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Nanyang Technological University

Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing

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10.8K Views

•

11:36 min

•

July 3rd, 2016

DOI :

10.3791/54119-v

July 3rd, 2016

•

Michael Allen Stiffler¹, Subu K Subramanian¹, Victor H Salinas¹, Rama Ranganathan¹

¹Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale delle biblioteche unico sito di saturazione di mutagenesi complete di proteine che utilizzano high-throughput sequencing. È importante sottolineare che questo approccio utilizza coppie di primer ortogonali al multiplex di costruzione di biblioteche e sequenziamento. Risultati rappresentativi utilizzando TEM-1 β-lattamasi selezionato ad un dosaggio clinicamente rilevante di ampicillina sono forniti.

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Biologia Molecolare

saturazione mutagenesi

generazione di sequenziamento di prossima

alta sequenziamento di throughput

TEM 1 beta lattamasi

la resistenza agli antibiotici

primer ortogonali

Capitoli in questo video

0:05

Title

0:43

Synthesis of NNS Sub-libraries for Each Amino Acid Position by Two-step PCR Site-directed Mutagenesis

1:53

Cloning of NNS Sub-libraries into Selection Vectors

3:47

Selection of the TEM-1 Whole-Protein Saturation Mutagenesis Library for Antibiotic Resistance

5:51

High Throughput Sequencing to Determine Fitness Effects of Mutations

8:44

Results: High Throughput Sequencing from Whole-Protein Saturation Mutagenesis

10:16

Conclusion

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