This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost's Fellowship from CMU.

1. Espressione e purificazione di Tret da Top10 E. coli NOTA: Si prega di contattare gli autori per richiedere la Tret-esprimendo ceppo di E. coli (pBAD Tret plasmide, contenente il gene Tret T. tenax sotto il controllo della proteina AraC, trasformato in Top10 E. coli 19) e l&#39;accordo di trasferimento materiale allegato . Il protocollo che segue fornisce tipicamente una resa di proteine ​​di circa 4 mg / L. <ol><li> Preparare una cultura durante la notte 3 ml di Tret che esprimono E. coli. <ol><li> Streak Top10 E. coli trasformato con pBAD-Tret vettore di espressione in un brodo lisogenia (LB) piastra di agar contenente 100 mg ampicillina / mL. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per circa 48 ore. </li><li> Scegliere una singola colonia dalla piastra e inoculare 3 mL di terreno liquido LB contenente 100 mg ampicillina / mL in una provetta di coltura. </li><li> Posizionare il tubo in un incubatore agitazione a 37 &amp; #176; C x 175 giri al minuto durante la notte. </li></ol></li><li> Indurre l&#39;espressione della proteina in Tret-esprimendo E. coli. <ol><li> Aggiungere 750 mL Terrific Broth completato con 100 mg / ml ampicillina a un pallone di coltura 2.800 ml Fernbach. Trasferire 1 ml di brodo dal pallone in una provetta per un uso successivo come bianco. </li><li> Aggiungere la cultura durante la notte 3 ml generato nel passaggio 1.1.4 al pallone di coltura, quindi posizionare il pallone in un incubatore e agitare a 37 ° C x 200 giri al minuto. Controllare periodicamente l&#39;assorbanza della cultura a 600 nm rispetto al vuoto rilevati nella fase 1.2.1. </li><li> Una volta che l&#39;assorbanza a 600 nm raggiunge tra 0,5-1,0, indurre l&#39;espressione Tret con l&#39;aggiunta di 750 ml di soluzione 1 M arabinosio (1 mM concentrazione finale) alla cultura. Riportare il pallone incubatore e agitare una notte a 37 ° C x 200 giri al minuto. </li></ol></li><li> Pellet e la lisi dei Tret-esprimono cellule di E. coli. <ol><li> Trasferire la cultura di un polipropilene Bottle e centrifugare per 15 min a 4000 xga 4 ° C. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad una provetta da 50 ml e centrifugare per 15 min a 4000 xga 4 ° C. Eliminare il surnatante e sia procedere alla lisi cellulare (fase 1.3.4) o conservare il pellet a tempo indeterminato a -80 ° C. </li><li> Sciogliere mini tablet 1 inibitore della proteasi in 20 mL di tampone di lavaggio (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolo, pH 8,0) in una provetta da 50 ml. </li><li> Trasferire il tampone di lavaggio inibitore contenente proteasi al tubo conico contenente il pellet. Vortex finché il pellet viene risospeso. </li><li> Trasferire le cellule risospese in un becher da 100 ml e lisare le cellule mediante sonicazione (sequenza di impulsi di 45 secondi, 45 secondi con un tempo di esecuzione di 2 min e 15 secondi ad una ampiezza di 75 per cento). </li><li> Trasferire il lisato in una provetta conica da 50 ml metalloe centrifugare per 60 min a 15.000 xg a 4 ° C. </li><li> Chiarire il lisato dal passaggio attraverso un filtro a siringa da 0,2-0,45 micron in una provetta da 50 ml. NOTA: La concentrazione tipica di lisato ottenuto è di 100 mg / mL. </li></ol></li><li> Purificare Tret da E. coli lisato cellulare utilizzando proteine veloce cromatografia liquida (FPLC). <ol><li> Impostare la FPLC con una colonna di nichel affinità (5 ml di volume del letto). Lavare la colonna con 10 mL di acqua deionizzata o finché la colonna è pulito da qualsiasi contaminante. Equilibrare la colonna con 20 mL di tampone di lavaggio (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolo, pH 8,0) ad una portata di 1 ml / min. </li><li> Caricare il lisato (20 mL) ottenuto dalla fase 1.3.8 nella colonna e eluire le proteine ​​senza tag con tampone di lavaggio ad un flusso di 1 mL / min finché l&#39;assorbanza raggiunge livelli di fondo (tipicamente 80-100 ml di tampone di lavaggio sono necessari) . </li><li> Eluire His-tag Tret utilizzando un lineare di ggardiente di tampone di eluizione (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8,0) 1-100% più di 60 min ad una velocità di flusso di 1 mL / min. Raccogliere 4 frazioni mL fino a Tret è eluito e l&#39;assorbanza raggiunge livello di base. NOTA: Tipicamente, 60 mL di tampone di eluizione sono necessari per eluire la proteina e la proteina eluisce nell&#39;intervallo tampone di eluizione 60-100%. Circa il 10-15 ml di puro Tret nel tampone di eluizione si ottengono. </li><li> Determinare la concentrazione di Tret misurando l&#39;assorbanza a 280 nm contro un bianco tampone di eluizione. </li></ol></li><li> Scambio Tret in tris (idrossimetil) aminomethane (Tris) tampone con la dialisi. <ol><li> Dopo aver preparato il tubo di dialisi secondo le istruzioni del produttore, riempire la risciacquando con acqua deionizzata e poi tampone Tris (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0). </li><li> Caricare il campione di Tret nel tubo di dialisi con una siringa e l&#39;ago smussato. Dializzare durante la notte unContro 2 L di tampone Tris. </li><li> Determinare la concentrazione di Tret misurando l&#39;assorbanza a 280 nm contro un bianco raccolto dal lavaggio dialisi. </li><li> Trasferire la soluzione Tret ad una provetta da 50 ml e procedere alla sintesi analogica trealosio (fase 2) o conservare l&#39;enzima a 4 ° C. NOTA: Tret è una proteina termostabile. Il Tret è stato memorizzato in tampone Tris a 4 ° C per diversi mesi senza osservare significativa perdita di attività. </li></ol></li></ol> 2. One-step sintesi di trealosio analoghi Utilizzando Tret Enzyme NOTA: Il protocollo seguente descrive una scala reazione basato su 4 volumi mL, che può erogare circa 15-30 mg di trealosio analogico seconda dell&#39;efficienza di reazione e del peso molecolare del prodotto. I componenti della reazione possono essere scalati per ottenere più o meno trealosio analogico se lo si desidera. <ol><li> Aggiungere analogo del glucosio (0,080 mmol, massa dipende dal peso molecolare), UDP-glucosio (0.160 mmol, 97,6 mg), e MgCl 2 (0,080 mmoli, 16,3 mg) ad un tubo da 15 ml. Le concentrazioni finali di questi componenti saranno 20 mm, 40 mm e 20 mm rispettivamente. </li><li> Aggiungere Tret in tampone Tris (ottenuto dalla fase 1.5.4) e, se necessario, un volume adeguato di tampone Tris (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0) per ottenere una concentrazione enzimatico finale di 300 mg / ml e una finale volume di 4 ml. Pipettare la miscela su e giù delicatamente o invertire la provetta per sciogliere i solidi. </li><li> Incubare la reazione a 70 ° C con agitazione a 300 rpm per 1 ora, quindi inserire il tubo in ghiaccio per raffreddare. </li></ol> 3. Purificazione di trealosio analoghi dal greggio miscela di reazione enzimatica <ol><li> Pre-risciacquare un&#39;unità filtro centrifugo (nominale limite di peso molecolare (NWML) 10 kDa) per rimuovere tracce glicerolo nella membrana aggiungendo 3 mL di acqua deionizzata all&#39;unità filtro centrifugo e centrifugazione a 3.000 xg fino a quando tutto il liquido passa attraverso il filtronel tubo (circa 20 min). Ripetere altre due volte. Completare questa fase immediatamente prima o durante la reazione (passo 2.3). </li><li> Dopo raffreddamento la miscela di reazione enzimatica (ottenuto dalla fase 2.3), trasferire all&#39;unità filtro centrifugo pre-risciacquato. Sciacquare il tubo di reazione con 1 ml di acqua deionizzata e trasferimento all&#39;unità filtro centrifugo. Ripetere risciacquo del tubo di reazione per il massimo recupero del prodotto. </li><li> Centrifugare l&#39;unità filtro centrifugo a 3.000 xg fino a quando tutto il liquido passa attraverso il filtro nel tubo (circa 20 min). Risciacquare la camera superiore dell&#39;unità filtro centrifugo con 3 mL di acqua deionizzata e centrifugare a 3000 xg fino a quando tutto il liquido passa attraverso il filtro nel tubo (circa 20 min). Ripetere risciacquo per il massimo recupero del prodotto. </li><li> Eliminare la camera superiore dell&#39;unità filtro centrifugo. Aggiungere a letto misto di resina a scambio ionico (3 g) al filtrato nella parte inferiore del tubo (tipico filtrato volume è 8-15 mL a seconda del numero di risciacqui). Mescolare a temperatura ambiente per 1 ora con ancoretta magnetica ad una velocità sufficiente a mantenere le perle di resina sospese nella soluzione. </li><li> Decantare il surnatante e filtrare per rimuovere la resina. Aggiungere 5 ml di acqua deionizzata per lavare la resina rimanente. Decantare il surnatante e filtrare, combinandola con la soluzione di prodotto dalla prima decantazione. Ripetere risciacquo della resina per il massimo recupero del prodotto. </li><li> Analizzare la reazione mediante cromatografia su strato sottile (TLC) o HPLC per determinare se è stata raggiunta la completa conversione del glucosio analogico materiale prodotto trealosio analogico partenza. Vedere il punto 4.1 per l&#39;analisi TLC e passo 4.2 per l&#39;analisi HPLC. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua per liofilizzazione o evaporazione rotante per dare il prodotto essiccato. Se nessun analogo del glucosio non reagito è stato osservato durante TLC o HPLC, la purificazione mediante cromatografia è necessaria. Pesare il prodotto per ottenere la reazione Yield ed eseguire risonanza magnetica nucleare (NMR) spettroscopica analisi (passo 4.3) per confermare la struttura del prodotto e purezza. </li><li> Se non reagito analogo del glucosio è stata osservata durante l&#39;analisi TLC, separarlo dal analogico trealosio utilizzando una colonna dimensione di esclusione. <ol><li> Preparare una colonna 1 x 100 cm che contiene, media P2 di poliacrilamide dimensioni tallone di esclusione deionizzata saturi d&#39;acqua extra-sottili in base alle istruzioni del produttore. NOTA: La colonna esclusione dimensionale può essere riutilizzato dopo il lavaggio con acqua deionizzata. </li><li> Ridisciogliere il prodotto di reazione enzimatica essiccato (ottenuto dalla fase 3.7) in 0,5 mL di acqua deionizzata. Applicare la soluzione di prodotto alla colonna esclusione dimensioni manualmente oppure utilizzando un adattatore di flusso della colonna. Sciacquare la fiala che conteneva il prodotto grezzo con altri 0,5 ml di acqua deionizzata, e caricarlo nella colonna dimensione di esclusione. </li><li> Eluire il prodotto con acqua deionizzata mediante flusso per gravità e raccogliere frazioni di circa 2 mil volume L. </li><li> Analizzare le frazioni da TLC (passo 4.1). In comune le frazioni contenenti puro analogico trealosio. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua per liofilizzazione o evaporazione rotante per dare il prodotto essiccato. Pesare il prodotto per ottenere la resa di reazione e procedere ad analisi NMR (vedi punto 4.3). </li></ol></li></ol> 4. Analisi di trealosio analogici Prodotti <ol><li> Eseguire l&#39;analisi cromatografia su strato sottile (TLC) di reazione Tret. NOTA: Questa procedura può anche essere utilizzato per analizzare formato frazioni di colonna esclusione. Può essere necessario concentrare la miscela di reazione o di colonna frazioni prima dell&#39;analisi TLC osservare colorazione composto sulla piastra TLC. <ol><li> Mark corsie sulla superficie della piastra TLC con una matita e applicare analita (s) e dello standard pertinenti (s) per le corsie appropriate, compreso lo standard analogo del glucosio, lo standard trealosio analogico (se presente), la miscela di reazione (o frazioni raccolte dalla dimensioni exclusion colonna di purificazione), e un co-spot. Dopo l&#39;applicazione ciascun campione alla piastra TLC, permettono la piastra si asciughi. NOTA: Per l&#39;analisi di reazione, tipicamente 2 ml di campione viene applicato alla piastra TLC. </li><li> Sviluppare la piastra TLC usando n -butanol / etanolo / acqua deionizzata (5: 3: 2). </li><li> Asciugare la piastra TLC sviluppata, poi immergerlo in 5% H 2 SO 4 in etanolo (zucchero macchia) e il calore su un piatto caldo in alto impostazione fino spot contenenti zucchero possono essere visualizzate (in genere 5 min). </li></ol></li><li> Eseguire l&#39;analisi HPLC delle miscele di reazione Tret utilizzando qualsiasi sistema HPLC in grado di separare e rivelare carboidrati. Questo protocollo prevede la separazione di carboidrati usando una colonna HPLC amminopropil e rilevamento utilizzando indice di rifrazione. <ol><li> Attaccare amminopropil colonna (4,6 x 250 mm) contenente una guardia pre-colonna alla HPLC. </li><li> Equilibrare amminopropil colonna con 80% acetonitrile in acqua deionizzata ad una velocità di flusso di 0,4mL / min. </li><li> Caricare la soluzione del prodotto di reazione (o standard) sulla colonna amminopropil. </li><li> Eluire il prodotto (o standard) con 80% acetonitrile in acqua deionizzata ad una velocità di flusso di 0,4 mL / min e una temperatura della colonna di 50 ° C. Tipicamente, il tempo di esecuzione utilizzata è 40 min. NOTA: Sia il materiale di partenza analogo del glucosio e il prodotto analogo trealosio può essere rilevato da indice di rifrazione, anche se altri metodi come evaporativo rilevamento dispersione della luce (ELSD) potrebbero essere utilizzati. Utilizzando le condizioni descritte, gli analoghi di glucosio tipicamente eluiscano 10-15 min e trealosio analoghi eluiscano tra 15-25 min. </li></ol></li><li> Analisi NMR di analoghi trealosio purificati. <ol><li> Sciogliere purificata analogico trealosio in D 2 O (700 ml) e trasferire la soluzione di un tubo NMR. </li><li> Acquisire 1 H e 13 C NMR secondo opportune protocolli impianto NMR. </li></ol></li></ol><ol><li> Sintetizzare, purificare e amministrare 6-TreAz a M. smegmatis (Msmeg). <ol><li> Aggiungere 6-azido-6-deossi glucopiranosio (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glucosio (0,040 mmol, 24,4 mg), e MgCl 2 (0,020 mmol, 4,1 mg) ad un tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere Tret in tampone Tris (ottenuto dalla fase 1.5.4) per ottenere una concentrazione enzimatico finale di 300 mg / ml e un volume finale di 1 ml. Pipettare la miscela su e giù delicatamente o invertire la provetta per sciogliere i solidi. </li><li> Incubare la reazione a 70 ° C con agitazione per 15 min. </li><li> Diluire la miscela di reazione enzimatica con 3 mL di acqua deionizzata e trasferirlo ad una unità filtro centrifugo pre-lavata (NMWL 10 kDa). Centrifugare l&#39;unità filtro a 3.000 xg fino maggior parte del liquido passa attraverso il filtro nel tubo, di circa 10 min. </li><li> Scartare °e camera superiore dell&#39;unità filtro centrifugo. Aggiungere a letto misto di resina a scambio ionico (0,75 g) al tubo e mescolare / agitare a temperatura ambiente per 25 min. Decantare il surnatante e filtrare per rimuovere la resina. NOTA: Procedura 5.1.1-5.1.5 forniscono una soluzione acquosa di 6-azido-trealosio (6-TreAz) a circa 5 mM concentrazione in meno di 1 ora. La concentrazione 5 mM stima basata sulla conversione quantitativa del substrato nel prodotto e della diluizione che si svolge durante le fasi di purificazione, assumendo minima perdita di prodotto durante queste fasi. La soluzione può essere filtrata sterile prima dell&#39;addizione di un campione biologico, se desiderato. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di soluzione di prodotto 6-TreAz ad una cultura di log-fase del M. smegmatis (Msmeg), in genere per ottenere un volume di coltura di 100-1.000 ml e una concentrazione finale 6-TreAz di ~ 25 micron. Incubare le cellule a 37 ° C per il tempo desiderato, tipicamente 60 min. </li></ol></li><li> Eseguire clicca chimica di coniugare un fluoroforo alle cellule azide marcato. In questo protocollo, utilizzare Cu-catalizzata cicloaddizione azide-alchino (CuAAC) per fornire un fluoroforo per azidi superficie cellulare in Msmeg. <ol><li> Centrifugare le cellule a 3.900 xg per 5 minuti, e poi lavare le cellule con PBS contenente 0,5% di albumina di siero bovino. Ripetere due volte. </li><li> Risospendere le cellule in pellet in 4% para-formaldeide in PBS per risolverli. Dopo incubazione per 10 minuti, ripetere il passaggio 5.2.1 per lavare le cellule. </li><li> Risospendere le cellule in pellet in 138 microlitri di PBS. </li><li> Aggiungere 3 ml di ± 1 mm soluzione madre di alchini-carboxyrhodamine 110 (Acetilene-488) in DMSO. </li><li> Aggiungere 3 ml di un 60 mm appena preparato di soluzione di ascorbato di sodio in acqua deionizzata. </li><li> Aggiungere 3 ml di 6,4 mM di soluzione di Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (TBTA) in terz -butanol / dimetilsolfossido (DMSO) 4: 1. </li><li> Aggiungere 3 &amp; #956; L di 50 mM di soluzione di CuSO 4 in acqua deionizzata. </li><li> Pipettare la cella di sospensione su e giù, poi incubare al buio a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Ripetere il passaggio 5.2.1 per lavare le cellule. Risospendere le cellule in 150 microlitri di PBS. </li></ol></li><li> Eseguire l&#39;analisi della fluorescenza cellulare. In questo protocollo, utilizzare la microscopia a fluorescenza di visualizzare la fluorescenza cellulare di etichetta Msmeg. <ol><li> Aggiungere 10 ml di cellule batteriche sospese in PBS ad un vetrino da microscopio e leggermente diffondere il liquido in uno strato sottile con il bordo di un vetrino. Lasciare asciugare all&#39;aria nel buio. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzo di montaggio sopra il campione essiccato, quindi posizionare la copertura scivola sul campione e applicare l&#39;adesivo (ad esempio, smalto per unghie) per immobilizzare. </li><li> Immagine le diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza a ingrandimento 100X. </li></ol></li></ol>

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Microbiol. 190, 355-369 (2008).</li><li>Urbanek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+of+trehalose+analogues:+rapid+access+to+chemical+probes+for+investigating+mycobacteria.">Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria.</a> ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+Huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Torn&#248;e, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(I)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li><li>Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose-recycling+ABC+transporter+LpqY-SugA-SugB-SugC+is+essential+for+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Analoghi trealosio hanno il potenziale di impatto vari campi, dalla conservazione dei prodotti alimentari e farmaceutici per la diagnosi e il trattamento delle infezioni microbiche 6. Esistenti metodi di sintesi più fasi chimiche sono utili per la produzione di analoghi trealosio complessi con più siti di modifica (ad esempio, in natura complesse glicolipidi micobatteri). Tuttavia, questi metodi sono sempre lungo e inefficiente, anche se applicato alla sintesi di relativamente semplici...

Il trealosio è un disaccaride simmetrica non riducente consistente in due frazioni di glucosio che sono uniti da un 1,1-α, legame α-glicosidico (Figura 1A). Mentre trealosio è assente da esseri umani e altri mammiferi, si trova comunemente nei batteri, funghi, piante e invertebrati 1. Il ruolo primario di trealosio in molti organismi a proteggere dagli stress ambientali, come essiccazione 1. Inoltre, alcuni agenti patogeni umani richiedono trealosio per la virulenza, compresa la tubercolosi Mycobacterium tuberculosis causano, che utilizza trealosio come mediatore della biosintesi busta cellulare e come un blocco di costruzione per la costruzione di glicolipidi immunomodulanti 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg" /> Figura 1: Il trealosio e analoghi trealosio. (A) Strutture di trealosio naturale e un analogo trealosio innaturale, dove X è una modifica strutturale. (B) Esempi di analoghi trealosio riportati in letteratura che hanno potenziali applicazioni in bioconservazione e bioimmagini. Grazie alla sua struttura unica e funzioni fisiologiche, trealosio ha attirato grande attenzione per l&#39;uso in bio (tecno) logici e applicazioni biomediche 3. Le proprietà protettive del trealosio osservati in natura- ad esempio, la sua capacità sorprendente per contribuire a sostenere la vita delle piante &quot;Resurrezione&quot;, che sono stati sottoposti a disidratazione estrema 4 -hanno spronato il suo ampio uso in applicazioni bioconservazione. Trealosio è stato usato per conservare una vasta gamma di campioni biologici, come acidi nucleici, proteine, cellule e tessuti 3. Per esempio, trealosio viene utilizzato come additivo stabilizzante in un certo numero di prodotti farmaceutici tcappello sono sul mercato, tra cui diversi anticorpi monoclonali anti-cancro 3. Così, trealosio viene utilizzato come dolcificante nell&#39;industria alimentare, ed è ampiamente usato per la conservazione del prodotto sia nell&#39;industria alimentare e cosmetica. L&#39;adozione di trealosio per questi tipi di applicazioni commerciali è stata inizialmente limitata dalla incapacità di ottenere grosse quantità di trealosio puro da fonti naturali o attraverso la sintesi. Tuttavia, è stato recentemente sviluppato un processo enzimatico efficiente per la produzione economica di trealosio da amido, che ha stimolato l&#39;uso commerciale diffuso 5. Derivati di trealosio chimicamente modificato, qui denominati analoghi trealosio, hanno guadagnato crescente attenzione per varie applicazioni (struttura generica mostrata in figura 1A, esempi specifici di analoghi trealosio illustrati nella Figura 1B) 6. Ad esempio, lacto-trealosio è un analogo trealosio con una sua unità di glucosio sostituito con galattosio, quindi il suo gruppo ossidrilico posizione 4 ha una configurazione stereochimica invertita. Lacto-trealosio ha le stesse proprietà stabilizzanti come trealosio, ma è resistente alla degradazione da parte degli enzimi intestinali, rendendolo attraente come un non-calorico additivo alimentare 6, 7. l&#39;interesse del nostro gruppo in analoghi trealosio si riferisce in primo luogo al loro valore come sonde e gli inibitori specifici per micobatteri. I gruppi di Barry e Davis hanno sviluppato un cheto-trealosio analogico fluoresceina coniugato, chiamato FITC-cheto-trealosio, che è stato mostrato al metabolicamente etichettare la parete cellulare di vivere M. tuberculosis, che consente il rilevamento da microscopia a fluorescenza 8. Il laboratorio Bertozzi sviluppato più piccolo azido-trealosio (TreAz) analoghi che potrebbero metabolicamente etichetta la parete cellulare e, successivamente, essere detette utilizzando clic chimica e analisi di fluorescenza 9. Questi progressi indicano la possibilità di utilizzare sonde trealosio-based come agenti di imaging diagnostico per la tubercolosi. Analoghi trealosio sono stati perseguiti come inibitori di M. tuberculosis a causa del loro potenziale di distruggere percorsi nel batterio che sono essenziali per la vitalità e la virulenza 10, 11, 12. Finora, il principale ostacolo allo sviluppo di analoghi trealosio per bio (tecno) applicazioni logiche e biomediche è la mancanza di metodi di sintesi efficienti. I due percorsi tradizionali per produrre analoghi trealosio basano sulla sintesi chimica (Figura 2). Un percorso coinvolge desymmetrization / modifica di trealosio naturale, mentre l&#39;altro comporta iniziano adeguatamente funzionalizzati blocchi monosaccaridi ed eseguendo glicosilazione chimicoforgiare la 1,1-α, legame α-glicosidico. Questi approcci, che sono stati recentemente discussi in articoli di revisione 13, 14, si sono dimostrati utili per compiere sintesi multistadio di piccole quantità di prodotti naturali trealosio contenenti complessi, come sulfolipid-1 da M. tuberculosis 15. Tuttavia, entrambi gli approcci sono generalmente inefficienti, tempo, inaccessibili ai non chimici, e, inoltre, non sono considerati essere rispettosi dell&#39;ambiente. Così, per sintetizzare alcuni tipi di analoghi trealosio, queste strategie non sono ideali. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg" /> Figura 2: Approcci alla sintesi trealosio analogico. Chimica si avvicina alla sintesi trealosio analogico, mostrato a sinistra, utilizzare le procedure più fasi che coinvolgono Protec difficilepassi zione / deprotezione, desymmetrization, e / o glicosilazione. sintesi enzimatica, mostrata a destra, usa enzima (s) per convertire stereoselettiva semplici, substrati non protetti trealosio analoghi in soluzione acquosa. Il protocollo enzimatica qui riportate utilizza un enzima trealosio sintasi (Tret) per convertire analoghi di glucosio e UDP-glucosio in analoghi trealosio in un unico passaggio. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Un efficiente percorso biocatalitico agli analoghi trealosio faciliterebbe la produzione, la valutazione e l&#39;applicazione di questa promettente classe di molecole. Mentre il processo enzimatico commerciale per la produzione di trealosio 5 non è adattabile a sintetizzare analoghi perché utilizza amido come substrato, ci sono altri percorso biosinteticomodi in natura che possono essere utilizzate per la sintesi analogica trealosio. Tuttavia, la ricerca in questo settore, che è stato recentemente rivisto 6, è stato limitato. Un rapporto ha usato un metodo ispirato al coli trealosio via biosintetica Escherichia per accedere a un singolo analogico fluoro-trealosio dal corrispondente fluoro-glucosio. Tuttavia, questo approccio richiede un sistema a tre enzima che ha limitato l&#39;efficienza e generalità 8. Un altro approccio che è stato esplorato è usare trealosio fosforilasi (TRTP) in senso inverso, che in linea permette la sintesi one-step di analoghi trealosio da analoghi di glucosio e di glucosio-1-fosfato 6, 16, 17. Anche se questo approccio può avere promessa futura, sia invertenti e trattenere i TREP attualmente hanno svantaggi per la sintesi analogica. Ad esempio, i TREP inversione hanno un espe proibitivomolecola nsive donatore (β-D-glucosio 1-fosfato) e TREP ritegno hanno scarsa resa di espressione dell&#39;enzima / stabilità e limitato la promiscuità substrato. Saranno necessari miglioramenti significativi (ad esempio, attraverso l&#39;ingegneria enzima) prima di sintesi analogica TREP-mediata è pratico. Allo stato attuale, l&#39;approccio più pratico per la sintesi enzimatica di analoghi trealosio è usare un enzima trealosio sintasi (TRET), che converte il glucosio e uridina difosfato (UDP) Glucosio in trealosio in un unico passaggio 6. Recentemente abbiamo segnalato l&#39;uso di Thermoproteus tenax Tret-un enzima termostabile e unidirezionale 18 -per sintetizzare analoghi trealosio da analoghi di glucosio e UDP-glucosio (Figura 3) 19. Questo enzima agisce solo nella direzione sintetica ed evita il problema del degrado trealosio trova nel sistema TREP. Questa reazione coul one-stepd essere completato in 1 ora, e una vasta gamma di analoghi trealosio sono stati accessibile in alto rendimento (fino a&gt; 99% come determinato da alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)) da substrati analogo del glucosio prontamente disponibili (vedi tabella 1 nelle Rappresentante dei risultati sezione). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg" /> Figura 3: Tret-catalizzata sintesi one-step di analoghi trealosio. L&#39;enzima Tret da T. tenax può stereoselettiva unirsi analoghi di glucosio prontamente disponibili e UDP-glucosio per formare analoghi trealosio in un unico passaggio. R 1 -R 4 = Variabile modifica strutturale, per esempio azido-, fluoro-, deoxy-, thio-, stereochimica, o modifiche di etichette isotopici; Y = eteroatomo variabile, ad esempio ossigeno o zolfo, o eteroatomo marcati con isotopi. Qui, forniamo annuncioprotocollo Nell&#39;odontoiatria per il processo di sintesi TRET, compresa l&#39;espressione e la purificazione di Tret da E. coli, ottimizzato condizioni di reazione TRET, ed un metodo di purificazione perfezionato che viene eseguita interamente in fase acquosa. Questo protocollo modificato consente la sintesi opportuno ed efficiente e purificazione di diversi analoghi trealosio su scala semi-preparativa (10-100 mg). Dimostriamo anche l&#39;uso di questo protocollo per la preparazione e la somministrazione di una sonda trealosio-based per micobatteri in meno di 1 ora, che ha permesso la rilevazione di fluorescenza rapida delle cellule micobatteri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate,</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">S374</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base ultrapure</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing, MWCO 12&#8211;14,000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-152-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Glucose analogues</td>
			<td>CarboSynth,</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Examples of vendors that offer numerous glucose analogues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Aldrich,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MA02620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-Glucose</td>
			<td>abcam Biochemicals</td>
			<td>ab120384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>444-9999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Fine Bio-Gel P2 media</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>150-4118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1056280001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AX0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide, 99.8%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>351430075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopropyl HPLC column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-488</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern Biotechnology</td>
			<td>10001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid one-step enzymatic synthesis and all-aqueous purification of trehalose analogues

versioni di trealosio, o analoghi trealosio modificati chimicamente, avere applicazioni in biologia, biotecnologia e scienza farmaceutica, tra gli altri campi. Per esempio, analoghi trealosio recanti tag rilevabili sono stati utilizzati per rilevare Mycobacterium tuberculosis e possono avere applicazioni come tubercolosi agenti di imaging diagnostico. versioni idroliticamente stabili di trealosio sono perseguiti a causa del loro potenziale per l&#39;uso come dolcificanti non calorici e agenti bioprotettivi. Nonostante il ricorso di questa classe di composti per varie applicazioni, il loro potenziale rimane inutilizzato a causa della mancanza di un percorso robusto per la loro produzione. Qui riportiamo un protocollo dettagliato per la rapida ed efficiente di uno stadio di sintesi di analoghi biocatalitiche trealosio che aggira i problemi associati con la sintesi chimica. Utilizzando l&#39;enzima termostabile trealosio sintasi (Tret) da Thermoproteus tenax, analoghi trealosio può essere generatEd in un unico passaggio da analoghi di glucosio e di glucosio uridina difosfato in alto rendimento (fino a conversione quantitativa) in 15-60 min. Un semplice e rapida protocollo di purificazione non-cromatografica, che consiste di rotazione dialisi e scambio ionico, in grado di fornire molti analoghi trealosio di concentrazione nota in soluzione acquosa in appena 45 min. Nei casi in cui non reagito analogo del glucosio rimane ancora, purificazione cromatografica del prodotto analogo trealosio può essere eseguita. In generale, questo metodo fornisce una piattaforma biocatalitico &quot;verde&quot; per la sintesi accelerato e purificazione di analoghi trealosio che sia efficiente e accessibile anche ai non farmacisti. Per esemplificare l&#39;applicabilità di questo metodo, si descrive un protocollo per la sintesi, tutto-acquosa di purificazione, e la gestione di un clic sonda chimica trealosio-based per micobatteri, ognuno dei quali ha meno di 1 ora e ha consentito la rilevazione di fluorescenza dei micobatteri. In futuro, prevediamo che, tra OTHer le applicazioni, questo protocollo può essere applicato alla rapida sintesi di sonde trealosio-based per la diagnostica della tubercolosi. Per esempio, di breve durata analoghi radionuclide-modificato trealosio (ad esempio, 18 trealosio F-modificato) potrebbe essere usato per le modalità avanzate di imaging clinico come la tomografia a emissione di positroni tomografia computerizzata-(PET-CT).

T. tenax Tret è stata ottenuta da E. coli in una resa di circa 4 mg / L utilizzando tecniche di espressione proteica e purificazione standard. Una singola fase di cromatografia di affinità nichel era sufficiente per purificare Tret da E. coli lisato (una traccia FPLC rappresentativo è mostrato in Figura 4). Come stabilito nella nostra pubblicazione iniziale sul processo di sintesi Tret, ricombinante T. tenax Tret è in grado di conv...

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Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Rapid One-step enzimatica Sintesi e All-acquosa Purificazione di trealosio analoghi

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.3K Views.  Central Michigan University. Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

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Biochimica

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

Rapido isolamento dei Mitoribosome da cellule HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

Estrazione di caffeina, l'attività enzimatica e l'espressione genica della sintasi di caffeina da sospensioni di cellule vegetali

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug targets. Yet, a major barrier to their characterization and exploitation in academic or industrial settings is that most biochemical, biophysical, and drug screening strategies require these proteins to be in a water-soluble state. Our laboratory recently developed the peptidisc, a membrane mimetic offering a &#8220;one-size-fits-all&#8221; approach to the problem of membrane protein solubility. We present here a streamlined protocol that combines protein purification and peptidisc reconstitution in a single chromatographic step. This workflow, termed PeptiQuick, allows for bypassing dialysis and incubation with polystyrene beads, thereby greatly reducing exposure to detergent, protein denaturation, and sample loss. When PeptiQuick is performed with biotinylated scaffolds, the preparation can be directly attached to streptavidin-coated surfaces. There is no need to biotinylate or modify the membrane protein target. PeptiQuick is showcased here with the membrane receptor FhuA and antimicrobial ligand colicin M, using biolayer interferometry to determine the precise kinetics of their interaction. It is concluded that PeptiQuick is a convenient way to prepare and analyze membrane protein-ligand interactions within one&#160;day in a detergent-free environment.

We present a method that combines membrane protein purification and reconstitution into peptidiscs in a single chromatographic step. Biotinylated scaffolds are used for direct surface attachment and measurement of protein-ligand interactions via biolayer interferometry.

PeptiQuick, un'incorporazione in un solo passaggio di proteine membrana in Peptidiscbio biotinylated per analisi di legame proteico semplificato

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...