 a 10 -8, rispettivamente. </li><li> Stendere le aliquote in modo uniforme su tegli AGAR superficie. NOTA: È bene utilizzare lo stesso spreader per ceppo sullo stesso supporto, purché il un&#39;aliquota più diluito viene diffuso prima (cioè, da 10 -8 a 10 -5). Non usare la stessa spreader per diversi media. </li><li> Incubare le piastre a 35-37 ° C per un massimo di 96 ore. Contare colonie sulle piastre. Ignorare lastre portanti colonie che sono troppo numerosi per contare (TNTC) o minore di 25. Calcolare CFU / ml secondo il seguente: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Dove N = numero di cellule nel tubo non diluito, espressa come CFU / ml o CFU / g C = il numero totale di colonie contate su piastre che portano 25-300 colonie n 1 = il numero di targa (s) dove colonie contate sono da df minore n 2 = il numero di targa (s) dove colonie contate sono dalla successiva diluizione di 10 volte dF = fattore di diluizione più basso (vale a dire, la diluizione più concentrata) </li></ol></li><li> Confronto CFU / ml tra i diversi mezzi di comunicazione. Utilizzare CFU / ml su TSAS al 100%, calcolare il recupero% di V. parahaemolyticus cresciuto sul agar cromogenico e TCBS. </li></ol> Assay 5. Concorrenza <ol><li> Scegliere un sottoinsieme di ceppi che mostrano diverse morfologie di colonia sul agar cromogenico e TCBS. NOTA: In questo modo, sarà possibile contare le colonie originati da V. parahaemolyticus solo, nonostante la presenza di altre specie nella inoculo. <ol><li> Scegliere un V. ceppo parahaemolyticus che produce i turchesi e ciano colonie attesi sulle TCBS e l&#39;agar cromogenico, rispettivamente. </li><li> Scegli un non V. parahaemolyticus e una specie non Vibrio che non crescono su uno di questi mezzi, o presentano diversi colori colonia. NOTA: per esempio, V. metschnikovii cresce molto debolmente on TCBS e non crescono sulla agar cromogenico. Shigella sonnei non crescono sugli TCBS ma produce colonie magenta sul agar cromogenico. </li></ol></li><li> Dopo la selezione dei ceppi di cui sopra, preparare brodi di coltura durante la notte utilizzando colonie isolate cresciute su terreni non selettivi. <ol><li> Fare culture durante la notte di V. parahaemolyticus e V. metschnikovii trasferendo alcune colonie isolate da TSAS a 5 ml di TSBS. Incubare a 35-37 ° C per 16-24 ore. </li><li> Fare culture durante la notte di Shigella sonnei con il trasferimento di alcune colonie isolate da BHI agar a 5 ml di brodo BHI. Incubare a 35-37 ° C per 16-24 ore. </li></ol></li><li> Per ogni ceppo, eseguire una serie di diluizioni simile ai punti 4.2.1 e 4.2.2. Piastra diluizioni appropriate sul TSAS o BHI per determinare CFU / ml della cultura durante la notte, utilizzando l&#39;equazione mostrato al passaggio 4.2.5. NOTA: in genere, 100 ml di diluizione 10 -5 a 10 -7tubi funziona per la maggior parte delle culture. Utilizzare i valori CFU / ml per eseguire il calcolo l&#39;esatta quantità di cellule utilizzate nella fase successiva. I valori CFU / ml calcolati si ottengono dopo incubazione, anche se le seguenti operazioni vengono eseguite nella stessa data come punto 5.3. </li><li> Utilizzando le culture durante la notte e tubi di diluizione in passi 5.2 e 5.3, mescolare diverse quantità di un V. ceppo parahaemolyticus e un non V. Specie parahaemolyticus. Ad esempio, miscelare 500 ml di tubo 10 -5 diluizione V. parahaemolyticus con 500 ml di culture durante la notte di V. metschnikovii. NOTA: Questa miscela simula fondo elevato microflora. Per simulare uno sfondo partire microflora, mescolare 500 ml ciascuna del tubo 10 -5 diluizione da entrambe le specie. </li><li> Distribuire 100 ml di miscela ciascuno sulla cromogenici, TCBS e CST piastre di agar. </li><li> Dopo incubazione a 35-37 ° C per un massimo di 96 ore, contare le colonie di V. parahaemolyticus e la non V. Specie parahaemolyticus in base alla loro differenza di crescita e morfologia delle colonie su agar cromogenico e TCBS. NOTA: Ad esempio, se la non V. specie parahaemolyticus non cresce sulla agar cromogenico e TCBS, tutte le colonie saranno di V. parahaemolyticus. Se la mancata V. Specie parahaemolyticus cresce su entrambi i supporti, solo le colonie turchese su colonie TCBS e ciano su agar cromogenico saranno di V. parahaemolyticus. La mancata V. Specie parahaemolyticus può o non può esibire simili morfologia delle colonie a V. parahaemolyticus su TSAS. <ol><li> Se la mancata V. Specie parahaemolyticus cresce in modo simile a V. parahaemolyticus su questo terreno non selettivo, dividere il conteggio delle colonie per due per ottenere i numeri per V. parahaemolyticus solo. Confrontare il conteggio effettivo colonie con il conteggio atteso derivata dal punto 5.3. </li></ol></li></ol> 6. Effetti di Oyster omogenati <ol><li> Pesare ≥50 g di carne di ostriche da ≥12 molluschi tra cui carne e liquori. <ol><li> Aggiungere la stessa quantità di PBS alla carne di ostriche e liquori. Miscela la miscela ad alta velocità per 90 sec. Ciò costituisce 2 -1 diluito omogeneizzato di ostriche. </li><li> Aggiungere 100 g di 2 -1 diluito omogenato ostriche a 400 g di PBS. Utilizzare una scala per misurare il peso, non in volume. Frullare il composto ad alta velocità per 1 min. Autoclave l&#39;omogeneizzato di ostriche. NOTA: Questo sarà l&#39;omogeneizzato ostrica utilizzato per la chiodare. </li></ol></li><li> Ripetere l&#39;analisi di recupero (fase 4), in presenza di ostriche omogeneizzato. <ol><li> Dopo il 500 g di ostriche omogenato si raffredda, aggiungere 100 ml di V. parahaemolyticus culture durante la notte coltivate in TSBS ad esso. Determinare la quantità effettiva di V. cellule parahaemolyticus nel inoculo di gestione delle procedure di conteggio su piastra standard descritti al punto 4.2. </li></ol></li><li> rappresentantemangiare il saggio di concorrenza (punto 5) in presenza di ostriche omogeneizzato. <ol><li> Dopo il 500 g di ostriche omogenato si raffredda, aggiungere 100 ml ciascuna delle culture durante la notte di V. parahaemolyticus e non V. parahaemolyticus ad esso. Determinare la quantità effettiva di batteri cellule nel inoculo di gestione delle procedure di conteggio su piastra standard descritto al punto 4.2 </li></ol></li><li> Mescolare le cellule batteriche con ostriche omogenato bene usando un omogeneizzatore. NOTA: Dopo la miscelazione, l&#39;omogeneizzato ostriche contenente le cellule aggiunti intenzionalmente è chiamato a spillo ostriche omogeneizzato. </li><li> Fare diluizioni del omogeneizzato ostrica a spillo per ottenere 10 -1 a 10 -3 tubi di diluizione secondo le modalità descritte al punto 4.2.2. Distribuire 100 ml di ogni diluizione sul cromogenico, TCBS e TSAS agar. Incubare le piastre a 35-37 ° C per un massimo di 96 ore. </li><li> Confrontare la conta delle colonie su agar reale cromogenico e TCBS con l&#39;expected conteggio delle colonie dedotta da Piazza 6.2.1 e 6.3.1. NOTA: Ad esempio, se un tubo di V. parahaemolyticus coltura overnight contiene 10 8 UFC / ml, un inoculo di 100 microlitri significa che 10 7 cellule vengono aggiunti 500 g di ostriche omogenato, ottenendo 5 x 10 4 cellule / g. Dopo la diluizione e la placcatura, la piastra avendo df = 10 -2 dovrebbe produrre 500 colonie; mentre che avere df = 10 -3 dovrebbe cedere 50 colonie. Queste sono le conta delle colonie attesi. </li></ol>

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	<li>Yeung, P. S., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+pathogenesis,+and+prevention+of+foodborne+Vibrio+parahaemolyticus+infections.">Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections.</a> Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).</li><li>Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology,+molecular+biology,+and+detection+of+foodborne+Vibrio+parahaemolyticus+infections.">Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections.</a> Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).</li><li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+Signs:+Incidence+and+Trends+of+Infection+with+Pathogens+Transmitted+Commonly+Through+Food+-+Foodborne+Diseases+Active+Surveillance+Network,+10+U.S.+Sites,+1996-2010.">Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).</li><li>. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: <a target="_blank" href="https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591">https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591</a> (2008)</li><li>Scallan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foodborne+illness+acquired+in+the+United+States+-+major+pathogens.">Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens.</a> Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).</li><li>Baross, J., Liston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Vibrio+parahaemolyticus+and+related+hemolytic+vibrios+in+marine+environments+of+Washington+State.">Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State.</a> Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).</li><li>Baross, J., Liston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+from+the+Northwest+Pacific.">Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific.</a> Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).</li><li>Kueh, C. S., Chan, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+bivalve+shellfish+with+special+reference+to+the+oyster.">Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster.</a> J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).</li><li>Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).</li><li>Qadri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+inflammatory+immune+responses+in+patients+infected+with+strains+of+Vibrio+parahaemolyticus.">Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).</li><li>MacFaddin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).</li><li>Bottone, E. J., Robin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus:+suspicion+of+presence+based+on+aberrant+biochemical+and+morphological+features.">Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features.</a> J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).</li><li>Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiosulfate-citrate-bile+salts-sucrose+agar+and+its+selectivity+for+clinical+and+marine+vibrio+organisms.">Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms.</a> Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).</li><li>Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+detection+of+Vibrio+parahaemolyticus+in+seafood.">Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).</li><li>Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+chromogenic+medium,+chromID+Vibrio,+for+the+isolation+and+presumptive+identification+of+Vibrio+choleare+and+Vibrio+parahaemolyticus+from+human+clinical+specimens.">Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).</li><li>Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Compact+Dry+VP+method+for+screening+raw+seafood+for+total+Vibrio+parahaemolyticus.">Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).</li><li>Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+and+specificity+of+a+chromogenic+medium+for+detecting+Vibrio+parahaemolyticus.">Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).</li><li>Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+total+and+hemolysin-producing+Vibrio+parahaemolyticus+in+shellfish+using+multiplex+PCR+amplification+of+tl,+tdh+and+trh.">Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh.</a> J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).</li><li>Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+assay+for+specific+detection+of+the+pandemic+Vibrio+parahaemolyticus+O3:K6+clone+from+shellfish.">A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish.</a> J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).</li><li>Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+phenotypic,+molecular,+and+virulence+characterization+of+Vibrio+parahaemolyticus+O3:K6+isolates.">Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).</li><li>Duan, J., Su, Y. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+chromogenic+medium+with+thiosulfate-citrate-bile+salts-sucrose+agar+for+detecting+Vibrio+parahaemolyticus.">Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).</li><li>Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+thiosulphate-citrate-bile+salt+sucrose+(TCBS)+agar+and+CHROMagar+Vibrio+for+isolating+Vibrio+parahaemolyticus.">Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus.</a> Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).</li><li>Canizalez-Roman, A., Flores-Villase&#241;or, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Le&#242;n-Sicairos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+a+chromogenic+agar+medium-PCR+protocol+with+a+conventional+method+for+isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+strains+from+environmental+and+clinical+samples.">Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples.</a> Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).</li><li>Kriem, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Vibrio+spp.+in+raw+shrimps+(Parapenaeus+longirostris)+and+performance+of+a+chromogenic+medium+for+the+isolation+of+Vibrio+strains.">Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains.</a> Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).</li><li>Food Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+guidance+on+reporting+results+from+studies+evaluating+diagnostic+tests.">Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests.</a> http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).</li><li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+laboratory-developed+molecular+assays+for+infectious+diseases.">Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases.</a> Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).</li></ol>

Some media were generously provided by Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen conducted this study while a student at California Polytechnic State University. He is currently an employee of Hardy Diagnostics.

Questo studio si concentra sullo sviluppo terreni di coltura e di valutazione. Convenzionalmente, TCBS è selettivo e differenziale mezzo utilizzato per l&#39;isolamento e la rilevazione V. parahaemolyticus, V. cholerae e V. vulnificus 12. Tuttavia, le limitazioni sono stati riportati per questo mezzo, come l&#39;incapacità di differenziare V. cholerae da altre specie Vibrio. Il saccarosio e indicatore di pH sono gli agenti di differenziazione di TCBS. Così, la produzione di acido da fermentatore saccarosio provoca il cambiamento di colore del mezzo. La colorazione del mezzo è un inconveniente di TCBS perché può oscurare osservazione della morfologia delle colonie. Il mezzo cromogenico di nuova concezione utilizza elevato pH e salinità di sopprimere la crescita di specie non Vibrio si trovano in molti campioni marini. Il nuovo terreno cromogenico ha un pH finale di 8,6 ± 0,2. Per litro di acqua deionizzata, si compone di 10 g di peptone, 10 g di miscela di sali marini, 10 g di bile di bue, 10 g di sodiotiosolfato, 5 g di estratto di lievito, 5 g di citrato di sodio, 2,2 g di carbonato di sodio, 2 g di lattosio, 0,5 g di piruvato di sodio, 0,3 g di una miscela cromogeno e 15 g di agar. Il mix cromogenico permette la differenziazione tra Vibrio spp. secondo le loro capacità differenziali per la produzione di alcuni enzimi. Invece di alterare il colore del terreno agar TCBS, diversa Vibrio spp. mostrerebbero diverso colore colonia sul nuovo mezzo cromogenico. In confronto, un terreno cromogeno disponibile in commercio contiene 15 g di agar, 8 g di peptone ed estratto di lievito, 51,4 g di sali, 0,3 g di una miscela cromogenico e un pH finale di 9,0 ± 0,2. La robustezza di una valutazione dosaggio dipende dalle dimensioni del campione. Da questo studio sottolinea sull&#39;efficacia del nuovo terreno cromogeno per isolare e rilevare V. parahaemolyticus, è importante accumulare molti diversi V. ceppi parahaemolyticus. Precedenti studi che confrontano TCBS enuovi mezzi di coltura spesso coinvolto campioni ambientali o alimentari contenenti tipi e quantità di microrganismi 23,24,25,26 sconosciuti. colonie multiple per esempio ancora stati isolati la natura clonale degli isolati era spesso indeterminato. Idealmente, diversi ceppi devono essere testati in sviluppo di saggi altrimenti l&#39;accuratezza del dosaggio sarebbe gonfiato. Identità Strain può essere stabilita con metodi convenzionali come sottotipizzazione campo pulsato elettroforesi su gel (PFGE) o multi-locus sequenziamento. V. ceppi parahaemolyticus in questo studio sono stati in precedenza caratterizzati da ribotipizzazione e PFGE 19. Durante lo sviluppo di analisi, sensibilità, specificità e limite di rilevazione sono tra i fattori chiave da indagare. Sensibilità, noto anche come l&#39;accuratezza o la sensibilità diagnostica, è l&#39;accordo positivo per cento tra i metodi di riferimento e di test. Specificità, noto anche come precisione o specificità diagnostica, è la percentuale negativo un<html> greement tra i metodi di riferimento e di test. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo basato sulla PCR come metodo di riferimento perché i risultati sono stati verificati tra i diversi gruppi. TCBS ei terreni cromogeni sono stati i metodi di prova. Per determinare la sensibilità, deriva dalla V. ceppi parahaemolyticus sono stati utilizzati, per esempio, Sensibilità = 100% x vero positivo / (veri positivi + Falso Negativo). D&#39;altro canto, i risultati non V. ceppi parahaemolyticus sono stati usati per determinare la specificità; e, di conseguenza, specificità = 100% x Vero Negativo / (Vero negativo + falso positivo). Per fornire risultati specificità più affidabili, non V. ceppi parahaemolyticus devono essere isolati da un ambiente in cui sarà condotta campionamento. I nostri calcoli di sensibilità e specificità sono basate su documenti scritti dal governo il 27, 28 e mondo accademico organizzazione scientifica 29 su un argomento correlato allo sviluppo del test e validazione. nt &quot;&gt; Sulla base dei nostri risultati, il medium cromogenico ha mostrato prestazioni migliori rispetto TCBS nell&#39;identificazione di V. parahaemolyticus. L&#39;accordo globale per cento tra il metodo di riferimento e medie cromogenico è 94,4%, rispetto al 77,8% tra il metodo di riferimento e TCBS. la sensibilità e la specificità del terreno cromogeno sono 90,9% e 96,9%, rispettivamente, che sono maggiori di quelle TCBS (86,4% e 71,9%, rispettivamente). studi precedenti valutare altri terreni cromogeni per la rilevazione di V. parahaemolyticus trovato che sensibilità variava 85-88%, mentre le specificità variava 94-95% 23,24,25. Tuttavia, questi studi non hanno utilizzano lo stesso metodo di calcolo come il nostro studio. Inoltre, a volte usato un metodo di riferimento diverso o hanno combinato i risultati di entrambe biochimica analizza e terreno cromogenico come un metodo di prova. come risultato, è difficile confrontare direttamente i nostri risultati con questi studi precedenti. V. parahaemolyticus, l&#39;agar cromogeno utilizzato in questo studio potrebbe altresì differenziare più specie Vibrio che TCBS causa dell&#39;inclusione di un mix cromogenico nella formula medio, ottenendo colori multipli. Anche se non era il focus di questo studio per rilevare V. cholerae e V. vulnificus, vale la pena di notare che le colonie magenta esposti da tali specie possono essere ulteriormente differenziati mediante fluorescenza ai raggi UV. Una limitazione di utilizzare l&#39;agar cromogenico per la rilevazione di V. cholerae e V. vulnificus è il suo recupero apparente basso per queste specie. Per aggirare questo problema, una fase di arricchimento deve essere incluso. Un&#39;altra possibile limitazione della agar cromogeno è la sua più breve durata rispetto TCBS. ottimizzazione continua di questo nuovo mezzo è necessario per mantenere il pH durante la conservazione. Nonostante la popolarità di tecniche molecolari, Metodi di coltura-base sono ancora prezioso in quanto sono spesso meno costosi e hanno un limite di rilevazione migliore. Questi metodi di coltura possono essere utilizzate come strumento di screening. Al contrario, essi possono essere usati per confermare l&#39;identità e la vitalità dei microrganismi seguenti analisi molecolari. Per enumerare i batteri attraverso un approccio culturale-base, conte piastra standard è riconosciuto come il metodo standard. L&#39;equazione mostrato al passaggio 4.2.5 è un modo più preciso per determinare CFU / g o CFU / ml di una media di CFU da diversi fattori di diluizione. È importante notare che tutti i diluenti e supporti durante le procedure devono contenere sale sufficiente per mantenere la vitalità dei batteri alofili come V. parahaemolyticus. Temperatura di incubazione e l&#39;ambiente devono essere ottimali per la crescita batterica. Il mezzo cromogenico è progettato per rilevare le specie Vibrio che sono importanti agenti patogeni umani. Pertanto, ulteriori studi devono essere condotti per determine la sua efficacia per rilevare altre specie Vibrio ambientali che non sono clinicamente rilevante. Nelle applicazioni future, il nuovo agar cromogeno può essere incorporato nel test di routine di campioni ambientali per V. parahaemolyticus. Questo può essere fatto da striature diretta di campioni in agar cromogenico per rilevare la presenza di V. presuntiva parahaemolyticus. L&#39;agar cromogenico può anche essere utilizzato per enumerare V. parahaemolyticus dopo diluizioni. La quantificazione può anche essere stimata effettuando un metodo del numero più probabile usando brodo di arricchimento, seguita strisciando sul agar cromogenico per la conferma.

In qualità di membro del genere Vibrio, V. parahaemolyticus è una curva, batterio a forma di bastoncello Gram-negativi, non sporigeni. Presenta elevata motilità sia in ambienti liquidi e semisolidi. La maggior parte V. ceppi parahaemolyticus non sono patogeni per l&#39;uomo, ma i sottotipi patogeni hanno causato epidemie e pandemie, quindi questa specie è considerata un importante agente patogeno di origine alimentare in molti paesi 1,2. L&#39;incidenza di infezione da Vibrio negli Stati Uniti ha mostrato una tendenza al rialzo dal 2000 3. Tra Vibrio spp., V. parahaemolyticus è la specie più frequentemente riportati causano malattie negli Stati Uniti 4,5. Altre specie clinicamente rilevanti includono V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, ecc Una piccola percentuale delle malattie è causata da specie multiple simultaneamente. V. parahaemolyticus è un ghiaccinhabitant di acqua marina e quindi ampiamente distribuita nelle acque marine in tutto il mondo, tra cui gli estuari. La specie è stata scoperta nel 1950 a seguito di un focolaio di intossicazione alimentare in Giappone. Negli Stati Uniti, la specie è stato isolato in acqua di mare, sedimenti, e frutti di mare nella regione di Puget Sound 6,7. Filtratori in habitat marini, come molluschi bivalvi, possono porto V. parahaemolyticus come parte della loro flora naturali 8. Come tale, V. infezioni parahaemolyticus in umano sono spesso legati al consumo di frutti di mare contaminati, in particolare frutti di mare crudi o poco cotti. Un percorso meno comune di entrata si verifica quando ferita aperta è esposto ad acqua di mare, che porta a infezioni della pelle. La maggior parte V. ceppi parahaemolyticus non causano malattie umane, ma alcuni sottotipi ospitano fattori di virulenza, come emolisina termostabile diretta (TDH) sono patogeni. I sintomi più frequenti di origine alimentare V. infezione parahaemolyticus sonodiarrea e dolori addominali, seguito da nausea, vomito e febbre. Mal di testa e brividi sono anche riportati. Il periodo di incubazione medio è di 15 ore, ma può essere fino a 96 ore dopo il consumo di una quantità sufficiente di ceppi patogeni 9. La malattia dura da due a tre giorni. I sintomi gastroenterite causata da V. parahaemolyticus sono largamente auto-limitante e quindi il trattamento speciale non è necessaria. I casi lievi di gastroenterite possono essere efficacemente trattati con reidratazione orale. Più gravi malattie possono essere trattati con antibiotici come la tetraciclina o ciprofloxacina 10. tasso di mortalità è circa il 2% per i casi di gastroenterite, ma può essere alto come il 29% per coloro che sviluppano infezione sangue o setticemia. Qualsiasi persona che consuma frutti di mare o ha ferita aperta esposta all&#39;acqua di mare è a rischio di V. infezione parahaemolyticus. La forma più grave di malattie, la setticemia pericolosa per la vita, è più comune in una sottopopolazione con sottostante co medicalli operativi 11, che includono l&#39;alcolismo, malattie del fegato, diabete, malattie renali, tumori maligni, e le altre condizioni che portano ad una risposta immunitario indebolito. In particolare, questo gruppo di individui è anche ad un elevato rischio di contrarre gravi malattie causate da V. vulnificus, che si trova in habitat naturali simili a V. parahaemolyticus. V. parahaemolyticus è abitualmente isolato usando tiosolfato-citrato-biliari sali-saccarosio (TCBS) agar come un terreno selettivo e differenziale. Arricchimento in acqua peptonata alcalina può precedere isolamento su TCBS agar. presunte colonie su TCBS sono poi ulteriormente testati in una serie di test biochimici e / o saggi molecolari mirati la presenza di geni specie-specifici. Metodi basati sulla PCR sono spesso usati per confermare l&#39;identità di V. parahaemolyticus amplificando il gene emolisina termolabile, tlh 12. Indipendentemente dal choice dei metodi di conferma, è importante disporre di un mezzo efficace per isolare e differenziare V. parahaemolyticus da altri vibrioni marini, in primo luogo. TCBS è stato solitamente usata per differenziare le specie all&#39;interno del genere Vibrio secondo le loro capacità di fermentare il saccarosio 12. Reazione di fermentazione positiva è accompagnato da un cambiamento di colore dell&#39;indicatore pH bromotimolo blu. V. colonie parahaemolyticus sono abbastanza distintivo TCBS, esibendo blu al colore verde. Tuttavia, questo mezzo non può facilmente distinguere V. alginolyticus e V. cholerae. Proteus saccarosio-fermentazione possono produrre colonie gialle simili a V. cholerae o V. alginolyticus 13. Su isolamento iniziale TCBS, V. parahaemolyticus può anche essere erroneamente identificato come Aeromonas hydrophila, shigelloides Plesiomonas, e Pseudomonas spp 14. Ceppi con ferm saccarosio in ritardosentazione può essere confusa con altri saccarosio nonfermenting Vibrio 13, che comprendono V. parahaemolyticus. TCBS è risultato essere non sensibili contro Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, tra gli altri. Diverse altre specie cedono verde di colonie grigie, che sono potenzialmente confondibili con V. parahaemolyticus o V. vulnificus 15. Di conseguenza, è desiderabile sviluppare mezzi di cultura alternativa con una migliore sensibilità e specificità verso individuare e isolare V. parahaemolyticus e di altre specie strettamente correlate. Diverse alternative dei media sono stati recentemente sviluppati. Inoltre l&#39;inclusione di agenti selettivi, più incorporano substrati cromogeni per differenziare le specie in base alle loro attività enzimatiche differenziali. Ad esempio, indoxyl-β-glucoside e indoxyl-β-galattoside sono stati utilizzati come substrati cromogeni differenziare V. paràcolonie haemolyticus (che appaiono blu-verde) da quelle di V. cholerae (viola) a causa della loro capacità di produrre differenziali β-glucosidasi e β-galattosidasi 16. Diverse formulazioni di cromogenico agar sviluppate da diversi gruppi sono stati valutati e sono stati segnalati per eseguire paragonabile o superiore a quella TCBS 17,18,19. Un vantaggio di utilizzare un terreno cromogeno è che la colorazione del mezzo circostante è minimo facilitando così l&#39;isolamento di colonie particolari. In questo studio abbiamo valutato la capacità di un terreno cromogeno nuova formulazione per rilevare ed isolare V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus; con un focus particolare sulla sua capacità di differenziare V. parahaemolyticus da altre specie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Reagent/Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BHI powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0418-17-7</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blender</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>to blend oyster meat</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CampyGen gas generator</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>CN035A</td>
			<td>to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chocolate agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>E14</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S50712</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S348903</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel doc</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HardyChrom Vibrio agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>G319</td>
			<td>This study evaluates this medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculating loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-606</td>
			<td>10 microliter-size was used in this study</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oysters</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R23701</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette and tips</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized tips</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers for tlh</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scale</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spreader</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-11</td>
			<td>Beads may be used instead</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stomacher blender</td>
			<td>Stomacher</td>
			<td >400</td>
			<td>Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.&#160; Other homogenizer can be used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile filter bags for blenders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TCBS powder</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td >265020</td>
			<td>This study evaluates this medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocycler</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TSB powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0370-07-5</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV viewing cabinet</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Emit long-wave UV light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Sources</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bacterial species and strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aeromonas hydrophila</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Candida albicans</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Campylobacter jejuni</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteus mirabilis</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Staphylococcus aureus</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Salmonella Choleraesuis</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shigella boydii</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shigella flexneri</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shigella sonnei</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibrio alginolyticus</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars)</td>
			<td >FDA, ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. damsela</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. fisherii</td>
			<td >Environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. fluvialis</td>
			<td >CDC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. furnissii</td>
			<td >CDC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. hollisae</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. metschnikovii</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. mimicus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc)</td>
			<td >ATCC, FDA, CDC, Environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. proteolyticus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. vulnificus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a more sensitive and specific chromogenic agar medium for the detection of vibrio parahaemolyticus and other vibrio species

Infezioni di origine alimentare negli Stati Uniti causata da specie Vibrio hanno mostrato una tendenza al rialzo. Nel genere Vibrio, V. parahaemolyticus è responsabile per la maggior parte delle infezioni -associated Vibrio. Così, la differenziazione precisa tra Vibrio spp. e rilevazione di V. parahaemolyticus è di fondamentale importanza per garantire la sicurezza del nostro approvvigionamento alimentare. Sebbene le tecniche molecolari sono sempre più comuni, i metodi di coltura-base sono ancora regolarmente fatte e sono considerati metodi standard in determinate circostanze. Pertanto, un nuovo mezzo agar cromogeno è stato testato con l&#39;obiettivo di fornire un metodo migliore per l&#39;isolamento e la differenziazione di clinicamente rilevante spp Vibrio. Il protocollo rispetto al limite di sensibilità, specificità e rilevamento per il rilevamento di V. parahaemolyticus tra il nuovo terreno cromogeno e un mezzo convenzionale. Vari V. ceppi parahaemolyticus (n = 22) ripresentando diversi sierotipi e fonte di origine sono stati utilizzati. Essi sono stati precedentemente individuati dalla Food and Drug Administration (FDA) e Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (CDC), e ulteriormente verificati nel nostro laboratorio da tlh -PCR. In almeno quattro prove separate, questi ceppi sono stati inoculati sui cromogenici agar e tiosolfato-citrato-biliari sali-saccarosio (TCBS) agar, che è il mezzo consigliato per la coltura di questa specie, seguita da incubazione a 35-37 ° C per 24 -96 ore. Tre V. ceppi parahaemolyticus (13,6%) non sono cresciuti in modo ottimale su TCBS, comunque esposti colonie verdi se non ci fosse la crescita. Due ceppi (9,1%) non ha dato i colonie ciano attesi sul agar cromogenico. V. non- ceppi parahaemolyticus (n = 32) sono stati testati per determinare la specificità del agar cromogenico. Tra questi ceppi, 31 non sono cresciuti o esposte altre morfologie di colonia. Il recupero medio di V. parahaemolyticus sul chromogenic agar era ~ 96,4% rispetto al agar soia trittico integrato con il 2% di NaCl. In conclusione, il nuovo agar cromogeno è un mezzo efficace per rilevare V. parahaemolyticus e per differenziarlo da altri vibrioni.

In questo studio, 54 ceppi microbici sono stati assemblati, che comprendeva 22 ceppi all&#39;interno V. Specie parahaemolyticus, altre 19 specie Vibrio, e 13 specie Vibrio non (Tabella 1). La maggior parte V. ceppi parahaemolyticus erano o ricevute da parte della FDA, CDC o altri dipartimenti sanitari statali. Essi rappresentano diversi sierotipi e fonti di isolamento. Questi ceppi sono stati precedentemente identificati dagli organismi di regolamentazione. Abbiamo confermato ulteriormente le identità di questi V. parahaemolyticus conducendo una tlh -PCR 21,22. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Specie </td><td rowspan="2"> Numero di ceppi testati </td><td colspan="2"> Crescita e colore delle colonie </td></tr><tr><td> TCBS </td><td> Cmedio hromogenic </td></tr><tr><td rowspan="2"> Aeromonas hydrophila </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Nessuna crescita </td><td> 1 ceppo nessuna crescita; </td></tr><tr><td> 1 ceppo colore magenta </td></tr><tr><td> candida albicans </td><td> 1 </td><td> crescita debole, giallo </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> Campylobacter jejuni </td><td> 1 </td><td> Nessuna crescita </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> Escherichia coli </td><td> 1 </td><td> Nessuna crescita </td><td> crescita debole, magenta </td></tr><tr><td> Proteus mirabilis </td><td> 1 </td><td> Nessuna crescita </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> Pseudomonas aeruginosa </td><td> 2 </td><td> Turchese </td><td> Giallo </td></tr><tr><td> Staphylococcus aureus </td><td> 1 </td><td> crescita debole, giallo </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> Salmonella choleraesuè </td><td> 1 </td><td> Nessuna crescita </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> Shigella boydii </td><td> 1 </td><td> Nessuna crescita </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 1 </td><td> Nessuna crescita </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> Shigella sonnei </td><td> 1 </td><td> Nessuna crescita </td><td> crescita debole, magenta </td></tr><tr><td> Vibrio alginolyticus </td><td> 3 </td><td> Giallo o turchese </td><td> Giallo </td></tr><tr><td> V. cholerae </td><td> 4 </td><td> Giallo o turchese </td><td> Magenta </td></tr><tr><td> V. damsela </td><td> 1 </td><td> Turchese </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V. fisheri </td><td> 1 </td><td> crescita debole, giallo </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> V. fluvialis </td><td> 1 </td><td> Turchese </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V.furnissii </td><td> 1 </td><td> Giallo </td><td> Giallo </td></tr><tr><td> V. hollisae </td><td> 1 </td><td> Turchese </td><td> Giallo </td></tr><tr><td> V. metschnikovii </td><td> 1 </td><td> Nessuna crescita </td><td> Nessuna crescita </td></tr><tr><td> V. mimicus </td><td> 1 </td><td> Turchese </td><td> Magenta </td></tr><tr><td> V. parahaemolyticus </td><td> 22 </td><td> La maggior parte dei ceppi di turchese </td><td> La maggior parte dei ceppi ciano; poche chiaro </td></tr><tr><td> V. proteolyticus </td><td> 1 </td><td> Turchese </td><td> Cobalto </td></tr><tr><td> V. vulnificus </td><td> 4 </td><td> Turchese o trasparente </td><td> Magenta </td></tr></tbody></table> Tabella 1. specie microbiche utilizzati in questo studio e le loro caratteristiche di crescita sul supporto selettivo e differenziale. Chiamata colore era based su una ruota colore. Ciano è simile al verde acqua; magenta è simile a lavanda rosa, turchese è simile a verde, giallo racchiude oliva e marrone. Quattro studi separati sono stati condotti per determinare la crescita e la morfologia delle colonie di questi ceppi sul supporto selettivo e differenziale - TCBS e agar cromogenico. TCBS è il mezzo convenzionale utilizzato per l&#39;isolamento di alcune specie Vibrio, compresi V. cholerae e V. parahaemolyticus 12. La variazione di colore delle colonie coltivate su TCBS era giallo, turchese (verde) o trasparente (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig1.jpg" /> Figura 1. colonia morfologia del Vibrio spp. su TCBS agar. V. parahaemolyticus (turchese), V. cholerae (giallo), e am<html> inoculazione ixed delle due specie (a). Le colonie di V. parahaemolyticus appaiono turchese, con una circolare, tutto, e la morfologia convessa (b). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54493/54493fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> La capacità di un nuovo mezzo cromogenico per selezionare per clinicamente rilevanti specie Vibrio da alimenti e campioni ambientali è stato testato. Inoltre, è stata valutata la capacità di questo mezzo per distinguere simultaneamente queste specie uno dall&#39;altro. Colore Colony osservato sul agar cromogenico erano cobalto, ciano, magenta, giallo o trasparente (Figura 2). Come indicato nella tabella 1, sia TCBS e l&#39;agar cromogenico esposti certi gradi di selettività nei confronti non microrganismi Vibrio. 1 &quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig2.jpg" /> Figura 2. colonia morfologia del Vibrio spp. sulla agar cromogenico nuova concezione. V. parahaemolyticus (ciano), V. cholerae (magenta), ed un inoculo misto delle due specie (a). Le colonie di V. parahaemolyticus appaiono ciano, con una circolare, tutto, e la morfologia convessa (b). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54493/54493fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Seguendo il metodo di conteggio piastra standard sulle culture durante la notte, le colonie di V. parahaemolyticus sono stati osservati sulle piastre di agar cromogenico che ricevono il più alto fattore di diluizione (vale a dire, df = 10 -8). Questi risultati sono stati paragonabili a quelli su un mezzo non selettivo (TSAS). Questo suggerisce che il limite di rilevamento del terreno cromogeno è simile a mezzi non selettivi, che è di circa 10 celle o inferiore in assenza di matrice alimentare. La capacità di rilevamento per altre specie Vibrio come V. alginolyticus, V. fluvialis e V. damigella era anche decente rispetto al mezzo non selettivo. Tuttavia, alcuni ceppi di V. cholerae, V. vulnificus e V. mimicus ceduto dai 10 ai 100 volte meno CFU sul agar cromogenico. Gli agenti selettivi utilizzati nei terreni selettivi cromogeni o altri inibiscono inevitabilmente alcune cellule. cellule danneggiate, per esempio, non ha potuto recuperare in terreni selettivi. Tuttavia, la capacità di rilevamento leggermente più povero è un non-problema nella maggior parte delle procedure di routine che impiegano una fase di arricchimento. Piccola quantità di microrganismi nel cibo o campione ambientale moltiplicherebbe ad un alto livello nel brodo di arricchimento, superando il limite di rilevazione. Arricchimento in acqua peptonata alcalina è often fatto per determinare la prevalenza di specie Vibrio in campioni ambientali 12. In presenza di omogenato ostriche, l&#39;agar cromogenico continuato a mostrare un buon grado di recupero. In altre parole, gran parte (&gt; 70%) di V. cellule parahaemolyticus erano in grado di crescere su agar cromogenico, influenzato dalla presenza della matrice di ostriche (Figura 3a). La crescita e recupero di V. cellule parahaemolyticus non era anche influenzata dalla presenza di un&#39;altra specie Vibrio (Figura 3b). Questo è un attributo importante perché campioni ambientali sono destinati a contenere diverse specie Vibrio, che sono a numeri elevati soprattutto dopo una procedura di arricchimento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54493/54493fig3.jpg" /> Figura 3. </strong&gt; recupero per cento di un V. ceppo parahaemolyticus in ostriche omogeneizzato con e senza un concorrente batterica. Recupero (media ± SD) è stata calcolata in base al osservata vs l&#39;atteso CFU contare sulle piastre di agar. conteggio CFU atteso è stato calcolato sulla base della carica batterica nel inoculo. Alto recupero di un V. parahaemolyticus ceppo è stato osservato su tutti i media, senza la concorrenza (a). Livello simile di recupero è stato osservato quando alti livelli di V. cellule metschnikovii era presente (b). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54493/54493fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per confrontare ulteriormente l&#39;agar cromogenico e TCBS, la sensibilità e la specificità sono state calcolate. La Tabella 2 mostra la capacità di questi mezzi ACCUseparatamente identificare V. parahaemolyticus. La sensibilità è correlato alla percentuale di vero positivo, che significa che il V. ceppi parahaemolyticus ha prodotto la morfologia delle colonie previsto sul supporto. Specificità è relativo alla percentuale di vera negativa, il che significa non V. ceppi parahaemolyticus dovrebbero mostrare scarsa o nessuna crescita, o di una diversa morfologia delle colonie di V. parahaemolyticus. La sensibilità e la specificità per TCBS per identificare V. parahaemolyticus erano 86,4% e 71,8% rispettivamente. In confronto, la sensibilità e la specificità del terreno cromogeno erano 90,9% e 96,9% rispettivamente. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> un) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCBS agar </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> Non-V. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> Buona la crescita e turchese colonies </td><td> 19 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> colonie scarsa crescita o non-turchese </td><td> 3 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> b) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chromogenic agar </td><td> V. parahaemolyticus </td><td> Non-V. parahaemolyticus </td></tr><tr><td> Buone colonie di crescita e ciano </td><td> 20 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> colonie scarsa crescita o non-ciano </td><td> 2 </td><td> 31 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. La sensibilità e la specificità di TCBS (a) e cromogenico (b) agar nella rilevazione di V. parahaemolyticus. Le identità di V. parahaemolyticus sono stati determinati in precedenza dai test biochimico e tlh- PCR.

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Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; E Altro<em&gt; Vibrio</em&gt; Specie

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

14.4K Views.  California Polytechnic State University. Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium. 

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Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

La colonizzazione delle Euprymna scolopes Squid da Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - un metodo per modificare geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sulla base di trasformazione naturale e FLP-ricombinazione

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; Eimeria</em&gt; Che infettano Polli

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

L&#39;utilizzo della tecnica di sovrapposizione Soft-agar per lo screening composti inibitori bacterially Prodotto

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.