Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di Genetica, Sviluppo e Biologia Cellulare e Iowa State University e dal NIH concedere EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner fornito commenti sul manoscritto.

Tutte le procedure di animali erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Health e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali alla Iowa State University e l&#39;Università del Maryland. 1. TALEN design <ol><li> Ingresso desiderato sequenza bersaglio di un sito web di progettazione TALEN. (Per esempio: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Ingresso scelto lunghezze degli array distanziale / ripetizione. <ol><li> Copiare la sequenza genomica nella casella &quot;Sequenza&quot;. </li><li> All&#39;interno della scheda &quot;Fornire personalizzato Spacer / RVD Lunghezze&quot; selezionare la lunghezza dello spaziatore e la lunghezza dell&#39;array. Nota: lunghezze Spacer di 15 paia di basi e ripetere le lunghezze degli array di 15-17 lavoro bene e fare il montaggio meno complessa. </li></ol></li><li> Selezionare una coppia TALEN. coppie Talen progettati intorno a un sito di enzima di restrizione unico permettono di genotipizzazione da enzima di restrizione digerireun prodotto di PCR. </li><li> Primer design per amplificare la regione genomica che circonda il sito di destinazione TALEN utilizzando un sito come Primer3 30-32. Quando la genotipizzazione con un enzima di restrizione, primer design per amplificare una regione che contiene il sito enzima di restrizione sola volta. Si raccomanda che questa regione è amplificato e sequenziato prima TALEN costruzione per identificare eventuali polimorfismi presenti in A. mexicanus popolazione laboratorio da utilizzare per microiniezione. </li></ol> 2. Montaggio TALEN (Modificata dal protocollo TALEN Kit) 33,34 Per ulteriori dettagli e la risoluzione dei problemi, consultare il protocollo 34. <ol><li> Preparare e la sequenza plasmidi necessari dal kit TALEN secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Impostare il # 1 Reazioni per reazioni A e B. Includere ripetere variabile diresidues (RVDS) 1-10 e la destinazione di pFUS_A vettore in reazione A. Includere RVDS 11- (N-1) e THe destinazione vettoriale pFUS_B (N-1) Reaction B dove N è il numero totale di RVDS in TALEN. <ol><li> Aggiungere a ciascuna reazione: 1 pl di ciascun plasmide contenente ciascuna RVD (100 ng / ml), il vettore di destinazione (100 ng / ml), 1 ml Bsa I restriction enzyme, 1 ml Bovine Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ml ligasi, 2 microlitri di tampone 10x ligasi e x microlitri di acqua, per un volume totale di 20 microlitri. Ad esempio, vedi Tabella 1. Nota: reazioni metà può anche essere usato. </li><li> Posizionare reazioni in un termociclatore ed eseguire il ciclo: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Incubare le reazioni con nucleasi. Per ogni reazione aggiungere 1 ml di 25 mM ATP e 1 ml nucleasi. Incubare le reazioni a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Trasforma reazioni. <ol><li> Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti. Nota: Homemade c competenteells possono essere utilizzati. Tuttavia, le cellule con bassa competenza può risultare in mancanza di colonie. <ol><li> Mescolare 2,5 ml di reazione con 25 ml di cellule chimicamente competenti. Incubare in ghiaccio per cinque minuti. Incubare le cellule per 30 secondi a 42 ° C. </li><li> Posizionare i tubi in ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 125 ml di brodo di Super ottimale con la repressione Cataboliti (SOC). Agitare le provette a 37 ° C per 1 ora. </li></ol></li><li> Piatto 100 microlitri di cellule trasformate su piastre LB con spectinomicina (50 ug / ml), X-gal e isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Grow O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Scegliere 2-3 colonie bianche per ogni reazione e verificare da colonia PCR usando primer pCR8_F1 e pCR8_R1 (Tabella 2). <ol><li> Fare un master mix dei reagenti. Ad esempio, vedere la tabella 3. </li><li> Scegli una colonia e spalmare sul fondo di un tubo di PCR, e poi mettere i resti della colonia in 2 ml LB con spectinomicina(50 mg / ml). Posizionare 15 microlitri della master mix nella provetta con la colonia. </li><li> Eseguire il seguente programma PCR (Tabella 4) </li><li> Controllare la PCR (eseguire l&#39;intero volume) su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I cloni giusti avranno una banda alla dimensione prevista, nonché uno striscio e una scala di bande. Per un esempio di striscio appropriato, vedere 34,33. </li><li> Grow 2 ml culture dei cloni corrette in LB supporto O / N a 37 ° C in un incubatore agitazione. </li></ol></li><li> Miniprep i plasmidi secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Sequenza per verificare la sequenza TALEN con pCR8_F1 e pCR8_R1. Seguire i metodi descritti in precedenza 35. </li><li> Usando i cloni giusti verificati mediante sequenziamento, impostare la reazione # 2 (kit TALEN), che porrà le RVDS dei vettori A e B e la RVD finale nel vettore di destinazione. <ol><li> Preparare miscela per la reazione 2 (Tabella 5). Nota: Hareazioni lf possono essere utilizzati. </li><li> Mettere le reazioni in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Trasforma reazioni. <ol><li> Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti. <ol><li> Mescolare 2,5 ml di reazione con 25 ml di cellule chimicamente competenti. Incubare in ghiaccio per 5 min. Heat Shock le cellule per 30 secondi a 42 ° C. </li><li> Mettere i tubi in ghiaccio. Aggiungere 125 ml di SOC. Porre i tubi in un incubatore agitazione a 37 ° C per 1 ora. </li></ol></li><li> Piatto 100 microlitri di cellule trasformate su piastre LB con ampicillina (100 ug / ml), X-gal e IPTG. Grow O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Scegliere 1-3 colonie bianche per ogni reazione e verificare da colonia PCR usando primer TAL_F1 e TAL_R2 (Tabella 2). <ol><li> Fare una soluzione della polimerasi Mastermix, acqua e primer comedescritti nella Tabella 3. Scegliere una colonia e spalmare sul fondo di un tubo di PCR, e poi mettere i resti della colonia in 2 ml LB con ampicillina (100 ug / ml). Posizionare 15 microlitri della soluzione nella provetta con la colonia. </li><li> Eseguire il programma di PCR (Tabella 6). </li><li> Controllare la PCR su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I cloni giusti avranno una sbavature e una scala di bande. Per un esempio di striscio appropriato, vedere 34,33. </li><li> Grow 2 ml culture dei cloni corrette in LB supporto O / N a 37 ° C in un incubatore agitazione. </li></ol></li><li> Miniprep i plasmidi secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Sequenza per verificare la sequenza TALEN con TAL_F1 e TAL_R2 seguendo i metodi descritti in precedenza 35. </li></ol> 3. mRNA Trascrizione di Talens <ol><li> Digest 4 mg di modello di sequenza-verificata con 2 ml Sac I per 2 ore a 37 ° C. </li&gt; <li> Eseguire 2 microlitri del plasmide Sac I digerito su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I plasmidi che sono correttamente digeriti mostreranno una singola banda. </li><li> Purificare il residuo plasmide Sac I digeriti seguendo il protocollo del kit di purificazione PCR. Lavare due volte con la soluzione di lavaggio prima di eluizione. Eluire in 30 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Seguire il protocollo standard per la produzione di T3 mRNA. <ol><li> Impostare reazioni metà con 0,5 mg di modello linearizzato (preparato in precedenza). Incubare a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di DNasi (incluso nel kit) e incubare a 37 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Purificare l&#39;mRNA, seguendo le istruzioni del produttore. Eluire in 30 acqua priva di nucleasi microlitri. </li><li> Eseguire un gel 1,5% mediante elettroforesi per controllare l&#39;mRNA. <ol><li> Pulire l&#39;apparato gel con un prodotto per eliminare la contaminazione RNasi e preparare un gel 1,2%. </li><li> Mix 1 ml di mRNA + 4 &amp;# 181; l priva di nucleasi acqua + 5 ml colorante glyoxyl carico. Incubare i campioni a 50 ° C per 30 min. Centrifugare le provette brevemente e posto sul ghiaccio prima di eseguire il gel. </li></ol></li><li> Controllare la concentrazione utilizzando un metodo di quantificazione concentrazioni di acidi nucleici e conservare l&#39;RNA in aliquote a -80 ° C. Scegli una dimensione un&#39;aliquota tale che l&#39;RNA non sia congelato / scongelato più di una volta. Nota: Le concentrazioni di 500-1000 ng / nl sono in genere ottenuti. RNA con una concentrazione inferiore può essere utilizzato fintanto che l&#39;integrità dell&#39;RNA è mantenuto (come valutato da una banda piuttosto che una macchia sul gel). </li></ol> 4. Iniettare Astianatte mexicanus embrioni con TALEN mRNA <ol><li> Preparare strumenti per l&#39;iniezione. <ol><li> Versare in piastre di iniezione versando 1,2% agarosio in acqua i pesci (acqua condizionata con bicarbonato di sodio e sale marino a pH 7,4 e conducibilità 700 mS) in una capsula di Petri. Mettere uno stampo (pezzo di plastica con le proiezioni per fare pozzi per i pesciuova) all&#39;interno del piatto. Rimuovere lo stampo quando l&#39;agarosio si è indurito e conservare a 4 ° C. Per ulteriori informazioni sullo stampo vedere 36. </li><li> Tirare aghi per l&#39;iniezione con un estrattore ago secondo le istruzioni del produttore. Nota: adeguata lunghezza dell&#39;ago è importante per preparazioni iniettabili. Aghi che sono troppo lunghi saranno troppo flessibile per iniezioni. Il protocollo per gli aghi che tirano varierà con le attrezzature utilizzate per tirare gli aghi. Un esempio di un ago appropriato è mostrato in Figura 1. Per la nostra attrezzatura, abbiamo tirare aghi che sono 5-6 cm di lunghezza, ed hanno un diametro esterno sulla punta di circa 0,011 millimetri quando rotto. Tuttavia, gli aghi devono essere calibrati (fase 4.3.4) per determinare la larghezza di apertura. Un esempio di programma per tirare gli aghi possono essere trovate nella Tabella 7. </li><li> Preparare pipette di vetro per il trasferimento di embrioni rompendo la pipetta in modo che l&#39;apertura è grande abbastanza per un uovo di passare attraverso. Fiamma fine rotto finonon è più tagliente. Nota: E &#39;importante utilizzare pipette di vetro e ciotole di vetro quando si lavora con A. uova mexicanus ed embrioni in quanto sono appiccicosi e aderirà alla plastica. </li></ol></li><li> Raccogliere 1-cell fase Uova. <ol><li> Razza A. mexicanus seguendo protocolli standard 37. Nota: Per esempio, se i pesci sono mantenuti su un 14 luce: buio ciclo 10 ed usando tempo Zeitgerber (ZT) con ZT0 come luci accese e ZT14 come luci spente, il nostro uova di pesce di superficie tra ZT15 e ZT19. momento della riproduzione esatta deve essere determinata per ogni singolo laboratorio. </li><li> Indurre la deposizione delle uova da sovralimentazione pesce per 3-4 giorni prima dell&#39;accoppiamento e l&#39;immissione di pesci in acqua dolce. Sollevare il ° C di temperatura 2. Nota: La nostra temperatura dell&#39;acqua iniziale è di circa 74 ° C. </li><li> Raccogliere uova di pesce di superficie al buio, controllando ogni 15 minuti per ottenere le uova nella fase 1 delle cellule. Centinaia di uova possono essere ottenuti da una singola coppia di pesci di superficie. </li><li> Collezionareuova in ciotole di vetro per evitare che si attacchi alle superfici di plastica e sorta per isolare gli embrioni allo stadio di 1 cella di prima dell&#39;iniezione osservando le uova sotto il microscopio e raccogliere le uova che sono una singola cella. Conservare le uova in acqua dolce sistema (serbatoio di acqua in cui sono alloggiati i pesci adulti, che è stato trattato per pH e conducibilità). </li></ol></li><li> Iniettare TALEN mRNA. <ol><li> Iniettare diverse quantità di mRNA totale (quantità uguali di ciascun TALEN in coppia) per determinare la concentrazione ottimale per l&#39;iniezione la tossicità e l&#39;efficacia variano dagli accoppiamenti TALEN. Inizia iniettando concentrazioni di mRNA totale che sono 400-800 pg. Diluire e combinare mRNA a concentrazioni desiderate per l&#39;iniezione di 1,5 nl. </li><li> Carico diluito mRNA nella parte posteriore dell&#39;ago e collegare l&#39;ago a un micro-iniettore. </li><li> Rompere l&#39;ago con pinze. </li><li> Calibrare l&#39;ago. Ad esempio, espellere 10 volte e raccogliere il calo conseguente micro capillare. Per 10 x 100 usa e getta 1.081; l, 32 millimetri micro capillare, il calo dovrebbe riempire il micro capillare a 0,5 mm per 1,5 NL / 1 iniezione. Regolare il tempo di iniezione e la pressione necessaria. </li><li> Inserire l&#39;ago nella singola cella e iniettare l&#39;mRNA. Iniettare il mRNA direttamente nella cella, non nel tuorlo. </li><li> Raccogliere embrioni iniettati in ciotole di vetro. Mantenere gli embrioni a 23-25 ​​° C. Rimuovere gli embrioni morti (gli embrioni che diventano nuvoloso e di forma irregolare) regolarmente per i primi giorni dopo l&#39;iniezione. Un numero record di embrioni morti e deformi da controllo (uninjected) e le piastre iniettato. Nota: La maggiore concentrazione di mRNA può portare ad un aumento della tossicità e la deformità / la morte degli embrioni. Così, tossicità rispetto efficienza deve essere bilanciato per determinare la migliore concentrazione di mRNA per iniettare. </li></ol></li></ol> 5. fenotipo Fondatore Pesce e valutare l&#39;efficienza TALEN <ol><li> Sacrificare embrioni in base al protocollo animali istituzionale. Nota: eutanasiaembrioni rapidamente raffreddato su ghiaccio. </li><li> Raccogliere gli embrioni in 0,8 microlitri tubi striscia PCR utilizzando una pipetta di trasferimento. Nota: La genotipizzazione può essere eseguita su singoli embrioni o gli aggregati di embrioni. </li><li> Estrarre il DNA. <ol><li> Inserire embrioni in 100 ml di idrossido di 50 mM di sodio (NaOH) e incubare a 95 ° C per 30 minuti, poi raffreddare a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1/10 del volume (10 ml) di 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Eseguire una PCR sulla regione utilizzando i primer disegnati in fase 1.3 (vedi tabelle 8 e 9 per i protocolli di esempio). Per i singoli embrioni 1 ml di DNA è sufficiente per la reazione PCR. </li><li> Digerire il prodotto di PCR risultante con l&#39;enzima di restrizione appropriato ed eseguire un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. <ol><li> Ad esempio, per la genotipizzazione del locus oculocutaneous albinism 2 (OCA2) in embrioni iniettati digerire il prodotto di PCR utilizzando l&#39;enzima di restrizione Bsr I aggiungendo 0.5 Ml di Bsr io direttamente a 12,5 ml di reazione PCR completato, incubazione a 65 ° C per 2 ore. Eseguire il digerito e il prodotto digerito su un gel. Bande resistenti enzima di restrizione (cioè, gruppi che non digeriscono) indicano che le mutazioni TALEN-indotte sono presenti (Figura 2). </li></ol></li><li> (Opzionale) Calcolare tasso di mutazione percentuale determinando la percentuale del prodotto non tagliato analizzando le immagini di gel in Fiji 38 utilizzando lo strumento di analisi di gel per calcolare il valore di intensità di ogni banda come descritto in precedenza 29. </li><li> Determinare la sequenza di alleli mutanti da TA clonazione della banda mutante resistente gel purificato l&#39;enzima di restrizione e sequenziamento cloni. <ol><li> Gel purificare l&#39;enzima di restrizione banda mutante resistente seguendo le istruzioni del produttore. TA clonare la band seguendo le istruzioni del produttore. Scegli colonie e crescere in 1,5 ml LB O / N a 37 ° C in agitazioneincubatrice. </li><li> culture Miniprep seguito le istruzioni del produttore. Invia il DNA per il sequenziamento. </li><li> Utilizzando un programma come scimmia, allineare le sequenze mutanti alla sequenza di tipo selvatico. <ol><li> Copia e incolla entrambe le sequenze in file APE. Scegliere lo strumento &quot;allineare due sequenze&quot; dal menu &quot;Strumenti&quot;. </li><li> Specificare le due sequenze di DNA utilizzando i menu a discesa. Nota: Il complemento inverso della sequenza clonata può essere necessario utilizzare a seconda della direzione della PCR è andato nel vettore di clonazione. Se le sequenze non si allineano, ripetere i passaggi selezionando la casella &quot;Rev-Com&quot; nella casella &quot;Allinea DNA&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Valutare pesce fondatore di fenotipi in fase appropriata e con metodi adeguati per il fenotipo atteso 29 (Ad esempio, la Figura 3). Metodi di fenotipizzazione saranno basate sul fenotipo atteso per il gene bersaglio dal ricercatore utilizzando il ProtoColo. </li></ol> 6. schermo per la trasmissione germinale Nota: A. mexicanus raggiungere la maturità sessuale a 4-8 mesi. <ol><li> Attraversate pesce fondatore sessualmente maturi per i pesci wild type. </li><li> Embrioni schermo o pesci adulti con metodi a passi 5.1-5.7 (figura 4). Per i pesci adulti, un pezzo della coda può essere agganciato dopo anestesia. <ol><li> Anestetizzare pesce sommergendo pesci in una soluzione di tricaine (acido 3-aminobenzoico etil estere) per ridurre lo stress durante amputazione delle pinne. In seguito fin ritaglio, permettono di recuperare il pesce in acqua dolce. Pesce recuperare rapidamente; osservare fino a che non hanno recuperato (sono il nuoto normalmente). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Grandi passi avanti sono stati compiuti negli ultimi anni verso la comprensione delle basi genetiche dell&#39;evoluzione dei tratti. Mentre sono stati identificati geni candidati sottostanti l&#39;evoluzione di un certo numero di tratti, è rimasta impegnativo per testare questi geni in vivo a causa della mancanza di trattabilità genetica di specie più interessanti evolutivamente. Qui riportiamo un metodo per la modifica del genoma in A. mexicanus, una specie utilizzate per studiare l&#39;evoluzione degli animali grotta. Mappatura genetica studia 1,21,23 e gene candidato si avvicina a 19,40 hanno identificato una serie di geni candidati per l&#39;evoluzione dei tratti sotto forma di grotta A. mexicanus. La recente pubblicazione del genoma cavefish 41 fornisce un potente strumento aggiuntivo per l&#39;identificazione di geni candidati per l&#39;evoluzione dei tratti grotta. Testare la funzione di molti di questi geni candidati richiede tecniche per ridurre l&#39;espressione genica. L&#39;unica opzione corrente per motivi di studioing ridotta espressione genica in A. mexicanus è con l&#39;uso di Morpholinos. Tuttavia, gene morfolino atterramento è transitorio, limitato a un post qualche giorno la fecondazione, e non è utile per studiare i tratti in animali adulti, come le differenze comportamentali tra grotta adulti e pesci di superficie, come la scolarizzazione 17, iperfagia 19 e l&#39;attrazione delle vibrazioni comportamento 42. Generazione di perdita di alleli funzione dei geni, come quelli che possono essere realizzati con Talens, sarà fondamentale per testare il ruolo di geni candidati per questi tratti. I metodi sono stati sviluppati per un facile montaggio di Talen coppie 33 e il protocollo dettagliato per questo metodo è disponibile 34. Questo protocollo è stato ottimizzato per l&#39;uso zebrafish da Bedell et al. 7, utilizzando un diverso vettore destinazione finale, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). Questo vettore consente la trascrizione di mRNA TALEN per l&#39;iniezione in singoli embrioni di zebrafish unicellulari.Abbiamo usato questo metodo di assemblaggio modificato, spiegato in dettaglio qui, da montare e trascrivere Talens per iniezione in A. mexicanus. Abbiamo scoperto che quando iniettato in superficie unicellulare A. embrioni mexicanus, come descritto all&#39;interno di questo protocollo, abbiamo potuto mutare A. geni mexicanus 29. Per la ricerca futura sui geni candidati non descritti in questo protocollo, le sequenze possono essere trovati nel genoma cavefish 41 e utilizzati per identificare i siti di destinazione Talen. Critical per le iniezioni di successo è di alta qualità TALEN mRNA. Pertanto, controllando la qualità dell&#39;RNA eseguendo una piccola quantità di RNA su gel prima iniezione è importante (Passo 3.6). Altre precauzioni per mantenere l&#39;integrità dell&#39;RNA, come ad esempio il congelamento aliquote per evitare disgelo congelamento (passo 3,7), e il mantenimento di condizioni di sterilità utilizzando tubi di acqua pulita e RNase-free e suggerimenti durante le iniezioni (fase 4), dovrebbero essere prese. Un passaggio fondamentale aggiuntivo per sollevare il pesce iniettato èpulizia di embrioni morti dopo l&#39;iniezione, come embrioni morti possono rapidamente compromettere la qualità dell&#39;acqua. Così, togliamo embrioni morti la mattina seguente iniezioni, e periodicamente per i prossimi giorni dopo le iniezioni per mantenere sani embrioni vivi (passo 4.3.6). TALEN mutagenesi in Astianatte mexicanus può essere altamente efficiente; Tuttavia, l&#39;efficienza varia a seconda della coppia TALEN iniettato 29. L&#39;aumento delle concentrazioni di mRNA può portare ad un aumento della tossicità e la deformità e la morte degli embrioni iniettati. Così, tossicità rispetto efficienza deve essere provato e bilanciato per determinare la concentrazione ottimale di mRNA per iniettare. Per le coppie Talen altamente efficienti, fenotipi possono essere valutate nel pesce fondatore iniettato. Ad esempio, l&#39;iniezione di Talens mira OCA2 comportato patch albini in pesci superficie 29 (Figura 3). Per gli altri tratti o geni, tuttavia, la valutazione dei fenotipi nei pesci fondatore può essere difficile a causaalla sottilmente del fenotipo o bassa efficienza della coppia TALEN iniettato. Così, per molte applicazioni sarà desiderabile generare germline mutazioni in un gene di interesse per l&#39;analisi del ruolo di un gene candidato in un animale non-mosaico. Ottenere la trasmissione germinale di mutazioni TALEN-indotte in A. mexicanus è possibile 29 (Figura 4). Così, questa tecnica può essere applicata per valutare altri geni candidati. Esistono alcune limitazioni per l&#39;esecuzione di manipolazioni genetiche in Astianatte mexicanus in questo momento. Superficie e razza cavefish al buio, a tarda notte. In un laboratorio in cui non è possibile invertire il ciclo scuro chiaro, i ricercatori devono venire in tarda notte per eseguire iniezioni, in quanto è fondamentale per iniettare immediatamente dopo la deposizione delle uova. Inoltre, è importante raccogliere embrioni dei pesci superficiali al buio, come luce interesserà riproduttiva. Altre tecniche, in particolar il CRISPR sistema / Cas (rivisto nel 43), esiste per la modifica del genoma e sarà probabilmente applicabile ad A. mexicanus. In effetti, i protocolli per la guida di montaggio RNA esistono, che sono rapidi e facili 44 e il protocollo qui riportati possono essere modificati per CRISPR / Cas iniezione. Inoltre, nuove applicazioni per l&#39;editing del genoma stanno rapidamente in fase di sviluppo, e molti di questi possono rivelarsi utili per la A. ricercatori mexicanus. Ad esempio, in zebrafish mutazioni precise sono state fatte in un gene di interesse per la co-iniezione Talens con un unico oligo filamento contenente una mutazione 7. Questa tecnica potrebbe essere utile per valutare il ruolo di alleli grotta nel generare fenotipi grotta, come ad esempio il ruolo di una mutazione missense in alcuni alleli rupestri di MC4R a differenze nel metabolismo osservate tra cavefish e la superficie del pesce 19. Talens sono stati utilizzati anche per generare alleli dei geni tramite ricombinazione omologa che esprimono i marcatori fluorescentin modelli simili al loci endogena 45. Questi metodi possono essere usati nella A. mexicanus per valutare sottoinsiemi di cellule o espressione di geni candidati. Il sistema / Cas CRISPR è stato utilizzato in zebrafish per ottenere tessuto-specifica del gene knockout 46. Queste tecniche, applicate ad A. mexicanus, potrebbe essere utile per valutare la base genetica di processi come la perdita degli occhi in cavefish. La lente svolge un ruolo fondamentale nel processo di perdita dell&#39;occhio in cavefish 47 e il sistema / Cas CRISPR tessuto-specifica potrebbe essere utilizzato per valutare il ruolo dei geni candidati per la perdita di occhio particolare nella lente rispetto ad altri tessuti dell&#39;occhio. Queste ed altre tecniche genoma modifica possono essere utilizzati in A. mexicanus in studi futuri per rispondere a domande critiche circa l&#39;evoluzione dei tratti grotta.

La comprensione delle basi genetiche dell&#39;evoluzione tratto è un obiettivo di ricerca critica di biologi evoluzionisti. Notevoli progressi sono stati fatti per identificare loci sottostanti l&#39;evoluzione dei tratti e individuare geni candidati all&#39;interno di questi loci (ad esempio 1-3). Tuttavia, funzionalmente testare il ruolo di questi geni è rimasta sfidando come molti organismi utilizzati per studiare l&#39;evoluzione dei tratti non sono attualmente geneticamente trattabili. L&#39;avvento delle tecnologie di editing genoma è notevolmente aumentato manipolabilità genetica di una vasta gamma di organismi. Trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens) e cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPRs) sono stati utilizzati per generare mutazioni nei geni mirati in una serie di organismi (ad esempio 4-11). Questi strumenti, applicati ad un sistema evolutivamente rilevanti, hanno il potenziale per rivoluzionare il modo in cui i biologi evoluzionisti studiare le basi genetiche dell&#39;evoluzione. Astianatte mexicanus è una specie di pesci che esiste in due forme:. Un fiume-dimora forma di superficie (pesce di superficie) e molteplici forme cavernicoli (cavefish) A. mexicanus cavefish si è evoluta da antenati dei pesci di superficie (recensito in 12). Le popolazioni di cavefish hanno sviluppato un certo numero di caratteristiche tra cui la perdita degli occhi, diminuzione o perdita della pigmentazione, aumento del numero di papille gustative e neuromasti cranici, e cambiamenti nel comportamento come la perdita di comportamento scolastico, maggiore aggressività, cambiamenti di alimentazione postura e iperfagia 13 -19. Cavefish e pesce di superficie sono interfertili, e gli esperimenti di mappatura genetica sono stati effettuati per identificare loci e geni candidati per i tratti rupestri 1,20-26. Alcuni geni candidati sono stati testati per un ruolo funzionale nel contribuire a tratti rupestri in coltura cellulare 1,19, in organismi modello di altre specie di 21 o da 27 o sovraespressione atterramento transitoria ucantare morpholinos 28 in A. mexicanus. Tuttavia, ciascuno di questi metodi ha limitazioni. La capacità di generare alleli mutanti di questi geni in A. mexicanus è fondamentale per comprendere la loro funzione nell&#39;evoluzione del cavefish. Così, A. mexicanus è un organismo candidato ideale per l&#39;applicazione di tecnologie di modifica del genoma. Qui descriviamo un metodo per la modifica del genoma in A. mexicanus utilizzando Talens. Questo metodo può essere utilizzato per valutare mosaico iniettato pesce fondatore per fenotipi e per isolare le linee di pesce con mutazioni nei geni stabili di interesse 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection station</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle puller</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Supplies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td>
			<td style="width:71px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">Kit #1000000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9724-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Teknova TET-15 in 50% EtOH</td>
			<td style="width:71px;">Teknova (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-843-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2957-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Super Ampicillin (1000x solution)</td>
			<td style="width:71px;">DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">6060-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERR0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG, Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1620-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">BsaI</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-812-203</td>
			<td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">provided with restriction enzymes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10x T4 ligase buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-C1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">GoTaq Green Master mix</td>
			<td style="width:71px;">Promega (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PRM7123</td>
			<td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Quick ligation kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">50-811-728</td>
			<td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C4040-06</td>
			<td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Esp 3I</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">FERER0451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td>
			<td style="width:71px;">Epicentre (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">NC9046399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27106</td>
			<td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td>
			<td style="width:71px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-3119-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sac I</td>
			<td style="width:71px;">Promega (Ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">PR-R6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1348M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rneasy MinElute Cleanup Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Ambion (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">AM8551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eliminase</td>
			<td style="width:71px;">Decon (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">04-355-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microcaps</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">1-000-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf (ordered through Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Talen coppia iniezioni provocano vincolante delle RVDS a specifici nucleotidi del DNA e quindi dimerizzazione di domini FokI, con conseguente rotture a doppia elica 39, che possono essere riparati attraverso non omologhe fine di entrare (NHEJ). NHEJ spesso introduce errori che si traducono in inserzioni o delezioni (indels). Indels possono essere identificati amplificando la regione circostante il sito di destinazione TALEN e digerire l&#39;amplicone risultante con un enzima di restrizione che taglia all&#39;interno della regione distanziale TALEN. Gli alleli senza un indel saranno digerire mentre alleli contenente indels che cambiano la sequenza target enzima di restrizione non digerire, producendo una banda resistente enzima di restrizione (Figura 2). Iniezioni Talen possono probabilmente porterà a mutazioni del gene bialleliche in A. mexicanus 29. Così, alcuni fenotipi possono essere valutati nel pesce fondatore. Per<html> esempio, abbiamo valutato la pigmentazione nel pesce superficie iniettato con Talens OCA2 mira, il gene ipotizzato di essere responsabile di albinismo in molteplici popolazioni albini di cavefish 1,28. Abbiamo trovato macchie albini in OCA2 pesce TALEN-iniettato non presente nel pesce uninjected 29 (Figura 3). Per molti esperimenti, è desiderabile avere linee mutanti di pesce per valutare fenotipi. Fondatore pesce con alleli mutanti trasmessi può essere identificato dal genotipizzazione discendenza da incroci di pesce fondatore di pesce wild type (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;ago per l&#39;iniezione di mRNA. Fotografia di una micropipetta prima di essere rotto usato per l&#39;iniezione TALEN mRNA in singoli embrioni unicellulari._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig2.jpg" /> Figura 2. efficienza TALEN per OCA2. 306 bp prodotti di PCR di esone 9 di OCA2 in mexicanus Astyanax sono stati esaminati per la perdita del sito di enzima di restrizione quando diverse quantità di TALEN mRNA sono stati iniettati 29. L&#39;amplicone da un embrione di controllo è stato digerito mentre una parte dell&#39;amplicone era resistente alla restrizione digest nelle piscine di 10 TALEN iniettato embrioni. Enzima di restrizione digerire bande resistenti da embrioni iniettati con mRNA TALEN mirata OCA2 hanno dimostrato di contenere indels 29. Si noti che concentrazioni crescenti di mRNA iniettato si traduce in una maggiore efficienza TALEN (più DNA non digerito). Corsie con &quot;-&quot; sono non digerito, corsie con &quot;+&quot; sono DigesTed con enzima di restrizione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig3.jpg" /> Figura 3. pesce Fenotipizzazione fondatore per i cambiamenti nella pigmentazione. (A) Superficie di controllo uninjected A. mexicanus. (B) Patch manca melanofore in un pesce di superficie fondatore iniettato con 400 pg TALEN mRNA di targeting OCA2 (freccia). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54113/54113fig4.jpg" /> Figura 4. trasmissione germinale di mutatio TALEN indottans. 306 bp prodotti di PCR di esone 9 di OCA2 in A. mexicanus sono stati esaminati per la perdita del sito enzima di restrizione in pozze di 10 F 1 pesce da un pesce fondatore iniettato. L&#39;amplicone da un embrione di controllo è stato digerito mentre una parte dell&#39;amplicone era resistente alla restrizione digest nelle piscine di 10 F 1 embrioni. Enzima di restrizione digerire bande resistenti da F OCA2 sono stati visualizzati 1 s per contenere indels 29. Corsie con &quot;-&quot; sono non digerito, corsie con &quot;+&quot; sono digerito con enzima di restrizione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54113/54113fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reazione A </td><td></td><td></td><td> riattisu B </td><td></td></tr><tr><td> quantità </td><td> reagente </td><td></td><td> quantità </td><td> reagente </td></tr><tr><td> 4 pl </td><td> acqua </td><td></td><td> 10 microlitri </td><td> acqua </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pFUS_A </td><td></td><td> 1 ml </td><td> pFUS_B4 </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> BsaI </td><td></td><td> 1 ml </td><td> BsaI </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> BSA </td><td></td><td> 1 ml </td><td> BSA </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> ligasi </td><td></td><td> 1 ml </td><td> ligasi </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td colspan="2"> Buffer 10x Ligase </td><td> 1 ml </td><td> Buffer 10x Ligase </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pNH1 </td><td></td><td> 1 ml </td><td> pNG1 </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pNH2 </td><td></td><td> 1 ml </td><td> PhD2 </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pNG3 </td><td></td><td> 1 ml </td><td> pNH3 </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pHD4 </td><td></td><td> 1 ml </td><td> pNI4 </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pHD5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> PHD6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pNG7 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pHD8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pNG9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> pHD10 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Esempio assemblaggio reazione A e B per unTALEN contenente RVDS NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> nome Primer </td><td> Sequenza (5&#39;-3 &#39;) </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr></tbody></table> Tabella 2. primer PCR per colonia PCR, da 34. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reagente </td><td> quantità </td></tr><tr><td> Taq Mastermix, 2x </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> pCR8_F1 fondo,10 uM </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> pCR8_R1 fondo, 10 uM </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 42 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> * Regolare master mix se si utilizza un diverso Taq </td></tr></tbody></table> Tabella 3. mix master per 100 ml (15 ml / reazione) per colonia PCR 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> passo </td><td> Temperatura (° C) </td><td> tempo (sec) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 105 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Passare al punto 2 per 30 cicli </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr></tbody></table> Tabella 4. programma PCR per colonia PCR 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> quantità </td><td> reagente </td><td> concentrazione </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> acqua </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> vettore A </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> vettore B </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> destinazione vettore pT3Ts-GT </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> RVD finale (PLR-RVD) </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> Esp3I </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> ligasi </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml </td><td colspan="2"> Buffer 10x Ligase </td></tr></tbody></table> Tabella 5. Protocollo per le reazioni seconda assemblea. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> passo </td><td> Temperatura (° C) </td><td> tempo (sec) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 180 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Passare al punto 2 per 30 cicli </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr></tbody></table> Tabella 6. programma PCRper colonia PCR 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> calore </td><td> 290 </td></tr><tr><td> Tirare </td><td> 150 </td></tr><tr><td> velocità </td><td> 100 </td></tr><tr><td> tempo </td><td> 150 </td></tr><tr><td colspan="2"> Questi parametri sono per un Flaming / Brown Micropipetta Puller Modello P-97 utilizzando un filamento di depressione </td></tr></tbody></table> Tabella 7. ago Esempio programma di trazione. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reagente </td><td> quantità </td></tr><tr><td> Taq Mastermix, 2x </td><td> 12,5 ml </td></tr><tr><td> gene specifico primer forward, 10 micron </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> gene specifico primer reverse, 10 micron </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> DNA </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> * Regolare master mix se si utilizza un diverso Taq </td></tr></tbody></table> Tabella 8. protocollo di esempio per gene specifico PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> passo </td><td> Temperatura (° C) </td><td> tempo (sec) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 56 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Andare a Step 2 per 35 cicli </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 72 </td><td> 300 </td></tr><tr><td colspan="3"> * Regolare la temperatura di ricottura e il tempo di estensione per primer specifici e PCR dimensioni del prodotto </td></tr></tbody></table> Tabella programma PCR 9. Esempio per gene specifico PCR.

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Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesi è ora possibile in una vasta gamma di organismi che utilizzano tecniche di editing genoma. Qui, dimostriamo un protocollo per la mutagenesi genica mirata utilizzando trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) in Astianatte mexicanus, una specie di pesci che comprende pesce di superficie e cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Mexicanus Astianatte</em&gt; Uso Trascrizione Activator simile Effector nucleasi (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

8.2K Views.  Iowa State University.  Gene-targeting mutagenesi è ora possibile in una vasta gamma di organismi che utilizzano tecniche di editing genoma. Qui, dimostriamo un protocollo per la mutagenesi genica mirata utilizzando trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) in Astianatte mexicanus, una specie di pesci che comprende pesce di superficie e cavefish. 

Video: Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a method for inducing and recording the progress of a DTH reaction in the rat ear. This is followed by a demonstration of the preparation of rat ear tissue for two-photon imaging of the CCR7- effector / memory T cell response.
An adoptive DTH is induced by the intraperitoneal injection of GFP-labeled Ova-specific CCR7- effector / memory T cell line (Beeton, C J. Visualized Experiments, Issue 8). Cells are then allowed to equilibrate in the rat for 48 hours before challenge by injecting one ear with saline (control ear) and the other with a 1:1 mix of Ova and Ova conjugated to Texas-Red (Ova-TR) to allow visualization of resident antigen-presenting cells.
We describe a method of tissue preparation useful for imaging the motility of cells within the deep dermal layer during an immune response, in conjunction with visualization of collagen fibers by second harmonic generation. Ear tissue is cut into 5 x 5 mm squares (slightly larger is better) and mounted onto plastic cover slips using Vetbond&trade;, which are then secured using silicone grease in an imaging chamber and superfused by oxygen-bubbled tissue culture medium at 37&deg;C.

Here we demonstrate a method for inducing and recording the progress of a delayed type-hypersensitivity (DTH) reaction in the rat ear. This is followed by a demonstration of the preparation of rat ear tissue for two-photon imaging of the effector / memory T cell response.

Imaging Effector cellule T di memoria nell&#39;orecchio dopo l&#39;induzione di DTH adottivi

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a ...

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Biologia

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, form a complex with Smad4 and translocate to the nucleus where they function as transcription factors to initiate BMP specific downstream effects 1. Traditional immuno-fluorescence techniques with antibodies against phospho-Smad peptides exhibit low sensitivity, high background and offer gross quantification as they rely on intensity of the antibody signal particularly if this is photosensitive fluorescent. In addition, phospho-Smads may not all be in complex with Smad4 and engaged in active transcription.
In situ PLA is a technology capable of detecting protein interactions with high specificity and sensitivity 2-4. This new technology couples antibody recognition with the amplification of DNA surrogate of the protein. It generates a localized, discrete signal in a form of spots revealing the exact position of the recognition event. The number of signals can be counted and compared providing a measurement. We applied in situ PLA, using the Duolink kit, with a combination of antibodies that allows the detection of the BMP signaling effectors phospho-Smad1/5/8 and Smad4 only when these are in proximity i.e. in a complex, which occurs only with signaling activation. This allowed for the first time, the visualization and measurement of endogenous BMP signaling with high specificity and sensitivity in a time course experiment under BMP4 stimulation.

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Here we show how to use Proximity Ligation Assay (PLA), with a combination of antibodies to visualize Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in fixed cells. This technique allowed us to follow the nuclear accumulation of endogenous BMP activated effector-complexes and quantify their levels over time under BMP4 stimulation.

Rilevazione di segnalazione Effettistica-Complessi valle di BMP4 utilizzo In situ PLA, una legatura di prossimità Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Genome Editing con nucleasi zinco Finger CompoZr personalizzati (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellazione del genoma umano Morbid utilizzando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

Collezione Gamete e Fecondazione in vitro di Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...