R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell&#39;uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono altamente tossici e cancerogeni. Tutte le fasi che coinvolgono solventi organici nocivi, in particolare l&#39;estrazione dei prodotti di reazione e la derivatizzazione di acidi grassi devono essere effettuate sotto una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni full-length, scarpe chiuse ). Tutte le operazioni che coinvolgono organismi geneticamente modificati in questo lavoro richiedono installazioni che sono stati approvati per la gestione di organismi geneticamente modificati della S1 livello di sicurezza. 1. L&#39;espressione della ricombinante decarbossilasi olet JE in E. coli <ol><li> Preparazione del ceppo produttivo <ol><li> Preparare un gene sintetico di Olet JE dal Jeotgalicoccus e clonato nel vettore di espressione PASK-IBA37plus come descritto. 8 </sup&gt; NOTA: Per evitare la degradazione degli acidi grassi dagli enzimi del metabolismo batterico, E. coli ceppo JW5020 della collezione Keio con un percorso disfunzionale per la degradazione degli acidi grassi è stato utilizzato. </li></ol></li><li> La coltivazione e l&#39;induzione di espressione dell&#39;enzima <ol><li> Preparare una pre-cultura inoculando la E. coli JW5020 olet mutante da un LB-plate (contenente 100 mg ml -1 ampicillina) in due 3 ml di LB-media in provetta. Pipetta ampicillina (100 ug ml -1) da una soluzione madre nel mezzo di selezione e incubare a 37 ° C per 15 h in un incubatore agitazione a 180 rpm. </li><li> Aggiungere 2 ml di pre-culture di due 200 ml di LB-media, contenente ampicillina (100 mg ml -1), in 1 fiaschi L agitare. Incubazione procede a 37 ° C e 180 rpm. </li><li> Monitorare il cambiamento di OD 600nm dopo l&#39;inoculazione. Quando la OD 600 raggiunge un valore compreso tra 0,6 und 0.8 indurre l&#39;espressione con l&#39;aggiunta di tetraciclina (0,2 mg ml -1). Incubare le culture per 15 ore a 20 ° C e 180 rpm. NOTA: Poiché Olet JE contiene un cofattore eme, è necessaria aggiunta di acido levulinico δ-Amino (0,5 mM) prima dell&#39;induzione di fornire la cultura con un precursore per la sintesi cofattore. </li></ol></li><li> La lisi cellulare <ol><li> Eseguire i seguenti passi sul ghiaccio. Trasferire le culture per decantazione o pipettando nella provette da centrifuga e utilizzare una scala per garantire la parità di distribuzione. Centrifugare le colture per 20 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminare attentamente il supernatante e risospendere il pellet in 50 ml di tampone (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) pipettando e trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga conica. </li><li> Dopo centrifugazione per 15 min a 4000 xga 4 ° C scartare il surnatante, risospendere ogni pellet in 3 ml di tampone pipettando. </li><li> Eseguire la lisi cellulare da cosìnicating le soluzioni su ghiaccio (tre cicli x 30 sec) lasciando un 1 minuto di pausa tra i cicli. Centrifugare le soluzioni per 20 min a 15.000 xg a 4 ° C per rimuovere detriti cellulari e trasferire il surnatante in un tubo di centrifugazione conica senza disturbare il pellet pipettando. Eliminare il pellet. NOTA: Una frazione solventi sarà utilizzato direttamente per biocatalisi dopo piccole molecole vengono rimossi. La seconda frazione sarà utilizzata per la purificazione del His-tag Olet JE. </li></ol></li><li> La rimozione di piccole molecole di Cell-estratti <ol><li> Prima di utilizzare l&#39;estratto grezzo in biocatalisi rimuovere piccole molecole che possono interferire con la formazione di perossido di idrogeno o trasferimento elettronico pipettando 3 ml di estratto cellulare in un&#39;unità filtrante centrifuga con 10 kDa membrana e centrifugare a 4000 xga 4 ° C. Risospendere la proteina residua in 3 ml di Tris-HCl-buffer. </li></ol></li><li> Purificazione di Olet </strong&gt; <ol><li> Applicare 3 ml del secondo estratto cellulare ai suoi Pur Ni-NTA colonne di rotazione, che sono stati equilibrati prima con tampone di equilibrazione (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazolo 10 mM). </li><li> Sigillare le colonne con i tappi di fondo e tappi a vite superiore e stringere leggermente fino a quando la resina viene distribuito equamente con l&#39;estratto cellulare. Incubare le colonne caricate per 30 min in un agitatore testa a 4 ° C. </li><li> Lavare le colonne di 1 ml di tampone di lavaggio (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazolo 20 mM, pH 7,4) per centrifugazione a 700 xg per 2 minuti. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Posizionare le colonne in un tubo di centrifugazione conica fresco e aggiungere 1 ml di tampone di eluizione (Tris 20 mM, NaCl 300 mm, 250 mm imidazolo, pH 7,4) olet JE. Centrifugare a 700 g per 2 minuti e ripetere l&#39;operazione due volte. NOTA: Imidazole si legherà al nichel e quindi rimuovere olet JE dalla colonna. </li><li> Trasferire il eluizione di un gruppo filtro centrifuga (10 mem kDabrane) e centrifugare a 4000 xga 4 ° C per rimuovere imidazolo. </li><li> Controllare la purezza dell&#39;enzima da un SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 microlitri della eluizione con SDS-buffer (1x concentrazione finale) e incubare la soluzione a 95 ° C per 5 minuti per denaturazione. Successivamente applicare la quantità totale su un SDS-PAGE. Attivare il gel a 35 mA utilizzando uno standard commerciale proteine. Rilevare la proteina a 50 kDa. </li><li> Per determinare la concentrazione proteica utilizzare una disposizione BSA-kit commerciale. Pipettare 50 ml di campioni di proteine ​​diluito (1: 100, 1: 200, 1: 500) e standard di BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) in una piastra a 96 pozzetti . Aggiungere 200 ml di reagente di Bradford, misurare l&#39;assorbanza a 595 nm dopo 15 min con un fluorimetro e calcolare le concentrazioni utilizzando la curva standard. </li></ol></li></ol> 2. Biotrasformazione Light-catalizzata <ol><li> Le reazioni biocatalitici senza aggiunta di perossido di idrogeno<ol><li> Preparare una soluzione di 10 ml di 10 mM di acido stearico (M r 284,5 g mol -1) aggiungendo 10% (v / v) tergitol e 0,0284 g di acido stearico di acqua distillata. Riscaldare la soluzione in una stufa a 60 ° C fino l&#39;acido grasso è completamente sciolto. </li><li> Biocatalisi e campionamento <ol><li> Preparare due 2 ml miscele di reazione contenenti 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM acido stearico in Tris-HCl-buffer. Aggiungere una barra di agitazione magnetica per apporto di ossigeno sufficiente e posizionare i tubi di vetro in un bagno d&#39;acqua, riscaldata a 25 ° C. </li><li> Aggiungere 200 mg ml -1 di enzima purificato o 10% (v / v) estratto cellulare a ciascuna delle miscele di reazione e illuminare con una lampadina di vetro chiaro (120 W) in 15 cm di distanza delle provette di reazione. </li><li> Prendere 200 campioni microlitri in punti temporali specifici (0, 10, 30, 60 e 120 min e durante la notte) fermare la reazione con 20 l 37% di HCl. Aggiungere 5 ml di acido miristico (10 mM magazzino cosìluzione) come standard interno. </li></ol></li></ol></li><li> Analisi dei prodotti di reazione <ol><li> Per l&#39;estrazione aggiungere 500 microlitri di acetato di etile ai campioni due volte, invertire i tubi e centrifugare per 1 min a 13.000 x g. </li><li> Togliere 400 ml di surnatante e lasciare che il solvente completamente evaporare. </li><li> Derivatize gli acidi carbossilici in acido trimethylsilylcarboxylic aggiungendo 200 microlitri N -methyl- N - (trimetilsilil) acetammide trifluoro (MSTFA). Incubare la soluzione a 60 ° C per 30 minuti per convertire i gruppi ossidrilici di trimetilsilil etere. </li><li> Determinazione della conversione in GC / FID NOTA: Determinare la formazione di 1-eptadecene (RT: 8,34 min), acido stearico α- e β-idrossi (RT: 12.05 e 12.1 min) e la diminuzione del substrato (RT: 11,15 min) mediante GC / FID. <ol><li> Impostare il profilo di temperatura descritto di seguito impostare la temperatura di iniezione a 340 ° C. tenerela temperatura iniziale del forno è a 90 ° C per 3,5 minuti e successivamente aumenta a 45 ° C min -1. A 220 ° C, mantenere la temperatura per 2 min. Dopo un ripetuto aumento di 45 ° C min -1, mantenere la temperatura a 280 ° C per 2 minuti e poi aumentare con 60 ° C min -1. NOTA: La temperatura massima di 330 ° C è tenuto per 1.44 min. </li><li> Iniettare 4 ml di campione, con un rapporto di divisione di 5 per ottenere una rapida volatilizzazione e miscelazione omogenea con elio gas di trasporto. NOTA: In dipendenza dalla temperatura crescente substrato e prodotti entreranno nella fase gassosa. Le sostanze sono rilevati dal rilevatore / FID GC dopo aver superato la colonna in tempi di ritenzione specifici e vengono visualizzati come picchi sullo schermo. Osservare la formazione del picco sul monitor. </li><li> Calcolare la concentrazione di prodotto formato dalla seguente formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; NOTA: Il fattore di calibrazione è stata determinata specificamente per questa colonna per ogni substrato e prodotto calcolando la curva standard dalla quantità note delle sostanze derivatizzati e la loro area del picco corrispondente. </li></ol></li><li> Identificare i picchi di acido olefine e beta-idrossi mediante GC / MS. <ol><li> Identificare i picchi di acido olefine e beta-idrossi mediante GC / MS. Impostare il profilo di temperatura. Impostare la temperatura di iniezione a 250 ° C. Mantenere la temperatura del forno a 100 ° C per 5 minuti e poi aumentare a 20 ° C min -1. NOTA: massima temperatura viene mantenuta per 7,5 min. </li><li> Impostare la temperatura del rivelatore spettrometro di massa a 250 ° C e la scansione da 50 a 500 m / z in modalità impatto elettronico. NOTA: Electron impatto ionizzazione rimuove un singolo elettrone causando la formazione di un catione radicale che verrà passato in avanti per l&#39;analisi di massa. A causa dei legami covalenti energia intramolar alte all&#39;interno delpausa molecola creando frammenti di bassa m / z. Questi frammenti formano un&#39;impronta digitale specifico per una sostanza. </li><li> Iniettare 1 ml di campione. Detect 1-eptadecene dopo 11.4 min Tempo di ritenzione dal corrispondente impronta digitale (Figura 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La generazione di luce-driven di perossido di idrogeno può essere applicato per una gamma redox trasformazioni, tra cui peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 e P450 monoossigenasi 5. Si tratta di un approccio semplice e praticabile. A lungo termine, l&#39;uso di luce visibile apre la prospettiva di utilizzare la luce solare per trasformazioni chimiche, che è un&#39;alternativa sostenibile per reazioni ricchi di energia. Il metodo è applicabile con l&#39;enzima purificato o con estratto cellulare. Mentre quest&#39;ultimo richiede meno costi e lavoro, va notato che le piccole molecole nel estratto grezzo possono interferire con la conversione catalizzata luce. Un approccio possibile è rimuovere questi piccoli componenti con micromembrana (cioè, per centrifugazione in un gruppo filtro centrifugo o dialisi). La concentrazione della molecola luce raccolta FMN determina la concentrazione del perossido di idrogeno. A seconda della affinity del ossidoreduttasi, questa concentrazione è determinante per l&#39;attività enzimatica. Un altro fattore importante è la concentrazione di EDTA donatore di elettroni sacrificale. Il parametro più importante, tuttavia, è la stabilità operativa e l&#39;attività dell&#39;enzima. Il olefinization di acidi grassi è un elegante reazione per la conversione di acidi grassi a base biologica in olefine che appartengono ai principali prodotti per l&#39;industria chimica. Il biocatalitica decarbossilazione light-driven può essere effettuata a temperatura ambiente ed a pH neutro, che offre evidenti vantaggi in termini di sostenibilità. I nostri risultati mostrano che generazione in situ di perossido di idrogeno è una strategia per fornire il cofattore senza compromettere la stabilità dell&#39;enzima, portando ad una conversione elevata. metodi attuali per la rigenerazione del cofattore utilizzano prodotti agricoli o prodotti chimici a base di petrolio. Le reazioni luce-driven stanno emergendo come alternativa rinnovabile. Futuroricerca sarà dedicata ai metodi per la sostituzione del reagente EDTA sacrificale da molecole più economici e per ridurre la quantità della molecola FMN luce raccolta.

Il cambiamento climatico e il prevedibile esaurimento delle risorse rinnovabili rappresenta una grave minaccia per la nostra società. In questo contesto, catalisi enzimatica rappresenta un potenziale ancora pienamente sfruttata per lo sviluppo di sostenibile e &#39;verde&#39; chimica 1. Ossidoriduttasi hanno la capacità di catalizzare l&#39;introduzione e la modifica dei gruppi funzionali in condizioni lievi reazioni e appartengono alle più importanti biocatalizzatori 2. La maggior parte delle trasformazioni redox richiedono la fornitura di esterna di cofattori quali NAD (P) H. Metodi per la rigenerazione del cofattore sono stati applicati in scala industriale. Tuttavia, ancora si traducono in alti costi di processo, che limita la loro applicazione soprattutto per prodotti di alto valore. È interessante notare che diversi perossidasi 3,4 e monoossigenasi P450 5 accetta elettroni da perossido di idrogeno attraverso la cosiddetta shunt perossido. Mentre H 2 O 2 è un buon co-reagente, è riferito harmful per molti enzimi. Una costante formazione in situ di basse concentrazioni di perossido di idrogeno è un approccio praticabile per guidare la reazione senza compromettere la stabilità operativa di enzima. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figura 1. Set-up sperimentale della decarbossilazione photobiocatalytic di acidi grassi da olet JE. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;uso della luce come fonte di energia per processi chimici e biologici ha ricevuto una crescente attenzione negli ultimi anni 6. Generazione di luce-driven di perossido di idrogeno è emerso come un metodo semplice e robusto per la fornitura di acqua ossigenata per le trasformazioni redox (Figura 1). Un fotocatalizzatore come flavina adenina mononucleotide (FMN) permette la riduzione dell&#39;ossigeno molecolare al perossido di idrogeno, che viene quindi utilizzato come cofattore per la reazione enzimatica oxyfunctionalization. Possibili donatori di elettroni sono acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), ascorbato o formiato poco costoso. Il metodo è generalmente applicabile per H 2 O 2 enzimi -dipendenti, tra cui perossidasi 3,4 e monoossigenasi P450 5. Abbiamo recentemente studiato l&#39;applicazione di una decarbossilasi batterica novel 7 per la trasformazione dei grassi naturali in olefine 8. Questo sarebbe un percorso sostenibile per la sintesi di sostanze chimiche piattaforma ampiamente utilizzati da una fonte a base biologica. Il decarbossilasi olet JE dal batterio gram-positivi Jeotgalicoccus sp. catalizza la decarbossilazione ossidativa degli acidi grassi e forma 1-alcheni come prodotti. Olet JE è strettamente legato al monoossigenasi batteriche P450 e ha bisogno di elettroni fperossido di idrogeno rom per la reazione. Sfortunatamente, l&#39;aggiunta di H 2 O 2 ad una soluzione di substrato e l&#39;enzima provocato basse conversioni e una scarsa riproducibilità dei risultati, presumibilmente a causa di un effetto nocivo di perossido di idrogeno sulla stabilità del Olet JE. Generazione di una proteina di fusione con la NADPH-reduttasi RhFred fatto un decarbossilazione NADPH-dipendente possibile. 9 Tuttavia, il prezzo elevato di NADPH e le attuali limitate possibilità di una rigenerazione conveniente ci hanno spinto a indagare donatori di elettroni meno costosi. Ispirato dalla somiglianza di olet JE con monoossigenasi P450, abbiamo usato la generazione di luce-catalizzata di H 2 O 2. Siamo stati lieti di ottenere elevate conversioni (fino a&gt; 95%) utilizzando estratti privi di cellule o soluzioni di enzimi purificati. Con l&#39;esempio di decarbossilazione degli acidi grassi, vi presentiamo un protocollo generale per enzym luce-driventrasformazioni redox ATIC utilizzando FMN come il perossido di fotocatalizzatore e idrogeno come cofattore. I metodi presentati includono la produzione dell&#39;enzima in cellule ricombinanti di E. coli, la purificazione dell&#39;enzima, l&#39;applicazione per la sintesi di 1-alcheni e l&#39;analisi dei prodotti di reazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Chemicals</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">K015.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>90604-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">141-78-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:131px;">Roth</td>
			<td style="width:173px;">8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:195px;">Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">130-40-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochlorid acid 37%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">&#948;-Amino levulinic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>5451-09-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:195px;">N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">24589-78-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Myristic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">208-875-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">288-32-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:173px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Stearic acid &#62;99%</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">57-11-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">60-54-8&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tergitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">MFCD01779855&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Device</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:195px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:131px;">G-25CK</td>
			<td style="width:173px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Ecotron</td>
			<td style="width:173px;">Infors HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation</td>
			<td style="width:131px;">Labofuge 400R</td>
			<td style="width:173px;">Heraeus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">Fresco 17</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centrifugation rotors</td>
			<td style="width:131px;">SS34</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:131px;">SLA</td>
			<td style="width:173px;">Sorvall</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Clean bench</td>
			<td style="width:131px;">Envirco</td>
			<td style="width:173px;">Ceag Schirp Reinraum technik</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Column GC-FID&#160;</td>
			<td style="width:131px;">CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 &#181;m)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Column GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-FID</td>
			<td style="width:131px;">GC-2010 plus</td>
			<td style="width:173px;">Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GC-MS</td>
			<td style="width:131px;">IST-40</td>
			<td style="width:173px;">Varian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:131px;">RCT classic</td>
			<td style="width:173px;">IKA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:131px;">SevenEasy</td>
			<td style="width:173px;">Mettler toledo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sonicator</td>
			<td style="width:131px;">Branson Sonifier 250</td>
			<td style="width:173px;">Branson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spectral photometer</td>
			<td style="width:131px;">FLUOstar Omega</td>
			<td style="width:173px;">BMG Labtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Affinity chromatography column</td>
			<td style="width:131px;">His Pur Ni-NTA spin column</td>
			<td style="width:173px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Centricon</td>
			<td style="width:131px;">Vivaspin turbo 15</td>
			<td style="width:173px;">VWR International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Microtiter plates</td>
			<td style="width:131px;">96 Well Multiply&#174;PCR Plates</td>
			<td style="width:173px;">Sarstedt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Ossidoriduttasi appartengono agli enzimi industriali più-applicate. Tuttavia, hanno bisogno di elettroni esterni la cui fornitura è spesso costoso e impegnativo. Riciclaggio del NADH o NADPH donatori di elettroni richiede l&#39;uso di altri enzimi e substrati sacrificali. È interessante notare che diversi ossidoreduttasi accettano perossido di idrogeno come donatore di elettroni. Pur essendo poco costoso, questo reagente spesso riduce la stabilità degli enzimi. Una soluzione a questo problema è la generazione in situ del cofattore. L&#39;alimentazione continua del cofattore a bassa concentrazione guida la reazione senza compromettere la stabilità dell&#39;enzima. Questo documento illustra un metodo per la luce catalizzata generazione in situ di perossido di idrogeno con l&#39;esempio della decarbossilasi acido grasso eme-dipendente Olet JE. Il decarbossilasi acido grasso Olet JE stato scoperto grazie alla sua capacità unica di produrre catena lunga 1-alcheni da acidi grassi, un enzimatica finora sconosciutoreazione. 1-alcheni sono ampiamente utilizzati additivi plastificanti e lubrificanti. Olet JE ha dimostrato di accettare elettroni da perossido di idrogeno per la decarbossilazione ossidativa. Mentre aggiunta di idrogeno perossido danneggia l&#39;enzima e si traduce in basse rese, generazione in situ del cofattore aggira questo problema. Il sistema photobiocatalytic mostra evidenti vantaggi per quanto riguarda l&#39;attività enzimatica e la resa, risultando in un sistema semplice ed efficiente per decarbossilazione di acido grasso.

Mentre l&#39;aggiunta di perossido di idrogeno alla miscela di reazione ha determinato bassa a moderata conversioni (&lt;10%), generazione in situ di perossido di idrogeno aumentato la conversione fino al 80% di conversione. Analisi mediante GC / MS mostra la formazione di olefine da acidi grassi (Figura 2). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Profilo di temperatura per misure GC / MS. (B) impronte digitali del eluizione 1-eptadecene dopo 11.4 min. (C) caratteristica secondaria ioni C n H 2n-1 frammento di olefine terminali esemplare mostrato per 1-eptadecene. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> E. coli. Una soluzione enzimatica purificata ha mostrato una chiara correlazione tra la concentrazione di enzima e la conversione. Aumentando la concentrazione del piombo molecola di FMN luce raccolta a conversioni più elevate. Tuttavia, aumentando la concentrazione oltre 10 mM non accelerare ulteriormente le reazioni, indicando che la quantità di perossido di idrogeno è sufficientemente disponibili e non più il fattore limitante. Oltre alla decarbossilazione degli acidi grassi, Olet JE catalizza anche una idrossilazione nel β-posizione. Nella conversione di acido stearico, la decarbossilazione è circa tre volte più veloce della idrossilazione. In un tipico esperimento utilizzando una soluzione di 0,5 mM di acido stearico e 10 pM FMN, 99% del substrato sono stati convertiti ad una miscela di 1-eptadecene e acido 2-idrossistearico con un rapporto di3.3: 1 (Figura 3) 8. Un&#39;indagine dello spettro substrato della biocatalisi light-driven mostrato che per acidi grassi con catene più lunghe acilici, Olet JE catalizza preferenzialmente la decarbossilazione, mentre la quantità relativa di acidi idrossile-grassi nella miscela di prodotto aumenta con breve lunghezza della catena. Acidi grassi più brevi di acido miristico (C14) non hanno subito decarbossilazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;analisi gas cromatografica Olet JE mediata decarbossilazione di acido stearico (11.15 min) in 1-eptadecene (8.4 min), acido stearico (12.04 min) β-idrossi acido stearico α-idrossi (12,1 min). Viene mostrato il cambiamento delle aree di picco di campioni prelevati nel corso di un tempo-corso di 2 ore. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vie</a>wa più grande versione di questa figura. Sorprendentemente, il acidi insaturi acido oleico (C18: 1D9 cis) e acido linoleico (C18: 2d9d12) non sono stati accettati come substrati, che indica che la configurazione ritorta di doppi legami cis non può essere accolto in una modalità produttiva legame dell&#39;enzima. Aggiunta di acido oleico (10%) anche impedito la conversione di acido stearico. È interessante notare che, acido stearico (C18: 1D9 trans) è stato convertito da Olet JE, ma con l&#39;attività leggermente inferiore quindi acido stearico.

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Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Descriviamo un protocollo per la generazione di luce-catalizzata di perossido di idrogeno - cofattore per trasformazioni ossidative.

Enzimatica decarbossilazione Luce-driven

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Nanyang Technological University

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Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as an intrinsic probe to characterize virtually every chemical process. Nowadays, this technique is extensively applied to determine thermodynamic parameters of biomolecular binding equilibria. In addition, ITC has been demonstrated to be able of directly measuring kinetics and thermodynamic parameters (kcat, KM, &#916;H) of enzymatic reactions, even though this application is still underexploited. As heat changes spontaneously occur during enzymatic catalysis, ITC does not require any modification or labeling of the system under analysis and can be performed in solution. Moreover, the method needs little amount of material. These properties make ITC an invaluable, powerful and unique tool to study enzyme kinetics in several applications, such as, for example, drug discovery.
In this work an experimental ITC-based method to quantify kinetics and thermodynamics of enzymatic reactions is thoroughly described. This method is applied to determine kcat and KM of the enzymatic hydrolysis of urea by Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Calculation of intrinsic molar enthalpy (&#916;Hint) of the reaction is performed. The values thus obtained are consistent with previous data reported in literature, demonstrating the reliability of the methodology.

Isothermal titration calorimetry measures heat flow released or absorbed in chemical reactions. This method can be used to quantify enzyme-catalysis. In this paper, the protocol for instrumental setup, experiment running, and data analysis is generally described, and applied to the characterization of enzymatic urea hydrolysis by jack bean urease.

Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Ricerca

Chimica

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Reazioni a cascata enzimatica per la sintesi di Amino alcoli chirali da L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces are demonstrated. This work requires careful design, considerable synthetic effort, and proper analysis. The rotary motion of the molecular motor in solution is shown by 1H NMR and UV-vis absorption spectroscopy techniques. In addition, the method to graft the motor onto an amine-coated quartz is described. This method helps to gain more insight into molecular machines.

The manuscript describes how to synthesize and graft a molecular motor on surfaces for single molecular imaging.

Motori molecolari basati su luce sulle superfici per l'Imaging molecolare singola

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These metabolites are produced endogenously by the cytochrome P450 class of enzymes. Because of their diverse and potent biological effects, there is considerable interest in studying these metabolites. Determining the unique roles of these metabolites in the body is a difficult task, as the epoxy fatty acids must first be obtained in significant amounts and with high purity. Obtaining compounds from natural sources is often labor intensive, and soluble epoxide hydrolases (sEH) rapidly hydrolyze the metabolites. On the other hand, obtaining these metabolites via chemical reactions is very inefficient, due to the difficulty of obtaining pure regioisomers and enantiomers, low yields, and extensive (and expensive) purification. Here, we present an efficient enzymatic synthesis of 19(S),20(R)- and 16(S),17(R)-epoxydocosapentaenoic acids (EDPs) from DHA via epoxidation with BM3, a bacterial CYP450 enzyme isolated originally from Bacillus megaterium (that is readily expressed in Escherichia coli). Characterization and determination of purity is performed with nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), high-performance liquid chromatography (HPLC), and mass spectrometry (MS). This procedure illustrates the benefits of enzymatic synthesis of PUFA epoxy metabolites, and is applicable to the epoxidation of other fatty acids, including arachidonic acid (AA) and eicosapentaenoic acid (EPA) to produce the analogous epoxyeicosatrienoic acids (EETs) and epoxyeicosatetraenoic acids (EEQs), respectively.

We present a method useful for large-scale enzymatic synthesis and purification of specific enantiomers and regioisomers of epoxides of arachidonic acid (AA), docosahexaenoic acid (DHA), and eicosapentaenoic acid (EPA) with the use of a bacterial cytochrome P450 enzyme (BM3).

Sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...