Ringraziamo l&#39;Alleanza Organo Agenzia Recupero Vita dell&#39;Università di Miami per la fornitura di polmoni. Ringraziamo anche il Dr. Lisa Künzi per la preparazione del DNA usato per gli esperimenti mostrati nella Figura 2B e 3-D, il Dr. Ben Gerovac e Lisa Novak per il virus mCherry utilizzato per gli esperimenti nelle figure 3A a C. Ringraziamo anche Gabriel Gaidosh dalla struttura di imaging, Dipartimento di Oftalmologia presso l&#39;Università di Miami. Questo studio è stato sponsorizzato da finanziamenti del NIH, la Fondazione CF e l&#39;assistente di volo Medical Research Institute di Dr. Matthias Salathe.

1. Fase 1: cultura di HEK 293T <ol><li> Preparare cellule HEK supporti (denominato come HEK media) aggiungendo 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina ad alto glucosio Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM). </li><li> Cappotto uno 10 centimetri piatto di coltura di tessuti con collagene I. Mix 30 ml di collagene I in 2 ml di acqua distillata. Stendere l&#39;impasto sul piatto e incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Rimuovere la miscela e lasciare asciugare piatto in una cappa a flusso laminare per 15 min. </li><li> Cellule HEK piastra nel piatto rivestito ad una densità di celle 1 x 10 6 a 10 ml mezzi HEK e incubare a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Quando le cellule HEK sono 50-60% confluenti (Figura 1a, 2-3 giorni dopo la placcatura), passare alla fase 2. Valutazione visiva di confluenza è sufficiente. Non è necessaria alcuna quantificazione. Nota: cellule HEK sono coltivate in mezzi HEK (vedi sopra). Quando raggiungono confluenza, they può essere suddiviso (ad esempio 1/5) o congelati verso il basso per un uso successivo. </li></ol> 2. Fase 2: Produzione e la concentrazione di lentivirus (LV) in cellule HEK Nota: I protocolli devono essere eseguiti in linea con le normative istituzionali e governative in + (Enhanced BSL-2) le condizioni negli Stati Uniti BSL-2. <ol><li> Trasfezione utilizzando una procedura di precipitazione di calcio (Lipofectamine e altri agenti di trasfezione non fosse efficiente come la procedura di precipitazione di calcio). Si consiglia l&#39;uso di un kit trasfezione commerciale per garantire la riproducibilità, anche se la procedura è modificato come segue. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente. Questo è il giorno 0. </li><li> Per ogni 10 centimetri piatto di cellule HEK293, mescolare 4,5 mg di busta DNA PMD2-VSVG, 7,5 mg il confezionamento di DNA pMDLg / pRRE, 3,75 mg di DNA pRSV-rev, 10 mg di DNA di vettori lentivirali di espressione, di 86 ml di una soluzione 2 M di calcio e acqua sterile in un tubo da centrifuga da 15 ml per un volume finale di 700 microlitri(Questi ultimi due soluzioni vengono forniti nel kit trasfezione commerciale). </li><li> Goccia a goccia, aggiungere 700 ml di soluzione fisiologica 2x HEPES-buffered (HBS, forniti nel kit trasfezione), mentre vortex (nella cappa a flusso laminare) e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti (eseguire il passaggio 4 durante l&#39;attesa). </li><li> Durante il tempo di incubazione presto, deposito 5 microlitri della miscela su un vetrino. Controllare la goccia sotto un microscopio con un obiettivo 10X, concentrandosi lentamente su e giù. Un bel precipitato deve essere visibile, a conferma del processo di precipitazione di fosfato di calcio (Figura 1b). </li><li> Fermare la precipitazione dopo 30 minuti con l&#39;aggiunta di 10 ml di HEK cellule media e pipetta su e giù per mescolare. </li><li> Prendete il piatto di cellule HEK dal passaggio 2,1-2,5, e rimuovere il supporto (giorno 0). Aggiungere la soluzione precipitato dal punto 2.5 attentamente e lentamente lungo il bordo del piatto. </li><li> Il giorno successivo (giorno 1), rimuovere ed eliminare il supporto contenente il precipitato e sostituirlo wesimo 10 ml di terreno HEK. Controllare per fini precipitato sotto il microscopio: dovrebbe essere visibile nel piatto in spazi vuoti tra le cellule (Figure 1C e d). </li><li> Il giorno 2, raccogliere media con una siringa, filtro attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 3,8 ml di un glicole polietilene 40% soluzione (PEG). Inverti 5x per mescolare e conservare a 4 ° C per almeno 24 ore (per il PEG precipitare in modo da formare, ma non più di 5 giorni) fino a quando tutte le collezioni di virus sono completi. </li><li> Ripetere il passaggio 2.8 nei giorni 3 e 4. Il giorno 4 non sostituirli con media HEK ma decontaminare con il 10% di candeggina e scartare il piatto. </li><li> Centrifugare tutte le provette per la raccolta (in genere tutte le collezioni insieme il giorno 5) a 1.650 xg per 20 minuti a 4 ° C a pellet il virus. Rimuovere e scartare il surnatante, e far girare di nuovo a 1.650 xg per 5 minuti a 4 ° C per raccogliere e rimuovere ogni residuo di PEG surnatante. </li><li> Resuspend il pellet di ogni tubo in 200 ml di bronchiale mezzo di crescita epiteliale (BEGM) senza amfotericina B 8. riunirli e aliquota a 200 ml. virus Conservare a -80 ° C. Aliquota altri 10 ml di eseguire il test Gag di HIV-1 (p24) l&#39;antigene ELISA. </li><li> Utilizzando un kit commerciale ELISA, eseguire un test dell&#39;antigene p24 secondo il protocollo del produttore. Il test fornisce una stima della p24 virale in pg / ml. </li></ol> 3. Fase 3: cellule di coltura HBE primaria <ol><li> Cellule Piatto HBE in 10 ml BEGM supporti (con 100 microlitri amfotericina B se il passaggio 0 cellule sono utilizzati per eliminare eventuali contaminazioni fungine) ad una densità di celle 1 x 10 6 in collagene I spalmato 10 centimetri piatto di coltura tissutale. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere il supporto e sostituire con 10 ml BEGM (con 100 ml amfotericina B per il passaggio 0 cellule) per un totale di 4 giorni. Ritorno a incubatore. </li><li> Dopo 4 dAYS, utilizzare solo BEGM senza amfotericina B. Cambio media ogni due giorni. </li><li> Quando le cellule sono 80-90% confluenti (figura 2a; ~ 7 giorni dopo la placcatura), procedere con la trasduzione (prestare attenzione a 3,5 per la preparazione prima trasduzione). Ancora una volta, valutazione visiva di confluenza è sufficiente. Non è necessaria alcuna quantificazione. </li><li> Prima di trasduzione, cappotto gli inserti di supporto permeabili con una soluzione di collagene IV diluita 1/10 con acqua distillata sterile. Aggiungere 200 microlitri di ogni inserto e lasciare asciugare per una notte nella cappa a flusso laminare. </li></ol> 4. Fase 4: trasduzione delle cellule HBE <ol><li> Rimuovere supporti, aggiungere 3 ml di 0,1% tripsina in 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico in tampone fosfato isotonico (EDTA / PBS) e incubare 5 min a 37 ° C e 5% CO 2. Controllare al microscopio (obiettivo 10X) per vedere se tutte le celle sono staccati. In caso contrario, tornare alla incubatore per un ulteriore 5 min. </li><li> Quando tutte le cellule sono staccati, aggiungere 3ml di inibitore della tripsina di soia (SBTI 1 mg / ml), mescolare e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml. Agglomerare le cellule facendo girare a 460 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 3 ml di BEGM e procedere con il conteggio. </li><li> Risospendere le cellule HBE (ora di passaggio 1 o P1) in un rapporto di 2 x 10 5 cellule per un inserto di supporto permeabile 12 millimetri in 400 ml di BEGM (vedi tabella 2). Estrapolare questi numeri in base alla quantità di inserti di supporto permeabili che verranno trasdotte. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Superficie </td><td> Superficie </td><td> conta delle cellule </td><td> media </td><td> Volume (media) </td></tr><tr><td> 10 centimetri piatto </td><td> 52,7 cm 2 </td><td> 1 x 10 6 </td><td> BEGM </td><td> 10 ml </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Filtro 12 millimetri </td><td> 1.13 cm 2 </td><td> 2 x 10 5 </td><td> BEGM </td><td> 400 ml </td></tr><tr><td> Filtro 24 millimetri </td><td> 4.52 cm 2 </td><td> 8 x 10 5 </td><td> BEGM </td><td> 800 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2: media estrapolazione per il conteggio delle cellule. <ol start="5"><li> Utilizzando una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungere il volume appropriato di virus alla sospensione cellulare. </li><li> Aggiungere bromuro hexadimethrine a 2 mg / ml concentrazione finale. </li><li> Dispensare 400 microlitri della miscela (BEGM, HBE cellule, virus e hexadimethrine bromuro) per inserto supporto permeabile nel vano apicale, e aggiungere 1 ml di BEGM solo al vano basolaterale. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO 2. cellule Sempre piastra HBE senza virus come il controllo e la selezione di test puromicina, se applicabile. </li><li> Il giorno successivo, remmezzi apicale e basolaterale ove, lavare con PBS, e sostituire entrambi i comparti con l&#39;interfaccia aria-liquido (ALI) supporto 8. </li><li> Quando le cellule sono confluenti, rimuovere il liquido apicale (noto come stabilire una interfaccia aria-liquido). Continuare cambiando il mezzo (ALI) nel comparto inferiore a giorni fino a raggiungere la piena maturità; di solito da 3 a 4 settimane dopo. Nota: Se il vettore lentivirale contiene un gene di selezione, come puromicina, le cellule possono essere selezionate aggiungendo puromicina secondo una curva concentrazione selezione. Per le cellule HBE, una concentrazione di 1 mg / ml è stato determinato per essere ideale per la selezione consistente di cellule trasdotte. Tuttavia, questa concentrazione potrebbe differire per le altre cellule o condizioni e deve essere determinata uccidendo curve. L&#39;aggiunta di puromicina può iniziare già a partire un giorno dopo i media è stato sostituito dai media ALI o successivi (2-3 giorni) per consentire la piena espressione del gene di selezione. Assicurarsi di aggiungere puromicina a un inserto che hcome non è stata trasdotte. Puromicina può essere aggiunto finché le cellule sono completamente differenziate. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il protocollo qui delineato assicura quasi il 100% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, ci sono passaggi durante il processo che sono importanti per raggiungere questo obiettivo. Per esempio, durante il processo di trasfezione, la presenza di precipitati nel mix trasduzione (drop) o nel piatto il giorno dopo trasduzione (figure 1b e d) sono entrambi rilevanti per una buona trasfezione. L&#39;assenza di un precipitato o la presenza di agglomerati può essere dovuto ad una omissione di uno dei reagenti di trasfezione, un problema di pH, o un preparato plasmide cattiva. Se il precipitato è mancante, c&#39;è un&#39;alta probabilità che nessuno sarà visibile il giorno successivo. Inoltre, aggiungendo la miscela di trasfezione o supporti HEK troppo veloce può causare le cellule HEK per staccare, ostacolando trasfezione e la resa. Un&#39;altra indicazione di un buon rendimento al giorno 6 prima della fase di centrifugazione: un precipitato bianco deve essere visibile nella parte inferiore del tubo. Un cattivo trasfezione con quasinessun virus non creerà questa precipitato bianco. Durante il processo di trasduzione, è fondamentale utilizzare le cellule HBE primarie che sono stati de-differenziati e che sono in una delle cellule staminali come Stato al fine di ottenere efficienze elevate di trasduzione. L&#39;uso di un vettore contenente una proteina fluorescente come eGFP o mCherry che è facilmente visualizzato può essere un ottimo strumento. Le modifiche potrebbero essere apportate per adattare questo protocollo per diverse cellule primarie. Un approccio potrebbe essere quello di ridurre la concentrazione di calcio nella media. Come si vede in figura 3a, utilizzando BEGM media che contiene una minore concentrazione di calcio prodotto un significativo maggiore efficienza di trasduzione nelle cellule HBE primarie. Un altro approccio potrebbe essere quello di aumentare il MOI. Come mostrato nella figura 3d, maggiore è la MOI, migliore è l&#39;efficienza di trasduzione. Tuttavia, utilizzando un più alto MOI potrebbe diventare tossico per alcune cellule. Tuttavia, ci sono alcuni Limita<html> zioni al presente protocollo. Questa tecnica è stata sviluppata utilizzando passaggio 1 cellule HBE. Polmoni respinti per il trapianto sono stati ottenuti con adeguato consenso conforme ricerche per gli standard stabiliti dalla dichiarazione di Helsinki. Ottenere cellule HBE primarie da fonti commerciali può essere costoso. Queste cellule sono solitamente disponibili solo in un passaggio superiore. Questo protocollo non è stato testato su passaggi superiori a 2. Un altro fattore limitante è il test dell&#39;antigene p24 ELISA. Diverse compagnie offrono il kit, ma a costi elevati. Inoltre, la concentrazione virale in test, è solo un valore approssimativo poiché il test rileva p24 lentivirus e p24 libero rilasciato durante transitori trasfezione 17. Pertanto, questa valutazione di MOI è solo una stima. Infine, utilizzando l&#39;espressione diversi costrutti (maggiori o minori dimensioni) non può dare gli stessi risultati. Ad esempio, differenti efficienze sono state registrate usando mCherry e eGFP (dati non mostrati). ent &quot;&gt; Ci sono vantaggi di questo protocollo rispetto ad altri metodi. Uno di loro è il processo di trasfezione. Infatti, il protocollo proposto può produrre tali titoli ad alta virus che non avrà bisogno di essere concentrato i media raccolti contenenti virus e potrebbe essere utilizzato direttamente di trasdurre cellule. polietilene glicole (PEG), utilizzato in questo protocollo per concentrare il virus, è stato conosciuto per essere tossico per le cellule di mammifero 18. Inoltre, se sono stati utilizzati più alto MOI, questo aumenterebbe il rischio di tossicità anche di più. Tuttavia, se la fase di concentrazione PEG diventa obsoleto, ricercatori che non sono riusciti a trasdurre causa di effetti di tossicità potrebbe riconsiderare l&#39;uso dei lentivirus. Un altro vantaggio di questo protocollo è la mancanza di differenze di efficienza di trasduzione in plastica o inserti di supporto permeabili. il vantaggio di essere grado di trasdurre su plastica è che meno cellule e particelle virali sono necessari. di conseguenza, le cellule possono essere ampliati dopo trasduzione e trasferitisu inserti di supporto permeabili quando confluenti (dati non riportati). La scelta di vettori dipende da diversi aspetti, come la selezione di cellule trasdotte con puromicina o l&#39;espressione di proteine ​​marker come la proteina fluorescente verde (GFP). Ci sono molteplici vettori commerciali disponibili che sono adatti (pRRLsinPPT.CMV.MCS.Wpre, pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro, pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, pGEM-T Easy) 15,19-21. Selezione dei promotori rappresenta una sfida, dal momento che la CMV promoter comunemente usato è messo a tacere in vie aeree differenziate cellule epiteliali 15. Per l&#39;espressione specifica delle cellule ciliate, si raccomanda l&#39;uso del promotore volpe-J1. In alternativa, il promotore EF-1 può essere utilizzato per l&#39;espressione in tutte le cellule delle vie aeree 20,21. Se sono richieste iperespressione della proteina, la dimensione dell&#39;inserto determina, in parte, l&#39;efficienza di trasduzione. Tuttavia, le grandi dimensioni possono essere ospitati, come visto da trasduzione di successo del full-length ciclasi solubile ciclasi 22 .Il laboratorio ha pubblicato diversi sovraespressione di successo costruisce 15,16,20-22. Per espressione shRNA (di solito sotto il U6 o H1 promotore), più costrutti dovranno essere esplorate. Questo può essere noioso con prove effettuate alla fine del differenziamento (PCR e western blotting), ma il processo non può essere abbreviato in quanto le cellule non differenziate possono non essere una buona rappresentazione di successo per cellule in differenziazione. Anche in questo caso, il laboratorio ha pubblicato più di successo shRNA costruisce 14,20,21,23. Usando questo protocollo, più ricercatori potrebbero essere abilitati per migliorare significativamente precedenti trasduzione poveri. Alcuni potrebbero trovare utile per aumentare le efficienze facendo alcuni aggiustamenti. Alcuni potrebbero utilizzare questo strumento per scoprire nuovi processi biologici o per essere in grado di dimostrare i concetti, sia utilizzando atterramento o iperespressione strategie.

Lo sviluppo di replica-difettose, lentivirus pseudotyped (LV) ha fornito ai ricercatori un metodo sicuro ed efficace per fornire transgeni in vitro 1. Grazie alla loro espressione a lungo termine, questi LV potrebbe essere utilizzato anche per l&#39;erogazione di agenti terapeutici in vivo 2,3. La produzione di LV richiede co-trasfezione di rene embrionali umane (HEK) cellule con diversi plasmidi: vettore di trasferimento, imballaggi gag / pol, imballaggi di giri, e la busta vescicolare glicoproteina virus della stomatite (VSV-G) plasmidi. Sistemi di imballaggio di terza generazione sono considerati più sicuri rispetto ai sistemi di seconda generazione perché il gene rev è codificato su un plasmide confezione separata, riducendo così la possibilità di ricombinazione per produrre un lentivirus competente replica. Anche se i sistemi di confezionamento di seconda generazione producono cinque unità di trasduzione totali superiori piega, la scissione del genoma virale originale per creareil sistema di terza generazione ha diminuito il livello di trasduzione solo minimamente 3,4. Mentre le linee cellulari possono essere trasdotte più semplice ed efficiente, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione per le cellule primarie, perché questi sono più rappresentativi di tessuti in vivo 5,6. Tuttavia, le cellule principali sono refrattari alla trasduzione. Mentre sono stati segnalati trasduzione di cellule delle vie aeree epiteliale completamente differenziate, l&#39;efficienza complessiva non sia superiore al 15% 7. Qui descritto è un protocollo che permette la produzione di LV alto titolo. Un approccio step-by-step è delineato per raggiungere quasi il 100% di efficienza di trasduzione in cellule HBE primarie. Più specificamente, il protocollo descrive le condizioni di coltura ottimali strumentali per riuscire 3. In breve, le cellule 293T HEK sono trasfettate utilizzando il lentivirale pCDH vettore di espressione con il EF-1 promotore di espressione di guida di una maggiore verde fluorescenteproteine ​​(eGFP) o mCherry, una proteina fluorescente rossa, e un sistema di confezionamento di terza generazione. LV rilasciate in media sono raccolti 24-72 ore più tardi. Le particelle virali sono concentrati con polietilene glicole (PEG), un metodo conveniente e facile della concentrazione virale, prima stima titolo utilizzando un kit di p24 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Successivamente, le cellule HBE primarie indifferenziate sono trasdotti in mezzi proliferazione (terreno di crescita epiteliale bronchiale o BEGM) 8, mentre si collega (dopo essere tripsinizzati), ad una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungendo hexadimethrine bromuro e incubando per 16 ore ( durante la notte). Le cellule sono poi lasciati differenziare. Poiché il transgene è espresso virale a lungo termine (utilizzando il promotore appropriato, vedere la discussione), espressione verrà mantenuta per tutto differenziazione in un epitelio delle vie aeree pseudostratificato o può essere indotta (utilizzando un promotore inducibile) dopo la differenziazione. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Questo protocollo è di grande interesse per i ricercatori che desiderano utilizzare le cellule HBE primarie, invece di linee cellulari, e potrebbe essere adattabile ad altri difficili da trasdurre tipi di cellule.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK293T/17 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12306C</td>
			<td>use at 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11995-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>use at 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354231</td>
			<td>dilute 1:75 in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calphos</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631312</td>
			<td>Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythylene glycol 8000</td>
			<td>VWR scientific</td>
			<td>101108-210</td>
			<td>stock of 40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9528</td>
			<td>use at 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell 12mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7521</td>
			<td>dilute 1:10 in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>stock of 2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin (10.000x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>use at 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alliance HIV-1 p24 ELISA</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEK050001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD532A-2</td>
			<td>lentiviral expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2-VSVG</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>packaging DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12251</td>
			<td>packaging DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td>packaging DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells

In coltura in vitro di cellule primarie umane epiteliali bronchiali (HBE) utilizzando condizioni di interfaccia aria-liquido fornisce un modello utile per studiare i processi di differenziazione cellulare delle vie aeree e la funzione. Negli ultimi anni, l&#39;uso di vettori lentivirali per la consegna transgene diventata pratica comune. Mentre ci sono segnalazioni di trasduzione di cellule epiteliali delle vie aeree completamente differenziate con alcuni lentivirus pseudo-digitato non-HIV, l&#39;efficienza complessiva di trasduzione è di solito inferiore al 15%. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile ed efficiente per produrre lentivirus e di trasdurre cellule epiteliali bronchiali umane primarie. Usando cellule epiteliali bronchiali indifferenziate, trasduzione in terreni di crescita epiteliale bronchiale, mentre le cellule attaccano, con una molteplicità di infezione di fattore 4 fornisce efficienze vicino al 100%. Questo protocollo descrive, passo dopo passo, la preparazione e la concentrazione di vettori lentivirali alto titolo e esimoprocesso di trasduzione e. Si discute gli esperimenti che hanno determinato le condizioni di coltura ottimali per raggiungere trasduzione altamente efficienti di cellule epiteliali bronchiali umane primarie.

La figura 1 illustra diversi passaggi chiave della valutazione cellule e soluzioni durante il processo di trasfezione. Figura 1A mostra la confluenza ottimale delle cellule HEK293T prima trasfezione per produzione di virus. È importante che le cellule sono distribuiti uniformemente in tutto il piatto. Figura 1b rivela il precipitato in una goccia della miscela di trasfezione usando ottica in campo chiaro e un obiettivo 10X. Quanto più i precipitati sembrano granelli di sabbia piuttosto che agglomerati, più efficiente la trasfezione sarà. In questo quadro, il precipitato è un po &#39;grossolana. Il precipitato è un indicatore affidabile se la trasfezione produrrà un alto titolo del virus. Se uno qualsiasi degli eccipienti è mancante o di scarsa qualità (DNA vettore per esempio), agglomerati si formano, che è un segno minaccioso. Se questo è il caso, è più saggio interrompere e riavviare la procedura, assicurandosi chetutti gli ingredienti sono nel mix, e / o il controllo della qualità del DNA vettoriale e DNA confezionamento. Figura 1c mostra lo stesso piatto come A, dopo incubazione overnight. Il precipitato è (e dovrebbe essere) visibile tra cellule. Abbiamo notato che le cellule non si moltiplicano molto durante la 24 ore dopo la trasfezione. La figura 2 mostra come le cellule HBE aspetto prima e 3 giorni dopo la trasduzione. Figura 2a descrive cellule confluenti HBE primaria circa il 80% prima di tripsinizzazione e trasduzione. Un piatto 10 cm ai 80% di confluenza produce circa 4 x 10 6 cellule. Figura 2b mostra quasi il 100% trasduzione di cellule P1 HBE indifferenziate utilizzando un MOI di 4 sull&#39;inserto supporto permeabile. Quando le cellule vengono piastrate su HBE questi inserti di supporto permeabili, le cellule sono relativamente piatta. In questa immagine, l&#39;altezza delle celle è di pochi micron, che spiega perché la0,4 micron pori sono visibili anche se le cellule. La figura 3 mostra esperimenti di ottimizzazione che conducono al protocollo presentato. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato su pozzi rivestiti collagene (24-pozzetti), con 2 x 10 5 cellule HBE primarie per pozzetto. La maggior parte degli esperimenti hanno usato un MOI di 0.4 con un 2 mg / ml concentrazione finale di hexadimethrine bromidein BEGM media. cellule fluorescenti sono state contate 3 giorni dopo la trasduzione. Anche se l&#39;ottimizzazione iniziale del protocollo è stata eseguita su plastica, i risultati sono stati confermati su inserti di supporto permeabili. Inoltre, i tentativi di trasdurre cellule P1 HBE completamente differenziate non riuscire (dati non mostrati), confermando relazioni precedenti. Come si vede in figura 3a, una percentuale più elevata di cellule HBE sono trasdotto in BEGM mezzi rispetto al ALI. Se le cellule sono placcati il ​​giorno prima trasduzione in mezzi BEGM, l&#39;efficienzaè significativamente diminuita rispetto al trasduzione mentre le cellule alleghiamo (Figura 3b). Quando le cellule P1 HBE sono placcati il ​​giorno prima trasduzione in ALI mezzi (anziché BEGM), l&#39;efficienza di trasduzione diminuisce ulteriormente (dati non mostrati). La differenza tra questi 2 media è la concentrazione di calcio. BEGM supporto contiene una bassa concentrazione di calcio (0,1 mM) rispetto al ALI supporto (1 mM). Forme di calcio e mantiene giunzioni strette e, quindi, potrebbe rendere difficile per le particelle del virus di attraversare 9 e accedere ai loro recettori a livello della membrana basolaterale. Infatti, alcune infezioni sono riusciti a bassi livelli interrompendo giunzioni strette con acido tetraacetico etilenglicole (EGTA), per esempio 10. Come detto in precedenza, completamente differenziate le cellule P1 HBE sono refrattari e possono essere trasdotte solo con basse efficienze 5-7, che potrebbe essere a causa di giunzioni strette in alta calcio contenente i media. Un&#39;altra spiegazionebassa efficienza di trasduzione nelle cellule completamente differenziate è un meccanismo di trasporto mucociliare attivo dove muco potrebbe agire come barriera. Oppure, come riportato da Bals et al., La fase di differenziazione in cui le cellule sono HBE, è un fattore determinante della efficienza di trasduzione 10. Il fatto che più cellule vengono trasdotte in BEGM che in ALI multimediale supporta questa affermazione (Figura 3a). Come si vede nella figura 3b, un incremento di efficienza di trasduzione quasi il 50% è stata osservata quando le cellule sono state trasdotte mentre allegando rispetto alle cellule placcato giorno precedente. Nel loro studio, Ricks et al. Ha mostrato un aumento del 20% quando la trasduzione è stata eseguita dopo tripsinizzazione 11. Insieme, questi risultati suggeriscono che i media e lo stato di maturazione delle cellule è la chiave per il successo di trasduzione. Il pannello in figura3c, dimostra hexadimethrine bromideplaying ruolo atrivial in efficienza di trasduzione. Tuttavia, il suo uso è suggerito in questo protocollo dal momento che non ha alcun impatto negativo, ma potrebbe potenzialmente essere utile. Bromuro Hexadimethrine è un polimero cationico utilizzato in virologia per migliorare l&#39;efficienza di trasduzione 12. Altri hanno pubblicato l&#39;uso di protamina, un altro polimero cationico, ma è stata trovata alcuna differenza significativa per quanto riguarda l&#39;efficienza di trasduzione rispetto al hexadimethrine bromuro 13. Bromuro Hexadimethrine non influisce la crescita né la differenziazione 14-16. Infine, diverse MOI sono stati esaminati nella figura 3d: la più alta efficienza di trasduzione si è verificato con una MOI di 4. Non vi era alcuna differenza significativa tra MOI 0,4 e 4, invece, MOI 4 trasdotto 100% delle cellule HBE mentre MOI 0,4 trasdotte solo il 75%. Il MOI definisce quanti virus particelle will hanno il potenziale di infettare una cellula. Ci sono diversi metodi per determinare il MOI. Uno di questi è di definire il numero di unità di trasduzione (TU). Utilizzando un ELISA, la quantità di antigene p24 può essere determinato in pg / ml. p24 virale in picogrammi può essere convertito in TU, che sono necessari per calcolare il MOI. Il MOI è calcolato dividendo il numero di TU per il numero di cellule. Ci sono 10-100 unità di trasduzione (TU) per picogrammo p24. Tutti i riferimenti nel testo per quanto riguarda MOI si basano su calcoli con 100 TU per picogrammo p24. (Http://tronolab.epfl.ch/webdav/site/tronolab/shared/protocols/TUvsp24.html). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54176/54176fig1.jpg" /> Figura 1:. Trasfezione di cellule 293T HEK (a) cellule HEK 293T cresciuto al 50-60% di confluenza come visto sotto un obiettivo 10X. (B) precipitato visibile in 5 ml goccia 5 minuti dopo la miscelazione tutto reageNTS al microscopio (obiettivo 10X). (C) Precipitare nel piatto accanto alle celle, dopo trasfezione overnight (obiettivo 10X). (D) ingrandimento del centro di (c). Bianco freccia che punta a precipitare. Barra di scala = 100 micron; è lo stesso per a, b, c. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54176/54176fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54176/54176fig2.jpg" /> Figura 2: trasduzione di cellule NHBE (a) cellule HBE coltivate in un piatto rivestito di collagene I, 80-90% di confluenza (circa 4 x 10 6 cellule) in BEGM mezzi per 5 giorni (obiettivo 10X).. Barra di scala = 100 micron. (B) eGFP trasdotto cellule HBE su inserti permeabili di supporto (12 mm), 3 giorni dopo la trasduzione (confocale, 20X). In questo stato, cel HBE<html> ls sono piatte e pori della membrana sono visibili. Scala bar = 100 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54176/54176fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54176/54176fig3.jpg" /> Figura 3: Ottimizzazione del protocollo di trasduzione (a) impatto dei media sulla efficienza di trasduzione.. (B) Confronto di trasduzione nelle cellule HBE placcato il giorno prima e la trasduzione delle cellule mentre si collega. (C) Influenza della hexadimethrine bromuro di sull&#39;efficienza trasduzione. (D) valutazione del miglioramento delle efficienze di trasduzione che utilizzano differenti MOI. L&#39;analisi è stata effettuata utilizzando il test t di Student o di Kruskal-Wallis e Dunn test di confronto multiplo. Le barre di errore rappresentano SE e tutti * rappresentano p &lt;0.05.ww.jove.com/files/ftp_upload/54176/54176fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell&#39;uomo epiteliali bronchiali

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

optimal-lentivirus-production-cell-culture-conditions-necessary-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K Views.  University of Miami, Miller School of Medicine. Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Video: Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Le cellule umane ES: Cultura partire da cellule congelate

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Ricerca

Biologia

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

Lentivirus Produzione

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Cultura Vivo di cellule primarie umane tube di Falloppio epiteliale

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Colture primarie di cellule corticosurrenali ratto e saggi di Steroidogenic funzioni

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

Modello alveolare umano multicellulare composto da cellule epiteliali e cellule immunitarie primarie per la valutazione del pericolo

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...