This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&amp;D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

In questo studio, i topi sono stati mantenuti in una specifica struttura priva di agenti patogeni della Yonsei Laboratory Animal Research Center della Yonsei University. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida Korean Food and Drug Administration utilizzando protocolli approvati dal Comitato Internazionale cura degli animali e uso del centro Animal Research Laboratory presso Yonsei Yonsei University. 1. preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare 2% RPMI mezzi diluendo siero bovino fetale (FBS) al 2% e la penicillina-streptomicina al 1% in RPMI </li><li> Preparare i media RPMI completo. Per RPMI media aggiungi 10% di FBS, 1% di penicillina-streptomicina, 1% di L-glutammina e 50 mM 2-mercaptoetanolo. </li><li> Preparare la fluorescenza attivato l&#39;ordinamento delle cellule del buffer (FACS). Per fare in modo salina, supplemento tampone fosfato (PBS) con il 2% di FBS. </li><li> Preparare buffer di isolamento delle cellule T. Per fare ciò, integrare PBS con il 2% di FBS e 2 mm ethylenediaminetetraaL&#39;acido CETIC. </li></ol> 2. Isolamento dei linfociti della milza <ol><li> Rimuovere la milza di topi naive o LCMV CL13-infetti come descritto in precedenza 19 e metterli in x 15 mm piastre di Petri contenenti 10 ml di 2% dei media RPMI 60mm. NOTA: In questo studio esperimenti, da 5 a 6 settimane di età C57B1L / 6J topi di sesso femminile ha ricevuto 2 x 10 6 unità formanti placca (PFU) di LCMV CL13 mediante iniezione endovenosa attraverso la vena della coda. Sacrificare i topi a giorno 16 dopo l&#39;infezione (16 d pi) 25. topi ingenui Analizzare ge-abbinati erano lo stesso giorno. </li><li> Inserire un colino cella in una provetta da 50 ml e sciacquarlo con 2 ml di 2% Mezzi RPMI. Posizionare la milza sul setaccio cellulare 70 micron e macinare con lo stantuffo di una siringa. Risciacquare il filtro cella con 2 ml di 2% Mezzi RPMI e rimuoverlo dal tubo 50 ml. </li><li> Riempire il tubo con 2% Mezzi RPMI e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere ilpellet di cellule in 1 ml di tampone di lisi ACK. Incubare i campioni a temperatura ambiente (RT) per 5 min. NOTA: Il volume di ACK tampone di lisi sopra indicato è per una milza. Scalare il volume di conseguenza per i campioni di milza pool. </li><li> Riempire il tubo con 2% Mezzi RPMI e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml in mezzi RPMI completo. NOTA: Per il conteggio delle cellule vive, le cellule macchia con trypan blu e contare vivere solo cellule che non sono macchiati con emocitometro. </li></ol> 3. Fenotipizzazione di splenica convenzionale T (T conv) Cellule e cellule T reg NOTA: Prima di isolamento delle cellule T reg, esaminare il fenotipo dei linfociti splenici isolati da topi naive o infetti colorando le cellule con diversi anticorpi e analizzandoli mediante citometria a flusso. <ol><li> Trasferire 50 ml di cellule(5 x 10 5 cellule) rispetto al totale dei linfociti splenici in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti u-basso e aggiungere 150 ml di tampone FACS per pozzetto. Centrifugare a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante. Agitare il pellet di cellule e aggiungere 200 ml di tampone FACS per pozzetto. Centrifugare a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C (2 volte). </li><li> Preparare il cocktail di anticorpi per marcatori di superficie delle cellule di colorazione in 50 ml di tampone FACS per bene con i seguenti anticorpi e reagenti. colorante anti-CD4 viola, colorante verde anti-CD25, anti-PD-1 dye viola, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 tintura e la vitalità delle cellule di rilevamento reattivo nel vicino infrarosso (IR) colorante reattivo fluorescente. NOTA: Per analizzare ulteriormente il fenotipo delle cellule T attivate reg, anti-CD103 23,25 può essere aggiunto per cellulare di superficie-marcatore colorazione. </li><li> Risospendere il pellet di cellule con 50 ml di anticorpi cocktail per pozzetto. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C. Lavare le cellule due volte conFACS tampone per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, decantare il surnatante e fissare le cellule per 20 minuti al buio a 4 ° C con 100 pl di tampone di fissaggio preparati secondo il protocollo del produttore. </li><li> Lavare le cellule due volte con il tampone di lavaggio permeabilizzazione (preparato secondo il protocollo del produttore) mediante centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpi per intracellulare colorazione Foxp3, e risospendere il pellet cellulare con 50 ml di soluzione di anticorpi anti-Foxp3. NOTA: Per analizzare ulteriormente i fenotipi di conv T e le cellule T reg, anti-CTLA può essere aggiunto in questa fase. </li><li> Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C e ripetere il passo 3.6. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 200 ml di buffer di FACS ed esaminare il fenotipo delle cellule da citofluorimetro 25. </li><li> Porta il popula cellule vivezione. Per analizzare i fenotipi di cellule T conv durante l&#39;infezione LCMV CL13, esaminare la frequenza di Foxp3 - PD-1 + cellule tra le cellule CD4 + o CD8 +. NOTA: Sulla base dei risultati sperimentali, la percentuale di Foxp3 - PD-1 + è superiore al 50% in popolazioni di cellule CD4 + e CD8 + a 16 d pi con LCMV CL13. <ol><li> Per analizzare la frequenza e fenotipi di cellule T reg, esaminare le frequenze di Foxp3 + o Foxp3 + PD-1 + cellule tra cellule T CD4 +. NOTA: Sulla base dei risultati sperimentali, la percentuale di Foxp3 + o + PD-1 + cellule Foxp3 è superiore al 20% della popolazione di cellule T CD4 +, rispettivamente. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento dei CD25 + T CD4 + Cellule reg NOTA: I volumi di tutti i reagenti indicati di seguito sono per unpartendo numero di cellule di 1 x 10 7 splenociti totali. <ol><li> Preparare le cellule come descritto nella sezione 2 utilizzando topi con infezione cronica ingenui e LCMV. Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 10 ml di tampone isolamento delle cellule T. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente e risospendere il pellet cellulare in 40 ml di tampone. </li><li> Per l&#39;arricchimento delle cellule CD4 + T utilizzando il sistema di separazione cellulare magnetica, aggiungere 10 ml di cocktail di biotina-anticorpo e mescolare bene. Incubare per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 30 ml di tampone, 20 ml di anti-biotina microsfere per l&#39;etichettatura di cellule non-CD4 + T e 10 ml di anticorpi CD25-PE per l&#39;etichettatura fluorescente di cellule CD25 +. Mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone e superare le cellule attraverso un filtro 40 micron cella in un nuovo tubo 50 ml per rimuovere i detriti cellulari. Lavare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C.Eliminare il surnatante completamente e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di buffer ad una densità massima di 1,25 x 10 8 cellule. </li><li> Applicare le celle nella colonna e raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso la colonna. Lavare la colonna con l&#39;aggiunta di 2 ml di tampone e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente e sospendere nuovamente le cellule T CD4 + isolate in 90 ml di tampone. </li><li> Per l&#39;etichettatura magnetica di cellule CD25 +, aggiungere 10 ml di microsfere anti-PE, mescolare bene, e incubare per 15 minuti al buio a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone e lavare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone ad una densità di fino a 1 x 10 8 cellule. </li><li> Per arricchire le cellule reg CD25 + T CD4 +, applicare le cellule nella colonna di selezione positiva, e lavare la Column aggiungendo 2 ml di tampone. Ripetere il lavaggio tre volte. </li><li> Quando la colonna è vuota, dopo la fase di lavaggio finale, aggiungere 1 ml di tampone sulla colonna, e stanare il magneticamente etichettato CD4 + CD25 + cellule usando lo stantuffo. </li><li> Ripetere i passaggi 4,8-4,9 per migliorare la purezza delle cellule isolate reg CD4 + T + CD25. Lavare le cellule con tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule isolate reg CD4 + T + CD25 ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml in mezzi RPMI completo. </li><li> Per controllare la purezza delle cellule T reg isolato-CD4 + CD25 +, utilizzare 2 x 10 5 cellule dal totale cellule reg isolato-CD4 + CD25 + T. Colorare le cellule con 50 ml di tampone FACS contenente anti-CD4 FITC e la vitalità delle cellule rilevamento reattivo vicino infrarosso colorante reattivo fluorescente. NOTA: CD25 è stato già etichettato con PE durante l&#39;isolamento. </li><li> Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C. Lavare le cellule con tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Dopo il lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 100 ml di buffer di FACS e verificare la purezza mediante citometria di flusso. </li><li> Porta la popolazione live-cell. Per analizzare la purezza delle cellule T reg, confermare la percentuale di cellule CD4 + CD25 +. NOTA: Sulla base dei risultati sperimentali, la percentuale di cellule CD4 + CD25 + tra le cellule purificate è superiore a circa 80%. </li></ol> 5. L&#39;isolamento di cellule T CD8 + e l&#39;etichettatura delle cellule T CD8 + NOTA: I volumi di tutti i reagenti indicati di seguito sono per un numero di cellule di partenza di 1 x 10 7 splenociti totali. <ol><li> Preparare le cellule come descritto nella sezione 2 utilizzando topi naive. Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 10 ml di isolamento delle cellule T appassionatoER. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente, e risospendere il pellet cellulare in 40 ml di tampone. </li><li> Per l&#39;isolamento delle cellule T CD8 + utilizzando il sistema di separazione cellulare magnetica, aggiungere 10 ml di cocktail di biotina-anticorpo per l&#39;etichettatura delle cellule + T CD8 non e mescolare bene. Incubare per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 30 ml di tampone e 20 ml di microsfere anti-biotina. Mescolare bene e incubare per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Applicare le celle nella colonna e raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso la colonna. Lavare la colonna aggiungendo 2 ml di tampone per tre volte. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante completamente e risospendere le cellule isolate + T CD8 in 2 ml di tampone. </li><li> Per verificare la purezza delle cellule isolate, preparare 50 ml di soluzione di anticorpo in tampone FACS. Risospendere le 2 x 10 5 cellule tra isolato T CD8 + cells in 50 ml di soluzione di anticorpi. NOTA: Per preparare la soluzione di anticorpi, aggiungere l&#39;anti-CD8 FITC, e la rilevazione vitalità cellulare reagente (vicino infrarosso colorante fluorescente reattiva) nel buffer FACS. </li><li> Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C. Lavare le cellule con tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Dopo il lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 100 ml di tampone FACS, e verificare la purezza delle cellule mediante citometria di flusso. </li><li> Porta la popolazione live-cell. Per controllare la purezza delle cellule T CD8 +, confermare la percentuale di cellule T CD8 +. NOTA: Sulla base dei risultati sperimentali, la percentuale di cellule CD8 + tra le cellule purificate è superiore a circa il 90%. </li><li> Aggiungere PBS le cellule isolate T CD8 +. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule T CD8 + isolati ad una concentrazione di 1 x 10 7 cellule / ml in PBS. </li><li> Per etichettare ce T CD8 +lls per il saggio di soppressione in vitro, diluire proliferazione cellulare colorante inseguimento violetto in PBS per ottenere una concentrazione di 5 mM a RT. NOTA: Le approssimate eccitazione ed emissione picchi del colorante inseguimento viola proliferazione cellulare utilizzato nello studio sono 405 e 450 nm, rispettivamente. </li><li> Mescolare bene volumi uguali di proliferazione cellulare colorante inseguimento viola (5 mM) e sospensione cellulare (1 x 10 7 cellule / ml di cellule CD8 + T) in una provetta da 15 ml, e incubare a 20 min a 37 ° C. Agitare il tubo ogni 10 min. </li><li> Riempire il tubo con freddo multimediale completo RPMI, e lasciare la provetta per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. Eliminare il surnatante completamente, e risospendere le cellule ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml con mezzi RPMI completo pre-riscaldato. Incubare le cellule per 15 minuti a RT. </li></ol> 6. Impostazione del test in vitro soppressione Utilizzando CD4 + CD25 + T &lt;sub&gt; reg e cellule T CD8 + <ol><li> Per preparare anti-CD3 / CD28 perle rivestite, trasferire il volume appropriato di sfere magnetiche ad un 15 ml di tubo (2,5 ml / 1 x 10 5 cellule). Aggiungere un volume uguale di PBS e mescolare. Lavare per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Diluire le sfere magnetiche in completa media (50 pl / pozzetto). </li><li> Aliquota 50 ml di cellule reg T CD4 + CD25 + per pozzetto della piastra da 96 pozzetti u-basso (1 x 10 5 cellule / pozzetto). Aggiungere 50 ml di cellule T CD8 + T come responder (resp T) cellule per pozzetto (1 x 10 5 cellule / pozzetto). Aggiungere 50 ml di anti-CD3 / CD28 perle rivestite diluito in ogni pozzetto. NOTA: In questa fase, l&#39;etichetta e impostare pozzetti di controllo come segue: &quot;non stimolata linfociti T CD8 + solo&quot; senza anti-CD3 / CD28 perle rivestite; &quot;Solo linfociti T CD8 +&quot; con anti-CD3 / CD28 perle rivestite; Solo &quot;delle cellule T CD8 +&quot;Con anti-CD3 / perline CD28 rivestite;&quot;. T cellule reg solo &quot;con anti-CD3 / perline CD28 rivestite cellule reg T possono essere diluiti dai media complete e co-coltura con cellule T resp in un diverso rapporto tra T cellule resp: cellule T REG (1: 0,25-1: 1). </li><li> Aggiungere 50 ml o il volume appropriato di supporto in tutti i pozzetti a volume totale di 200 ml. Coprire la piastra con un foglio e incubare in un incubatore CO 2 a 37 ° C per 72 ore. </li></ol> 7. Analisi di CD8 + T Cell Proliferation e produzione di citochine da cellule T CD8 + <ol><li> Per l&#39;analisi produzione di citochine, dopo 3 giorni di coltura, separare il surnatante di ogni bene in un altro piatto e di eseguire test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). NOTA: Il supernatante può essere aliquotati e conservati a -70 ° C. In questo esperimento, la piastra rivestita di anticorpo anti-topo IFN-γ è stato utilizzato per rilevare IFN-γ accordo di produzionezione al protocollo del produttore s. Per determinare la produzione di IFN-γ delle cellule proliferanti T CD8 + su un unico livello cellulare, intracellulare di citochine colorazione può essere eseguita. </li><li> Dopo aver separato il surnatante da ogni pozzetto, lavare la piastra contenente le cellule con tampone FACS e centrifugare a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C (3 volte). </li><li> Dopo il lavaggio, scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule con 50 ml di cocktail di anticorpi per la colorazione delle cellule T CD8 + proliferato. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C. NOTA: Per preparare cocktail di anticorpi, aggiungere l&#39;anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5, e il reagente di rilevamento vitalità cellulare (vicino infrarosso colorante fluorescente reattiva) nel buffer FACS. NOTA: anticorpi contro vari marcatori quali CD44 o CD69 possono essere combinati con altri anticorpi per confermare l&#39;attivazione delle cellule T CD8 +. Ricordate che le cellule T CD8 + sono già stati etichettati con la proliferazione cellulare di monitoraggio vtintura iolet a Passo 5.10. </li><li> Lavare due volte per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, scartare il surnatante, e fissare le cellule per 20 minuti al buio a 4 ° C con 100 pl di tampone di fissaggio. </li><li> Lavare due volte per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule con 200 microlitri di tampone FACS e misurare la proliferazione delle cellule T CD8 + dye-marcato inseguimento viola proliferazione cellulare mediante citometria di flusso. <ol><li> Porta la popolazione di cellule T CD8 + tra le cellule vive. Misurare le percentuali di cellule divise e indivise seconda della diluizione della proliferazione cellulare colorante inseguimento violetta e diluizione cellule T CD8 + secondo la seguente equazione. % Di inibizione = [(% di cellule T CD8 + proliferavano in assenza di cellule T reg -% di cellule T CD8 + proliferato in presenza di cellule T reg) / (% di cellule T CD8 + proliferavano inl&#39;assenza di cellule T reg)] x 100. Ulteriori analizzare i dati utilizzando il software di citometria a flusso 25. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+(CD25).+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases.">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li><li>Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+LAG-3+in+regulatory+T+cells.">Role of LAG-3 in regulatory T cells.</a> Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).</li><li>McHugh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)+immunoregulatory+T+cells:+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor.">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+constitutively+expressing+cytotoxic+T+lymphocyte-associated+antigen+4.">Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4.</a> J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).</li><li>Manigold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+CD4+CD25++T+cells+control+virus-specific+memory+T+cells+in+chimpanzees+that+recovered+from+hepatitis.">Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis.</a> C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+regulatory+T+cells+in+lymphoid+tissue+is+correlated+with+viral+load+in+HIV-infected+patients.">The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients.</a> J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)+regulatory+T+cells+suppress+Mycobacterium+tuberculosis+immunity+in+patients+with+active+disease.">CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease.</a> Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).</li><li>Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-specific+regulatory+T+cells+delay+the+arrival+of+effector+T+cells+in+the+lung+during+early+tuberculosis.">Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis.</a> J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).</li><li>Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++regulatory+T+cells+control+Leishmania+major+persistence+and+immunity.">CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity.</a> Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).</li><li>Grainger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helminth+secretions+induce+de+novo+T+cell+Foxp3+expression+and+regulatory+function+through+the+TGF-beta+pathway.">Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway.</a> J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).</li><li>Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cells+in+helminth+infection:+the+regulators+and+the+regulated.">cells in helminth infection: the regulators and the regulated.</a> Trends Immunol. 33 (4), 181-189 (2012).</li><li>You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regulatory+T+cells+potently+abrogate+antitumor+immunity.">Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity.</a> J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).</li><li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival.">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li><li>Dittmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impairment+of+CD8(+)+T+cells+by+regulatory+T+cells+during+persistent+retroviral+infection.">Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection.</a> Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).</li><li>Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+suppression+of+CD8++T+cell+function+by+Friend+virus-induced+regulatory+T+cells.">In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells.</a> J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).</li><li>Iwashiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+by+CD4++regulatory+T+cells+induced+by+chronic+retroviral+infection.">Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).</li><li>Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++T+cells+regulate+virus-specific+primary+and+memory+CD8++T+cell+responses.">CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses.</a> J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).</li><li>Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++regulatory+T+cells+control+the+severity+of+viral+immunoinflammatory+lesions.">CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions.</a> J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).</li><li>Veiga-Parga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+regulatory+T+cells+during+viral-induced+inflammatory+lesions.">On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions.</a> J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+CD8++T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).</li><li>Jin, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+Tim-3+and+PD-1+in+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).</li><li>Punkosdy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T-cell+expansion+during+chronic+viral+infection+is+dependent+on+endogenous+retroviral+superantigens.">Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).</li><li>Blackburn, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coregulation+of+CD8++T+cell+exhaustion+by+multiple+inhibitory+receptors+during+chronic+viral+infection.">Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection.</a> Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).</li><li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+upregulated+on+regulatory+T+cells+during+chronic+virus+infection+enhances+the+suppression+of+CD8++T+cell+immune+response+via+the+interaction+with+PD-L1+expressed+on+CD8++T+cells.">PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells.</a> J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).</li><li>Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+chronic+viral+infection.">Redefining chronic viral infection.</a> Cell. 138 (1), 30-50 (2009).</li><li>Penaloza-MacMaster, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+regulatory+T+cells+and+PD-1+in+modulating+T+cell+exhaustion+and+viral+control+during+chronic+LCMV+infection.">Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection.</a> J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Peli1+negatively+regulates+T+cell+activation+and+prevents+autoimmunity.">The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity.</a> Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+infection+with+respiratory+syncytial+virus+impairs+regulatory+T+cell+function+and+increases+susceptibility+to+allergic+asthma.">Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma.</a> Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).</li><li>Tai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+of+CTLA-4+function+in+regulatory+and+conventional+CD4(+)+T+cells.">Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells.</a> Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).</li><li>Rushbrook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+in+vitro+proliferation+of+virus-specific+CD8++T+cells+during+persistent+hepatitis+C+virus+infection.">Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).</li><li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+orphan+receptor+Nr4a2+induces+Foxp3+and+regulates+differentiation+of+CD4.">The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4.</a> T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).</li><li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li><li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets.">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li><li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4(+)CD25(high)Foxp3(+)+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites.">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3++regulatory+T+cells.">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li><li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5++natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection.">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li></ol>

S.-J.H. has a patent and receives patent royalties related to the PD-1 pathway. The other authors have no financial conflicts of interest.

Anche se solo un piccolo numero di cellule T reg esiste nei topi e nell&#39;uomo, è importante capire la loro funzione come giocano un ruolo cruciale nella regolazione della risposta immunitaria e mantenimento della tolleranza immunitaria. Le funzioni di numeri e soppressive di T reg cellule aumenta nel corso di una infezione da virus cronica 15-20 così come la progressione del cancro 13,14. Questo è probabilmente dovuto alla stimolazione antigenica continua. Per valutare l&#39;cellule T reg funzionano sotto antigene persistenza e lo sviluppo della malattia, la loro attività soppressiva deve essere misurato. Qui, descriviamo un protocollo per analizzare la ex vivo fenotipo delle cellule T reg e misurare la loro attività soppressiva utilizzando un sistema in vitro di co-coltura di cellule T CD8 + e cellule T reg. Passaggi critici nel protocollo corrente sono l&#39;analisi e l&#39;isolamento di cellule T reg. Live e fresco isolato T <sub&gt; cellule reg mostrano l&#39;attività soppressiva chiaro in vitro. Abbiamo anche esaminato i fenotipi di T conv e le cellule T reg nel corso di una infezione da virus cronica. Cellule conv T, cioè, Foxp3 - cellule CD4 + e CD8 + hanno mostrato una diminuzione in attività cellulare dopo l&#39;infezione cronica da virus (Figura 1). L&#39;espressione PD-1 è stato upregulated in entrambe le popolazioni di cellule T conv. Aumento del numero di cellule T reg e up-regolazione di PD-1 sono le caratteristiche di risposta immune nel corso di una infezione da virus cronica. Inoltre, anti-corpi di altri recettori inibitori come TIM-3 e CTLA-4 possono essere utilizzati in combinazione con PD-1 per esaminare il fenotipo delle cellule T mediante FACS dopo l&#39;infezione del virus corale. Per studiare l&#39;attività soppressiva, cellule T e cellule resp reg T sono state co-coltivate con un rapporto di 1 a 1. Co-coltura con T regle cellule di topi con infezione cronica significativamente ridotta proliferazione delle cellule T CD8 + e la secrezione di IFN-γ rispetto alle cellule T reg da topi naive. Ciò implica che la proliferazione e produzione di citochine di cellule T CD8 + co-coltura con cellule T reg sono inversamente proporzionali alla funzione soppressiva delle cellule T reg. Anche se questo protocollo raccomanda l&#39;uso di un sistema di separazione cellulare magnetica per l&#39;isolamento delle cellule T reg, la contaminazione con cellule reg non-T non può essere esclusa. Le cellule T reg ottenute da topi reporter Foxp3-GFP 28-30 sono candidati migliori per indagare accuratamente la funzione delle cellule T reg rispetto al sistema di separazione cellulare magnetica, come CD25 è spesso overexpressed sulle cellule T reg T CD4 + conv e attivati. La funzione soppressiva delle cellule T reg è stato valutato da vari in vitrotest di soppressione 16,28,31-34. Il vantaggio del test di soppressione in vitro è che valuta l&#39;effetto diretto di cellule T reg sulla inibizione della risposta delle cellule T CD8 +, perché solo le cellule T sono resp co-coltura con cellule T reg. Oltre alle cellule T CD8 +, il CD25 - cellule T CD4 + può essere usato al posto di cellule T Resp 25. Gli effetti di reg T o cellule T conv sulle cellule immunitarie come le cellule dendritiche e cellule natural killer possono essere valutate variando le condizioni sperimentali. Molecole come il CD103 35, GAL-3 36, glicoproteina A ripetizioni predominante 37, CD43 38, CD11a 38, o cellule killer lectina-like receptor sottofamiglia membro G 1 38 sono stati utilizzati come marcatori di cellule reg T attivate in malattie specifiche. In questo protocollo, abbiamo usato PD-1 comeIndicatore di identificare attiva le cellule T reg durante l&#39;infezione cronica da virus. Questo protocollo può essere utilizzato per le analisi poliedriche (fenotipici e funzionali) delle cellule T reg in condizioni specifiche.

T regolatorie (T reg) cellule esprimono scatola forkhead P3 (Foxp3) come un fattore di trascrizione per il loro sviluppo e la funzione 1. Inoltre, le cellule reg T esprimono varie altre molecole come CD25 2, gene linfociti-attivazione 3 (GAL-3) 3, indotta da glucocorticoidi tumor necrosis factor receptor 4, e linfociti T citotossici-proteina associata 4 (CTLA-4) 5 sulla loro superficie o regione intracellulare. Durante l&#39;infezione cronica con vari tipi di agenti patogeni come virus, batteri 6,7 8,9 e parassiti 10-12, o in corso di sviluppo del cancro 13,14, le cellule T reg si differenziano in cellule attivate, visualizzando la funzione soppressiva migliorata cellule effettrici mira CD4 + e CD8 + T. Un certo numero di documenti hanno suggerito che le cellule T espanse reg e attivati ​​contribuiscono ai deteriorate respons cellule CD8 + Te durante amico retrovirus (FV) l&#39;infezione 15-17. Le cellule T reg FV-indotte inibiscono IFN-γ o l&#39;espressione granzima B e reattività citotossica delle cellule T CD8 + 15-17. Inoltre, in un modello di infezione da virus herpes simplex, è stato riferito che la deplezione delle cellule reg T CD4 + CD25 + provocato l&#39;espansione di cellule T CD8 + specifiche per virus e gravi danni ai tessuti da infiltrazione di cellule T CD4 + immunopatogenici 18-20. Topi infettati cronicamente con il clone 13 ceppo di virus Coriomeningite linfocitaria (LCMV CL13) 21-24 sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare il fenotipo e la funzione delle cellule T effettrici (T FEP) e le cellule T reg durante l&#39;infezione cronica da virus. Durante l&#39;infezione LCMV persistente, specifico per il virus T cellule eff perdono progressivamente la loro funzione effettrici e diventano esaurite le cellule T (T exh). D&#39;altra parte, Tcellule reg rafforzano la loro capacità di sopprimere la risposta delle cellule specifiche del virus T 25. La diminuzione della capacità di funzionamento delle cellule eff T può essere spiegato da diversi fattori quali upregulation dei recettori inibitori su cellule eff T, alterata funzione delle cellule presentanti l&#39;antigene, la produzione di citochine immunomodulanti, e aumento della frequenza o migliorata funzione di T reg cellule 26. Tra i fattori coinvolti nella soppressione delle cellule T, morte cellulare programmata proteina-1 (PD-1) esprimente cellule EXH T e le cellule T reg sono stati ampiamente considerati come i tratti distintivi di antigene persistenza e l&#39;ambiente soppressivo. Recentemente, è stato riferito che il blocco della via PD-1 e l&#39;ablazione delle cellule T reg portare ad una maggiore funzione delle cellule T e una diminuzione del carico virale durante LCMV infezione cronica 27. Inoltre, le cellule T reg vengono attivate durante l&#39;infezione cronica di topi con LCMV 23,25 </sup&gt; e la loro funzione soppressiva è rafforzata 25. PD-1 è altamente espresso sulle cellule T reg così come le cellule T EXH, e il livello di PD-1 espressa dalle cellule T reg correla con la forza della loro funzione soppressiva di inibire la proliferazione delle cellule T 25. Qui, descriviamo un metodo per confrontare le caratteristiche delle cellule T attivate reg isolati da topi infettati con LCMV CL13 e le cellule reg riposo T isolate da topi naive. Inoltre, si spiega una serie di processi per separare le cellule T attivate reg ed esaminare la loro ex vivo fenotipo, nonché misurare la loro attività soppressiva in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td style="width:67px;">RM4-5</td>
			<td style="width:173px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">553047</td>
			<td style="width:249px;">Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytofix/Cytoperm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation buffer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">554655</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Rat Anti-Mouse CD25</td>
			<td>7D4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553072</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 70mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td>Use this strainer for grinding the whole spleen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 40mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td>Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)</td>
			<td>29F.1A12</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135217</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td>
			<td>RM4-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">100547</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC Anti-Mouse/Rat Foxp3&#160;</td>
			<td>FJK-16s</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5773</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td></td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>53-6.7</td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>45-0081</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-gamma Platinum ELISA</td>
			<td></td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>BMS606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine, 200mM solution</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td></td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-34975</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-091-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LD columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Use this column for Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LS columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30919.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Canto II flowcytometer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer*</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software&#8224;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematocytomer</td>
			<td></td>
			<td>Marienfeld superior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic and functional analysis of activated regulatory t cells isolated from chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice

Regolamentazione delle cellule T (T reg), che esprimono Foxp3 come un fattore di trascrizione, sono sottoinsiemi di cellule T CD4 +. Le cellule T reg svolgono un ruolo cruciale nella tolleranza immunitaria e manutenzione omeostasi dalla regolazione della risposta immunitaria. Il ruolo primario delle cellule T reg è di sopprimere la proliferazione delle cellule T effettrici (T eff) e la produzione di citochine, quali IFN-γ, TNF-α e IL-2. È stato dimostrato che la capacità delle cellule T reg di inibire la funzione delle cellule T eff è migliorata durante l&#39;infezione patogeno persistente e lo sviluppo del cancro. Per chiarire la funzione delle cellule T reg in condizioni di riposo o infiammate, una varietà di saggi in vitro soppressione utilizzando cellule reg topo o T umana sono stati ideati. L&#39;obiettivo principale di questo studio è quello di sviluppare un metodo per confrontare le differenze di fenotipo e la funzione soppressiva tra riposo e reg T attivatecellule. Per isolare le cellule T attivate reg, i topi sono stati infettati con il virus linfocitica choriomeningitis (LCMV) clone 13 (CL13), un ceppo cronica di LCMV. Le cellule T reg isolate dalla milza di topi LCMV CL13-infettati esposti sia il fenotipo attivato e l&#39;attività soppressiva maggiore rispetto a riposo cellule T reg isolate da topi naive. Qui, descriviamo il protocollo di base per l&#39;analisi ex vivo fenotipo di distinguere le cellule T attivate reg dal riposo cellule T reg. Inoltre, si descrive un protocollo per la misurazione dell&#39;attività soppressiva di cellule T reg pienamente attivato.

Abbiamo generato topi con infezione da virus persistente, iniettando loro con 2 x 10 6 pfu di LCMV CL13 per via endovenosa. Per studiare i cambiamenti fenotipici nelle cellule T reg e le cellule T conv durante l&#39;infezione cronica da virus, linfociti splenici ottenuti da topi naive e infetti sono state colorate con vari anticorpi e analizzati mediante citometria di flusso. A 16 anni d PI, PD-1 è stato upregulated in entrambi Foxp3 - T CD4 + conv (Figura 1A, pannello superiore) e Foxp3 - T CD8 + conv (Figura 1B, pannello superiore) cellule. La frequenza di cellule T reg + Foxp3 + CD4 era due volte maggiore nei topi LCMV CL13-infettati che nei topi naive (Figura 1A). In particolare, la maggior parte delle cellule reg Foxp3 + CD4 + T visualizzato il fenotipo attivato, esprimendo alti livelli diPD-1 in questo momento (Figura 1A). Per il saggio di soppressione in vitro, sono stati richiesti un numero considerevole di cellule T CD8 + conv e cellule reg CD4 + T + CD25. Per ottenere cellule T CD8 + dye-marcato proliferazione di monitoraggio viola 1 x 10 7 cellule, splenociti da due milze di topi naive sono stati raggruppati. Per ottenere 2 x 10 6 o 3 x 10 6 di cellule reg T CD4 + CD25 +, almeno tre milza di topi naive e LCMV CL13-infettati rispettivamente, sono stati raggruppati. Cellule T CD8 + da cellule T resp stati separati con successo senza significativa contaminazione con altre cellule immunitarie (Figura 2A). Cellule reg T potrebbero essere isolati, con una popolazione dominante di cellule T CD25 + CD4 con più di 80% di purezza (Figura 2B). Per confrontare la funzione soppressiva delle cellule T reg naive e croniche, la T reg isolata e le cellule T sono state incubate resp insieme sotto stimolazione con perline anti-CD3 / CD28 rivestite a 37 ° C per 3 giorni. % Di inibizione di + T CD8 proliferazione cellulare resp è aumentata in cellule T reg dese-dipendente modo (Figura 3A). Quando le cellule T CD8 + resp sono stati co-coltura con cellule T reg cronica in un rapporto di 1: 1, la proliferazione delle cellule T CD8 + resp erano significativamente inibito (Figura 3B). Produzione di IFN-γ da parte delle cellule T CD8 + resp erano significativamente inibita quando le cellule CD8 + T resp sono stati co-coltura con cellule T reg attivate da topi con infezione cronica piuttosto che con le cellule T reg riposo da topi ingenuo in un reg T </sub&gt; maniera dose-dipendente delle cellule (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54138/54138fig1.jpg" /> Figura 1: fenotipi di cellule CD4 + e CD8 + T nella milza di topi naive o topi LCMV CL13-infettati a 16 d pi (A) L&#39;espressione di PD-1 o CD25 in Foxp3 - T CD4 + conv e Foxp3 + CD4 + le cellule T reg. (B) L&#39;espressione di PD-1 o CD25 in Foxp3 - cellule conv T CD8 +. linfociti splenici sono state colorate con anticorpi anti-CD4, CD8, CD25, PD-1, e Foxp3. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. Pannello A è stato modificato da 25 come riferimento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54138/54138fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare</a><html> qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54138/54138fig2.jpg" /> Figura 2: Purezze di cellule resp T isolate da topi naive e le cellule T reg isolate da topi naive o LCMV CL13-infetti (a) percentuale di cellule T CD8 + dopo l&#39;isolamento.. (B) percentuale di cellule reg T CD4 + CD25-esprimendo dopo l&#39;isolamento. Ciascun quadrante in (B) è stato determinato dai livelli di espressione di CD4 e CD25. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54138/54138fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> les / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Effetto di cellule T reg attivate sulla risposta delle cellule T CD8 + (A)% di inibizione delle cellule T CD8 + co-coltura con cellule T reg in modo dose-dipendente delle cellule T reg.. (B) La proliferazione delle cellule T CD8 + co-coltura con cellule T reg in rapporto 1: 1. (C) IFN-γ produzione di cellule T CD8 + co-coltura con cellule T reg in modo dose-dipendente delle cellule T reg. La proliferazione delle cellule T CD8 + è stata misurata mediante diluizione di colorante di monitoraggio viola proliferazione delle cellule in cellule T CD8 + proliferato e la secrezione di IFN-γ è stata valutata mediante ELISA. Cellule T CD8 + dye-marcato monitoraggio viola proliferazione cellulare sono state stimolate con anti-CD3 / CD28 perle rivestite per 3 giorni in assenza o la presenza di T <scellule ub&gt; reg isolate sia da topi naive o con infezione cronica. Nel istogramma, i numeri con e senza parentesi indicano la percentuale proliferazione delle cellule T CD8 + co-coltivate con e senza cellule T reg rispettivamente. Riempito picchi grigio nell&#39;istogramma indicano proliferazione delle cellule T CD8 + co-coltura senza cellule T reg. Ogni gruppo è stato progettato in triplicato. Le barre rappresentano significare + SEM. Questa cifra è stata modificata da 25 come riferimento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54138/54138fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice at JoVE.com

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K Views.  Yonsei University. Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Video: Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

Iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con EAE cronica

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivazione di cellule T<em&gt; In Vitro</em&gt; Da cellule staminali embrionali di topo

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Determinazione del biofilm iniziazione su cellule infettate da virus da batteri e funghi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

Caratterizzazione funzionale dei macrofagi regolatori che inibiscono l&#39;immunità reattiva dell&#39;inferta

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus