This work was supported by NIH Grant HL-113905

Tutte le procedure sugli animali effettuati per questo studio sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della Nova Southeastern University in accordo con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, 8 ° edizione (The National Academies Press, Washington, DC 2011 ). 1. Preparazione sezioni di tessuto per autoradiografia del recettore <ol><li> Dopo il sacrificio, raccolto tessuti cerebrali freschi, e avvolgerlo in carta stagnola e posto in un -20 ° C freezer appena possibile. Per mantenere la forma corretta, posizionare il cervello in uno stampo cervello che simula l&#39;interno del cranio, avvolgerlo in carta stagnola e posto in un - 20 ° C freezer. Dopo 30 minuti, posto tessuti in un sacchetto di immagazzinaggio congelatore sigillato e passare a un C congelatore -80 ° per la conservazione a lungo termine. <ol><li> Ottenere il campione di tessuto congelato fresco di interesse dal scongelamento -80 ° C freezer, e trasferimento in un criostato impostata su un minimo di -10 ° C e massimo di -18 ° C, per evitare. </li&gt; <li> Posizionare il campione sul tessuto montare con un glicole e mezzo di inclusione a base di resina, solo incorporando una piccola parte del campione nel mezzo. Per il cervello, il cervello è montato verticalmente per consentire sezionamento nel piano coronale. </li></ol></li><li> Posizionare il supporto del tessuto sul microtomo all&#39;interno del criostato e bloccare in posizione. Assicurarsi che il lato destro e sinistro del cervello sono nelle stesse coordinate antero-postero, e che l&#39;asse dorso-ventrale è atlanti cerebrali perpendicolare usati comunemente. </li><li> Iniziare taglio allo spessore desiderato (20 micron consigliati) e scongelare montare le sezioni su vetrini da microscopio in direzione verticale per avere una maggiore superficie di spazio nella slitta. Raccogliere sezioni su vetrini in gruppi sequenziali di cinque, cioè la prima serie di vetrini sono etichettati 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5 (Figura 3). </li><li> Dopo aver riempito una serie di diapositive con le sezioni, i vetrini per asciugare all&#39;aria per un massimo di 1 ora, quindi inserire il slides in una scatola di plastica scivolo in un sacchetto di immagazzinaggio congelatore autosigillante, e conservare a -20 ° C. </li></ol> 2. autoradiografia del recettore ATTENZIONE: La radioattività. Utilizzare un abbigliamento protettivo per gestire la radioattività. Lo smaltimento è dipendeva stabilimento, e deve seguire le linee guida a decadere correttamente (tempo di dimezzamento di 60 giorni) o essere raccolti da una società certificata. <ol><li> Rimuovere il &quot;-1&quot; e &quot;-2&quot; diapositive di interesse dal -20 ° C freezer e montare in prese di scorrimento (Figura 5). Montare i &quot;-1&quot; scivoli insieme per il trattamento &#39;non specifica&#39;, e le &quot;-2&quot; scivoli per il trattamento &#39;totale&#39;. Vasetti &#39;non specifici &quot;conterrà 10 micron concentrazioni finali di PD123319 un AT 2 antagonisti R, e losartan un AT 1 antagonista R, in un tampone medio dosaggio (AM5) (Tabella 1), il&#39; totale &#39;vasi vincolanti potranno contenere solo 10 micron PD123319 in AM5. </li><li> Invertire la slittagrip per posizionare le diapositive nelle vaschette Coplin pre-incubazione pieni di 35-40 ml di AM5, e le rispettive inibitori per 30 minuti a temperatura ambiente. Inizia set successivi nella loro vasca di pre-incubazione a 4 intervalli min. </li><li> Trasferire immediatamente i vetrini dalla soluzione di incubazione pre ai bollettini incubazione diapositive, contenente 10 ml di AM5, oltre a una concentrazione predeterminata di 125 I-SI-Ang II (calcolato in figura 4) con i rispettivi inibitori, per 60-90 min at room temperatura. Se non vi è sufficiente radioligand, 10 vetrini possono essere posizionati (back to back) in prese di diapositive modificati e incubate con 125 I-SI-Ang II in vaschette Coplin. </li><li> Collocare i vetrini nuovamente dentro le impugnature di scorrimento (se necessario), macchia, e risciacquare delicatamente agitando per 1-2 secondi in 400 ml di acqua distillata in due contenitori separati. </li><li> Trasferire i vetrini in sequenza in quattro vaschette Coplin contenenti 35-40 ml di AM5 esattamente per 1 min ciascuna (come illustrato in figura 4 &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Dopo l&#39;ultimo 1 min risciacquo, agitare delicatamente sezioni per 1-2 secondi in quattro cambi di acqua distillata fredda ghiaccio. </li><li> Asciugarsi i vetrini con aria fresca (Attenzione: l&#39;aria calda volatilizza il composto radioattivo) utilizzando quattro asciugacapelli impostati da diverse angolazioni per 4 min (Figura 5), fino a quando tutte le sezioni sono a secco, poi posto su un tovagliolo di carta. </li><li> Montare i vetrini con i tessuti rivolta verso l&#39;alto su un cartone per apposizione di pellicola a raggi X utilizzando nastro biadesivo. </li><li> Mount almeno uno, 125 calibrazione Iodio vetrino standard su ogni cartone (Figura 6). Nota: Gli standard di calibrazione consistono di pasta cervello accuratamente mescolata con 125 iodio legato ad un composto contenente un anello di fenolo, compattato mediante centrifugazione in una siringa da 1 ml tubercolina, che sono criostato sezionata Allo stesso spessore delle sezioni di cervello e disgelo montato sul microscopio diapositive. In alternativa, 125 standard di calibrazione I aresina plastica sezionati a spessore 20 micron può essere ottenuta commercialmente. La resina plastica in questi standard protegge parzialmente la pellicola dal irraggiamento tale che una equivalenza tessuto ~ 40% dovrebbe essere incorporati nella calibrazione. </li></ol> 3. Film di esposizione e sviluppo <ol><li> Avanti a una camera oscura con una cinghia-back cassetta a raggi X e la pellicola autoradiografia. Aprire il cassetto e posizionare il cartone con scorre all&#39;interno (Figura 6). <ol><li> Spegnere le luci e accendere la luce di sicurezza. Aprire con cautela la scatola della pellicola a raggi X, rimuovere un film, e posizionare il lato lucido pellicola up (con il bordo frastagliato nell&#39;angolo in basso a destra) sulla parte superiore delle diapositive nella cassetta. Chiudere con cura la cassetta, e ruotare le barre di chiusura per sigillare la luce (Figura 6). Esporre le diapositive per diversi giorni a diverse settimane a -20 ° C. </li></ol></li><li> Nella camera oscura, aprire la cassetta e procedere con il proc pellicola in via di sviluppoess. <ol><li> Porre i vetrini in vassoi consecutivamente; sviluppatore per 2 min, acqua contenente 5% di acido acetico glaciale per 30 sec, e fissatore per 5 min. I film sono il collocati in un vassoio con acqua corrente per 20 minuti, poi messi in Photoflo per non più di 10 secondi e appesi. Nota: Il tempo di esposizione viene determinata empiricamente e può coinvolgere più film con diversi tempi di esposizione: il tempo necessario per ottenere segnali misurabili da aree a bassa vincolante, ma non è così lungo da saturare il film di aree con elevato legame. Una volta che l&#39;esposizione accettabili si ottengono, quindi procedere alla fase successiva. </li></ol></li></ol> 4. Istologia <ol><li> Preparare la macchia thionin e reagenti di colorazione (Tabella 2, Figura 7). <ol><li> Porre i vetrini &quot;-3&quot; nel rack scorrevole, e il trasferimento in ordine sequenziale iniziando con acqua deionizzata per 1 minuto, poi thionin soluzione macchia per 10 minuti seguito da tre tuffi in deionacque ized, e un lavaggio 30 sec in acqua deionizzata. </li><li> Dopo l&#39;acqua, posizionare il rack diapositiva in lavaggi etanolo come segue; 50%, 70% e 90% per 30 sec, seguito da due lavaggi etanolo al 100% per 1 min ciascuno. Infine, la cremagliera scorrevole in xilene per 3 min, quindi trasferire oltre ad una seconda soluzione xilene per 5 min. </li></ol></li><li> Rimuovere uno alla volta dall&#39;ultimo bagno di xilene, e coprire il bordo superiore della slitta a base di resine in solvente organico mezzo di montaggio e posizionare 24 mm x 60 mm coprioggetto sul vetrino. Lasciare i vetrini per sufficientemente asciutto per ~ 48 ore e quindi eseguire la scansione al computer a 2.400 dpi in scala di grigi. </li></ol> 5. densitometrica Image Analysis <ol><li> Posizionare il lato lucido pellicola verso il basso, con il bordo frastagliato nell&#39;angolo in basso a sinistra e la scansione utilizzando uno scanner proprietaria in grado di trasmettere le informazioni di densità di film senza alcuna distorsione nel computer sistema di imaging. </li><li> Aprire le SYS di imaging proprietarieTEM e utilizzare le barre di calibrazione per stabilire standard di calibrazione per il futuro analisi densitometrica delle immagini sulla pellicola (figure 9 - 12). </li><li> Misurare aree di interesse da entrambe stabilire un modello o empiricamente che illustra le aree di interesse. I dati sono la raccolta e separato sulla base di pellicola, sia di controllo o wild type (sezione), e della regione. Assicurati di includere densità (fmol / g), area di scansione e area di destinazione totale nelle misurazioni (Figura 9). <ol><li> Regolare bar area di scansione assicurando che regione di interesse è compreso tra i parametri di evidenziare (Figura 10). </li><li> Esportare i dati in un foglio di calcolo (Tabella 4). Moltiplicare i tempi densità dell&#39;area di destinazione totale, poi dividere per l&#39;area di scansione in modo da ottenere il valore per il legame di quella zona specifica. Una volta che questo è fatto per tutti i valori misurati, substrato non specifico stabilito dal totale da rendere il p legame specificorisentirsi di. Medie possono essere eseguite anche per questi valori. </li></ol></li></ol>

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

Il protocollo descritto identifica la visualizzazione del &#39;totale&#39; e &#39;non specifico&#39; legame del radioligando in sezioni adiacenti di sezioni coronali di cervello di roditori precedentemente raccolti e conservati a -80 ° C, e può essere facilmente applicabile a virtualmente ogni tessuto che è anatomicamente risolto sottostrutture che presentano importi differenziali di recettori o siti di legame radioligando. Le procedure descritte all&#39;interno del protocollo sono semplici e l&#39;analisi è fondamentale per interpretare correttamente i risultati. Lo spessore di 20 micron è stato determinato per essere ottimale; se la sezione è troppo spesso il legame non specifico aumenterà, rendendo difficile risolvere il legame del radioligando alla sua destinazione. Se la sezione viene tagliato sottile, diventa difficile da tagliare con successo e salvare sezioni sequenziali senza distorsione. La temperatura di taglio ottimale varia leggermente a causa della natura del tessuto e lo spessore delle sezioni e iDi solito è determinato empiricamente. Una volta che il contatto avviene tra la lama e il tessuto, l&#39;orientamento del campione può essere rivisto e riallineato spostando il campione di tessuto indietro via dalla lama, e riorientare la palla di montaggio. Quando si taglia un cervello dei roditori è fondamentale per garantire il lato destro e sinistro del cervello sono nelle stesse coordinate antero-postero, e che l&#39;asse dorso-ventrale è atlanti cerebrali perpendicolare usati comunemente. set di diapositive sono pre-etichettati al fine di condurre studi su sezioni adiacenti di tessuti. I primi gruppi di 5 scivoli sono etichettati 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5. La prima sezione di taglio va in slitta 1-1 nell&#39;angolo in alto a sinistra (questo è il alto a destra della diapositiva quando è ghiacciato lato verso il basso); la seconda sezione di taglio continua diapositiva 1-2, ecc La quinta sezione di taglio continua diapositiva 1-5. La sezione di taglio sesta continua diapositiva 1-1 a fianco della prima sezione. Dopo la prima serie di diapositive è piena, avviare un&#39;altra serie di 5 scivolatoES, etichettato 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, e 2-5. Questo ciclo è continuato fin nel cervello come necessario. Il &quot;-4&quot; e &quot;-5&quot; diapositive sono conservati come backup o per radiomarcato un recettore diverso. Il protocollo autoradiografia del recettore dipende radiolegante usato e le caratteristiche dei recettori essere esaminato per determinare le concentrazioni di tamponi, sali e inibitori. Per la misurazione del sottotipo AT1 dei recettori Ang II in questa procedura, una alta affinità Iodio-125 legante marcato, 125 I-Sar 1 Ile 8 -Ang II (125 I-SI-Ang II); radioattivo da Robert C. Speth, Ph.D. (Peptide Radioiodination Shared Resource, Georgetown University), che è anche disponibile in commercio) viene disciolto in tampone AM5 (Tabella 1); tampone fosfato di sodio con cloruro di sodio, EDTA e bacitracina. AM5 fornisce una buona protezione del radioligand da metallopeptidasi e peptida bacitracina sensibilises fornendo un pH fisiologico e concentrazione di NaCl per ottimizzare caratteristiche di legame. Pre-incubazione in AM5 espone le sezioni di tessuto per peptidasi inibitori per ridurre al minimo la degradazione radiolegante, e anche dissocia endogena Ang II dai recettori Ang II. Losartan e PD123319, AT1R e AT2R antagonisti, rispettivamente, che saturano i loro recettori di destinazione vengono aggiunti a concentrazioni (10 micron) per evitare che il radioligand di legarsi a questi recettori per valutare legame non specifico e limitare legame al recettore AT1 specifica, rispettivamente. La concentrazione desiderata di 125 I-SI-Ang II per il saggio è determinato e la diluizione necessaria della soluzione di riserva è determinata da un foglio di calcolo del tasso di decadimento radioisotopi (vedi protocollo Tabella 3). In modo ottimale una concentrazione di radiolegante approssimare la K D è usato che occupano il 50% dei recettori presenti. Tuttavia, poiché radioleganti possono essere costose inferiore concentrazioni e.g. 10-20% della concentrazione K D può essere utilizzato. Questo ha un potenziale vantaggio di aumentare il rapporto segnale-rumore riducendo legame non specifico più di legame specifico. Tuttavia, i tempi di esposizione più lunghi sono necessari per sviluppare un&#39;immagine del legame. Come notato sopra (punto 3.4), se l&#39;esposizione ottenuta è sopra o sotto esposte, i vetrini possono essere ri-esposti ad un nuovo film per una più breve e / o più tempo per raggiungere l&#39;esposizione desiderata. analisi densitometrica immagine può essere fatto da un sistema di imaging proprietario che fornisce una vasta compendio delle applicazioni per autoradiografia e altre applicazioni. standard di calibrazione sono in fmol / g di peso tessuto bagnato (supponendo un peso specifico di uno per il tessuto). Ciascun set standard, insieme a uno sfondo genererà una curva standard. Ci sono diversi algoritmi di curva-montaggio con e senza ponderazione disponibile per generare una curva standard dal relativo d optometricvalori (ROD) ensità per i diversi standard di calibrazione. Selezione della curva che meglio rappresenta i dati avviene empiricamente come subroutine per montaggio di curva non fornisce valori di errore relativi alle diverse curve standard. Al aste fino a ~ 0.6, la curva standard è pseudolineare. Tuttavia, il film comincia a saturare oltre questo punto formando una curva che Asintoti circa 0,8 a 0,9 unità ROD. Se le norme che sono bracketing i campioni sono sopra unità 0,9 ROD, si raccomanda di ri-esporre la pellicola per un periodo di tempo più breve per ottenere valori più affidabili di fmol / g vincolante dei campioni vicini alla gamma pseudolineare dello standard curva. I valori ottenuti in questo estremo della curva standard si tradurrà in piccole differenze in tondino per differenze significativamente più grandi in radioligand vincolanti. Quindi la capacità di rilevare variazioni diminuisce vincolanti come il film si avvicina al suo punto di saturazione. Per le misure di regioni specifiche,misure raccomandate sono &#39;Density&#39; in fmol / g, &#39;area di scansione&#39; in pixel, e &#39;Total Target Area&#39; in pixel (figura 9). È importante impostare un valore di soglia più vicino possibile allo zero (Figura 10) per variazioni di densità film o l&#39;aspetto arbitraria della curva standard derivato dagli standard di calibrazione possono talvolta dare valori inferiori a zero. Se tali valori sono mediati per tutti i pixel dell&#39;area di scansione deriverebbe un valore artificialmente basso. I criteri utilizzati per identificare le aree con legame può essere molto personale, quindi è preferibile accoppiare strettamente il controllo e cervello sperimentali per quanto possibile per ridurre l&#39;incidenza degli errori soggettivi. Un&#39;altra sfida è quella di decidere quante sezioni per la media per ottenere una lettura finale. Una buona indicazione di sezioni da analizzare può essere determinata seguendo un&#39;Ammessa atlas cervello di ratto, insieme con i vetrini istologici colorati. La dimensione della zona di campionamento può anche essere unproblema. Per compensare, un modello può essere stabilita per correggere eventuali discrepanze di dimensioni. Il trattamento delle sezioni potrebbe anche influenzare una zona della struttura che ha elevato vincolanti e devono essere considerati durante l&#39;analisi. Ciò richiede un uso alternativo dello strumento &#39;soglia&#39; nel sistema di imaging proprietaria per impostare un intervallo di densità superiore a un valore arbitrario in modo da rappresentare le caratteristiche anatomiche del cervello regione campionata come il nucleo paraventricolare dell&#39;ipotalamo all&#39;interno di uno strumento di campionamento che comprende la regione di interesse (Figura 11, pannello C). È anche possibile includere la misurazione della superficie nella determinazione della quantità di legante. Questo può essere fatto moltiplicando il valore per tempi specifici leganti il ​​numero di pixel che sono stati misurati. I pixel possono essere convertiti in unità metriche per l&#39;imaging di un righello in due piani, o un rettangolo di dimensioni note. Il numero di pixel che corrispondono allala lunghezza o l&#39;area del rettangolo possono essere espressi in unità metriche. Alla risoluzione di 2.400 dpi, ~ 9.000 pixel = 1 mm 2 nel nostro sistema. Sebbene l&#39;uso di ligandi radioattivi non è più una tecnica largamente usata; è uno dei pochi modi per visualizzare la distribuzione fisica dei recettori all&#39;interno del tessuto campioni stessi come funzionale (in grado di legare il suo ligando innata). Inoltre, è possibile quantificare il numero di recettori per consentire la valutazione delle variazioni di espressione del recettore funzionale tra i gruppi di trattamento, tra le diverse regioni del cervello o altre strutture, tra i diversi ceppi di animali, o di animali di età diverse, ecc sono disponibili metodi alternativi per caratterizzare aspetti neuroanatomiche di AT 1 espressione del recettore, tuttavia, hanno valore limitato. Ibridazione in situ di mRNA per AT 1 recettori non sempre corrisponde con AT 1 recettore espressione o la distribuzione nelcervello. Mentre le tecniche immunologiche possono approssimare differenze di espressione del recettore base all&#39;intensità della colorazione di sezioni di tessuto, non è possibile generare una curva standard per la colorazione per consentire una determinazione numerica di espressione del recettore. Receptor autoradiografia fornisce anche un livello di specificità per i recettori (o altri obiettivi che si legano specificamente radioleganti) che non può essere garantita mediante tecniche immunologiche. Nel 2009, una serie di articoli sono stati pubblicati 37-43 che metteva in discussione la validità di 49 anticorpi che venivano utilizzati per valutare 18 differenti recettori accoppiati a proteine ​​G e un canale transitoria potenziale del recettore (TRP). In sostanza, gli anticorpi etichettati bande identiche su macchine occidentali da wild-type e topi knockout per i recettori in questione. In seguito, diversi gruppi hanno fatto osservazioni simili utilizzando disponibili in commercio AT 1 e AT 2 anticorpi anti-recettore 44-49. L&#39;uso di un bacterial cromosoma artificiale che genera una molecola reporter esempio, proteina fluorescente verde, guidata dal AT 1 promotore è un mezzo indiretto per determinare la presenza o l&#39;assenza di AT 1 le cellule che esprimono i recettori nel topo (ma non ratto) cervelli base alla loro vista un funzionale al 1 recettore promotore 50. È possibile contare &quot;cellule positive&quot; nelle regioni del cervello microscopicamente identificate ma non per quantificare variazioni nell&#39;intensità di espressione del recettore 1 in queste regioni. Quindi in questo momento le tecniche solo convalidati disponibili per misurare direttamente l&#39;espressione del recettore Ang II sono radioligand metodi vincolanti. E, se è necessaria la risoluzione anatomica funzionale AT 1 proteina recettore a livello microscopico, autoradiografia del recettore è l&#39;unica tecnica disponibile per tale misura diretta. Autoradiografia del recettore non è senza limitazioni. Il principale Concern è quello di soddisfare i requisiti di utilizzare materiali radioattivi in ​​un ambiente di ricerca. E &#39;necessario avere un programma di sicurezza di radiazione con rigorose linee guida in atto per garantire la sicurezza di ricercatori che lavorano con materiali radioattivi e la disposizione di sicurezza dei materiali radioattivi. Questo intensifica il costo delle ricerche che utilizzano materiali radioattivi ad un punto che preclude il loro uso in molti ambiti di ricerca. Inoltre, il costo di radioligandi può essere notevole. Così un esperimento autoradiografia del recettore in cui un gran numero di sezioni di tessuto di diapositive montate vengono incubati in contenitori di radioligand può utilizzare centinaia se non migliaia di dollari di radioligand. Un&#39;altra limitazione è che i tessuti devono essere congelati prima del sezionamento su un criostato, conservati per un periodo di tempo, e rapidamente risciacquati e asciugati dopo incubazione con radioligando, ognuno dei quali può compromettere la capacità dei recettori o proteine ​​di interesse per impegnare la radioligand . Per ligandi che hanno una rapida asinoociation cinetiche / dissociazione, potrebbe non essere possibile mantenere il legame del radioligando al recettore durante il tempo necessario per lavare via radioligand non specificatamente legato. Inoltre, con basse quantità di legame lunghi periodi di esposizione della pellicola radioligand - un mese o più - può essere richiesto prima che un immagine misurabile può formare sul film. Un&#39;altra sfida è che l&#39;aggiunta di iodio-125 a un ligando può compromettere la capacità del ligando di legarsi al suo recettore o proteina bersaglio a causa dell&#39;impedimento sterico. L&#39;uso di una molecola più piccola, ad esempio, trizio (3 H) elimina il problema di ingombro sterico, ma trizio ha così bassa energia e bassa attività specifica (relativa allo iodio-125) che è estremamente difficile generare un&#39;immagine un film per più popolazioni recettore. Alla luce di questi problemi, ci sono molte situazioni in cui l&#39;autoradiografia del recettore è in grado di identificare i recettori o altre strutture molecolari di interesse. Nonostante la sua Limitations, autoradiografia del recettore in grado di identificare strutture specifiche all&#39;interno di un tessuto, ad esempio, le regioni cerebrali alterate in risposta alle variabili sperimentali rispetto ad un normale cervello di controllo. Questa conoscenza può aiutare a determinare il ruolo della AT 1 R per Ang II o altro recettore o enzimi nella patologia della malattia. Questa conoscenza ha valore implicazioni farmacologiche, in quanto indica le aree di obiettivo per potenziali terapie.

Le malattie cardiovascolari continua ad essere la principale causa di morte e disabilità negli Stati Uniti, causando più del 30% dei decessi negli Stati Uniti nel 2011 1. Le più recenti statistiche dalla American Heart Association indicano che più di una persona su tre ha un o più tipi di malattie cardiovascolari. la ricerca cardiovascolare continua a fare passi avanti contro la comprensione di questa malattia, ma come le generazioni iniziano invecchiando è imperativo continuare questi sforzi. Il sistema renina-angiotensina (RAS) gioca un ruolo centrale nella regolazione del sistema cardiovascolare promuovendo innanzitutto aterosclerosi, infiammazione, vasocostrizione sistemica, e l&#39;attivazione del sistema nervoso simpatico (Figura 1) 2-8. La RAS è un sistema ormonale che si attiva quando le cellule del rene iuxtaglomerulari secernono renina nel sangue in risposta alla diminuzione della pressione arteriosa, aumento sympatstimolazione hetic, o diminuito il flusso di sodio dal macula densa. Renina metabolizza angiotensinogen (sintetizzata nel fegato) per formare angiotensina I (Ang I). Ang I è poi metabolizzato dal dell&#39;enzima di conversione dell&#39;angiotensina (ACE), un ectoenzima sul lato luminale delle cellule endoteliali vascolari, principalmente nei polmoni e reni, per formare angiotensina II (Ang II), il principale effettore peptide della RAS. Ang II è in grado di attivare due sottotipi recettoriali; il recettore di tipo 1 (AT 1 R) e il recettore di tipo 2 (AT 2 R), sia che regolano il sistema cardiovascolare, mantenere l&#39;omeostasi idro-elettrolitico e sono ormai considerati di influenzare le funzioni cognitive e malattie neurodegenerative processi 8,9. Un locale, RAS specifica del cervello è segnalato per sintetizzare in modo indipendente Ang II. Nel cervello, il angiotensinogen proteina precursore viene sintetizzato in astrociti 10 convertito Ang I da un enzima renina-like 3, eventualmente prorenin legato al recettore prorenin11, e successivamente convertito in Ang II enzima di conversione che è abbondantemente espresso sulla superficie extracellulare dei neuroni nel cervello 12. Questo intrabrain generato Ang II è l&#39;agonista per il cervello AT 1 e AT 2 recettori che sono isolate da sangue-borne Ang II. Mentre l&#39;AT 1 R svolge un importante ruolo fisiologico, è meglio conosciuto per i suoi effetti patofisiologici in tutto il corpo, soprattutto a carico del sistema cardiovascolare e dei reni (Figura 2). Quando Ang II si lega al AT 1 R, provoca vasocostrizione; aumentando la resistenza al flusso sanguigno e aumentare la pressione sanguigna. Inoltre promuove la sintesi e la secrezione di aldosterone e vasopressina, che porta ad un aumento della ritenzione di sodio e acqua. Questi effetti possono anche indurre danno ischemico cerebrale e disturbi cognitivi ed è collegata al morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, e diabetes, oltre ad essere recentemente identificato incidere apprendimento e memoria 13-15. C&#39;è un ciclo di feedback nel RAS dal fatto che 1 R sulle cellule iuxtaglomerulari nel rene inibisce la secrezione di renina. È interessante notare che la AT 2 R generalmente contro-regola l&#39;azione di AT 1 R, causando vasodilatazione, crescita dei neuriti, la rigenerazione assonale, anti-proliferazione, e cerebroprotection tra molti altri 16-20. L&#39;AT 2 R è stato inoltre individuato come obiettivo per l&#39;anti-ipertensione e di recente, farmaci anti-cancro 21. Determinazione della localizzazione e densità dei recettori Ang II all&#39;interno di vari tessuti e come essi sono influenzati da vari trattamenti e stati di malattia utilizzando quantitativa autoradiografia del recettore densitometrica aiuterà a scoprire il ruolo della RAS gioca a malattie specifiche. Autoradiografia del recettore è stato usato per oltre 30 anni come un metodo efficace per indicare la presenza di angiotensina II recettori e gli altri componenti dei RAS nel cervello e altri tessuti del ratto, topo, cavia, cane e umana sotto una varietà di condizioni sperimentali 22-34. L&#39;importanza di localizzare recettori Ang II nel cervello è che si può applicare neuroanatomia funzionale alle azioni di Ang II nel cervello, ad esempio, la presenza di AT 1 R nel nucleo paraventricolare dell&#39;ipotalamo (PVN) suggerisce una funzione di Ang II nel cervello per stimolare vasopressina, ossitocina o il rilascio della corticotropina releasing hormone (CRH), o l&#39;attivazione del sistema nervoso simpatico. Pertanto, i farmaci che bloccano l&#39;AT 1 R potrebbero diminuire alcuni di questi effetti PVN-mediati associati sull&#39;attività delle RAS cerebrali. Lavori in corso suggeriscono che l&#39;uso di AT 1 antagonisti R può diminuire disturbo post-traumatico da stress (PTSD) rilascio indotta di CRH e migliorare i sintomi di PTSD (Hurt et al., Inviato per la pubblicazione). PVN, subfornicaleorgano (SFO), e l&#39;amigdala sono noti per la regolazione dell&#39;omeostasi, l&#39;appetito / la sete, il sonno, la memoria, le reazioni emotive, e sono le aree di destinazione di questo studio dimostrazione. Queste regioni sono stati esaminati attraverso la raccolta di sezioni coronali di cervello su vetrini da microscopio, e il trattamento delle sezioni con inibitori specifici insieme a un radiolegante specifica per i recettori Ang II. In questo studio, tutti i materiali e reagenti insieme con i fornitori suggeriti sono elencati, iodio-125 è stato utilizzato per radiomarcato un antagonista Ang II recettore, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), che è stato poi purificato come mono 125 I -SI Ang II usando metodi HPLC come descritto in precedenza 35. L&#39;utilizzo di questa specifica elevata radiolegante attività consente la visualizzazione di aree di bassa, moderata e alta densità recettoriale dopo esposizione delle sezioni radiomarcati alla pellicola a raggi x. Per calibrare il film con standard pasta cerebrali contenenti quantità note di iodio-125, la quantità specificadel recettore Ang II vincolante in una zona può essere quantificato. In studi sperimentali, il recettore Ang II vincolante nel cervello dei soggetti sperimentali può essere paragonata a quella nel cervello dei soggetti di controllo. Questo può indicare se le azioni di Ang II sono alterati in risposta ad una condizione genetica, anomalia fenotipica, stato di malattia o trattamento farmacologico. Questa conoscenza può essere applicata allo sviluppo di terapie per il trattamento di malattie associate con disregolazione del RAS. Tecniche alternative che identificano il recettore siti di legame, ma con ridotta risoluzione anatomica, sono test che utilizzano preparazioni di membrane di tessuto derivati ​​da omogenati di tessuti, che vengono incubate con radiolegante in un range di concentrazioni per valutare radioligand affinità di legame come la costante di dissociazione (K D vincolanti ) e massima capacità legante (B max) del tessuto di interesse. Il protocollo qui descritto può essere suddiviso in 5 principali components: Preparazione del tessuto Sezioni per autoradiografia del recettore; Autoradiografia del recettore; Esposizione Film e sviluppo; Istologia; e densitometrica Image Analysis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>500ml Plastic Beakers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-591-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24mm x 60mm Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-050-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography Imaging Film 24x30cm</td>
			<td>Carestream-Biomax MR Film</td>
			<td>891-2560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin (from Bacillus licheniformis)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard Sheet 8x11</td>
			<td>Crescent Illustration Board #201</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hair dryers</td>
			<td>Conair</td>
			<td>Model SD6X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Disodium salt, Dihydrate)</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>15-699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16-100-210&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulary Substitute for D-19 Developer</td>
			<td>Photographers Formulary, Inc.&#160;</td>
			<td>01-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38 SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoprep / OCT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH75-125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film Fixer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>5160320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo flo</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Losartan</td>
			<td>Fisher/Tocris</td>
			<td>37-985-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCID&#8482; Core 7.0</td>
			<td>MCID</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way slide grips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48440-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD123319</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-615-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Charged Slides , Fine Ground Edge</td>
			<td>Premiere Microscope Slides</td>
			<td>9308W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125I Ligands</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX- 248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125SI-Ang II&#160;</td>
			<td>George Washington University</td>
			<td>Radioiodinated by Dr. Speth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mailers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>RDCS0750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (Anhydrous)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thionin&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T409-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Ray Casette (10 x 12)</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td>Four Square</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

receptor autoradiography protocol for the localized visualization of angiotensin ii receptors

Questo protocollo descrive recettore modelli vincolanti per angiotensina II (Ang II) nel cervello di ratto utilizzando un radiolegante specifico per i recettori Ang II per eseguire recettore mappatura autoradiografica. campioni di tessuto sono raccolti e conservati a -80 ° C. Un criostato viene utilizzato per la sezione coronale del tessuto (cervello) e scongelare-montare le sezioni su vetrini cariche. Le sezioni di tessuto di diapositive montate sono incubati in 125 I-SI-Ang II radiomarcato recettori Ang II. Diapositive adiacenti sono separati in due gruppi: (NSP) in presenza di un recettore saturare concentrazione di non-radiomarcata Ang II, o un &#39;binding non specifico&#39; AT 1 Ang II sottotipo recettoriale (AT 1 R) antagonista selettivo del recettore Ang II , e &#39;totale vincolante&#39; senza AT 1 R antagonista. Una concentrazione di saturazione di AT 2 Ang II sottotipo recettoriale (AT 2 R) antagonista (PD123319, 10 micron) è presente anche nel incubatisul buffer di limitare 125 I-SI-Ang legame alla AT 1 R sottotipo II. Nel corso di un 30 minuti di pre-incubazione a ~ 22 ° C, scivoli NSP sono esposti a 10 micron PD123319 e losartan, mentre &#39;totale vincolante&#39; diapositive sono esposti a 10 micron PD123319. I vetrini vengono poi incubate con 125 I-SI-Ang II in presenza di PD123319 per &#39;legame totale&#39;, e PD123319 e losartan per NSP nel tampone di dosaggio, seguita da diversi lavaggi &#39;&#39; nel buffer e acqua per eliminare il sale e non specificamente, legato radioligand. Le diapositive sono asciugati con blow-essiccatori, poi esposti a pellicola autoradiografia utilizzando una pellicola specializzato e cassetta. Il film è stato sviluppato e le immagini vengono scansionati in un computer per densitometria visiva e quantitativa utilizzando un sistema di imaging di proprietà e un foglio di calcolo. Un ulteriore insieme di diapositive sono thionin-macchiato per i confronti istologici. Il vantaggio di utilizzare autoradiografia del recettore è la capacità di visualizzareAng II recettori in situ, all&#39;interno di una sezione di un campione di tessuto, e anatomicamente identificare la regione di tessuto confrontandolo con una sezione di riferimento istologica adiacente.

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Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Autoradiografia del recettore Protocollo per la visualizzazione localizzata di recettori dell&#39;angiotensina II

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K Views.  Nova Southeastern University. Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II. 

Video: Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

Il dispositivo TMS NeuroStar: Condurre la FDA ha approvato protocollo per il trattamento della depressione

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Ricerca

Neuroscienze

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Riproduzione automatica Interactive Video per gli Studi di comunicazione animale

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and hypothalamus that supplies blood to the brain and surrounding structures. It has been implicated in several cerebrovascular disorders, including cerebral amyloid angiopathy (CAA)-associated vasculopathies, intracranial atherosclerosis and intracranial aneurysms. Studies of the molecular mechanisms underlying these diseases for the identification of novel drug targets for their prevention require animal models. Some of these models may be transgenic, whereas others will involve isolation of the cerebro-vasculature, including the CoW.The method described here is suitable for CoW isolation in any mouse lineage and has considerable potential for screening (expression of genes, protein production, posttranslational protein modifications, secretome analysis, etc.) studies on the large vessels of the mouse cerebro-vasculature. It can also be used for ex vivo studies, by adapting the organ bath system developed for isolated mouse olfactory arteries.

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Protocollo per isolare il circolo di Willis mouse

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...