SN e MDD hanno ricevuto sostegno dal NIH K08 NS083740 e il Dipartimento di Neurologia della UCLA. AJG riconosce sostegno da parte del Dr. Miriam e Adelson Research Foundation Sheldon G. medica e la L. Hillblom Fondazione Larry. KLN ringrazia il sostegno della Stroke Centro American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ILL, EGS e STC sono stati sostenuti da NIH R01 NS071481. JDH riconosce il sostegno NIH K08 NS083740.

L&#39;uso di animali in questo protocollo è stata eseguita in conformità con le procedure approvate dalla University of California Los Angeles cura degli animali e del Comitato Usa. Nota: Iniziare identificando la popolazione murina bersaglio. In studi precedenti, wild-type topi C57 / BL6 solo di sesso maschile sono stati utilizzati, tuttavia diversi topi transgenici o knockout possono anche essere utilizzati. Si noti che le coordinate stereotassica sono basati su C57 / BL6 anatomia. Si raccomanda che ogni utente inizialmente verificare la localizzazione del tratto di materia bianca. 1. Bianco Materia fase di aspirazione - mediale Avvicinamento angolare <ol><li> Iniziare preparando una pipetta di vetro tirato utilizzando 0,5 millimetri capillare tale che il diametro distale è compreso tra 15-25 micron 11. </li><li> Preparare una sterile 10 microlitri aliquota della L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornitina HCl) a 27.4 mg / ml (130 micron) a 0,9% sterile fisiologica. </li><li> Pre-riempire la pipetta di vetro tiratocon un piccolo volume di L-Nio (2-5 ml) apponendo la pipetta di vetro per tubo collegato ad una linea di vuoto. Posare il piatto pipetta sul banco e inserire l&#39;estremità tirato nella soluzione L-Nio. <ol><li> Applicare il vuoto fino ad almeno 2 mm della porzione 0,5 millimetri della pipetta si riempie. Spegnere il vuoto e ritirare la pipetta. Mettere da parte fino al punto 1.12. </li></ol></li><li> Posizionare il mouse in una camera di induzione e indurre l&#39;anestesia del mouse utilizzando standard di 32% isoflurano scorreva attraverso un vaporizzatore (5 L / min inalato con 5 L / min di ossigeno e 0,5 L / min N 2) per 1 min o fino a quando profondamente anesthesized. Trasferire il mouse per un apparato stereotassico dotato di un microscopio stereotassico. Fornire anestesia manutenzione utilizzando 32% isoflurano scorreva un vaporizzatore (2 L / min inalato con 5 L / min di ossigeno e 0,5 L / min N 2) ed un cono. Controllare la profondità dell&#39;anestesia con un pizzico punta. </li><li> Regolare il braccio di iniezione a 36 °. </li><li> Affixa tirato titolare pipetta di vetro all&#39;estremità distale di un sistema di iniezione a pressione basso volume e collegarlo al braccio iniezione della configurazione stereotassica. </li><li> Coat baffi degli animali anestetizzati con vaselina e il luogo artificiale pomata di rottura sopra entrambi gli occhi. Preparare un campo chirurgico sterile, mettendo un telino sterile sopra la testa dell&#39;animale con un 5-10 cm di apertura sopra la testa. Preparare una superficie chirurgica asettico dalla rasatura sovrastante il cranio. Pulire il cuoio capelluto con alternanza di betadine e il 70% tamponi con alcol. </li><li> Fare un 1,5 centimetri incisione mediana del cuoio capelluto con le forbici sottili sterili per esporre la superficie del cranio. Asciugare il cranio con un tampone di cotone sterile e utilizzando un microscopio a stereotassica 1-3X ingrandimento, rimuovere qualsiasi tessuto periostale sovrastante utilizzando uno strumento sterile punto micro. </li><li> Segnare il Bregma come punto di riferimento con un pennarello a punta fine. </li><li> Praticare un 2 millimetri craniotomia ellipitical utilizzando una sterile multa stip punta da trapano chirurgico0; a partire posteriormente al Bregma e che estende anteriormente appena lasciato della linea mediana. Rimuovere frammenti ossei e sovrastante tessuto molle in modo che la corteccia cerebrale può essere visualizzato. </li><li> Mantenere il campo chirurgico e la superficie corticale umida applicando intermittente gocce di soluzione salina sterile. </li><li> Applicare una pipetta di vetro tirato al braccio dell&#39;iniettore dell&#39;apparato stereotassico. Allineare l&#39;estremità distale della pipetta con il Bregma e zero le coordinate stereotassica. </li><li> Avanzare la pipetta per la prima anteriore / posteriore (A / P) e mediale / laterale (M / L) coordinate fornite in Tabella 1. </li><li> Avanzare la pipetta alla superficie corticale e zero dorsale / ventrale (/ V D) di misura. </li><li> Lentamente passare la pipetta nel cervello fino a raggiungere la prima D / V di coordinate nella tabella 1. </li><li> Utilizzando un sistema di iniezione a bassa pressione volume impostato a 20 psi per 20 impulsi msec, iniettare 100 nl di L-Nio nel cervello e attendere 5 minuti per evitare il reflussola pista pipetta. <ol><li> Utilizzare un reticolo calibrato in dell&#39;oculare del microscopio stereotassica ed un ingrandimento di 3X. </li><li> Pertanto, spostare un totale di 0.100 mm 3 (lunghezza 0,5 mM una pipetta 0,5 mm di diametro, corrispondente a 100 nl) dalla pipetta di vetro tirato per ogni insieme di coordinate. Utilizzando un reticolo, misurare e standardizzare poiché ogni set up varia a seconda dell&#39;ingrandimento e scale utilizzato. </li><li> Per la misurazione del volume precisa durante ogni iniezione, avvicinare la pipetta angolato con il microscopio dal lato in modo che il menisco aria fluido ha una vista sagittale. Il menisco dovrebbe apparire sullo stesso piano focale sia della parete interna ed esterna della pipetta. </li></ol></li><li> Lentamente ritirare la pipetta e ripetere i passaggi 1.13-1.16.3 al secondo e terzo set di coordinate forniti in Tabella 1. </li><li> Dopo l&#39;ultima iniezione, rimuovere la pipetta e posizionare cera ossea sufficiente per riempire il sito craniotomia. UNpproximate i bordi della ferita cuoio capelluto e legarsi con adesivo dermico. </li><li> Iniettare 0,1 ml di 0,5% Marcaine nei margini della ferita utilizzando una sterile 30 ago G per evitare per evitare dolore locale associato con l&#39;incisione del cuoio capelluto. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso abitazioni e fornitura di antibiotici post-operatorio (0,48 mg / ml trimetoprim-sulfametossazolo, o 0,5 mg / ml levofloxacina) nell&#39;acqua da bere per 5 giorni. </li></ol> 2. Bianco Materia fase di aspirazione - posteriore Avvicinamento angolare <ol><li> Eseguire i passaggi 1,1-1,12 come nel mediale protocollo approccio angolato, tranne regolare il braccio di iniezione del setup stereotassica a 45 gradi orientati anteriore a posteriore. </li><li> Avanzare la pipetta per la prima A / P e M / L coordinate fornite nella tabella 2. </li><li> Completa passaggi rimanenti 1.14-1.20 come nel laterale protocollo approccio angolato. </li></ol> 3. retrograda neuronale etichettatura <ol><li> Preparare una sterile 10Un&#39;aliquota ml di L-Nio a 54,8 mg / ml in 0,9% soluzione salina normale. </li><li> Preparare una un&#39;aliquota sterile del 20% Fluororuby (o il 20% biotinilato ammina destrano o 2% Fluorogold) nel 0,9% soluzione fisiologica. </li><li> Diluire insieme 1: 1 per concentrazioni finali di 27,4 mg / ml di L-Nio e il 10% Fluororuby. </li><li> Eseguire il protocollo di ictus come sopra nei passaggi 1.3-1.23. </li><li> Visualizza il tracciante fluorescente nativamente nella sezione di tessuto per la fissazione perfusione, criosezionamento e microscopia come descritto in precedenza 8. </li></ol> 4. Il trattamento dei tessuti per immunofluorescenza <ol><li> In un intervallo post-ictus appropriato che vanno da 3 ore a 14 giorni dopo l&#39;ictus, euthanize topi tramite overdose isoflurano o IACUC locali approvati procedura. </li><li> Aprire la cavità toracica con le forbici angolate e inserire un ago G 23 farfalla nel ventricolo sinistro. </li><li> Inserire un piccolo taglio nell&#39;atrio destro usando forbici sottili per permettere una traccia di deflusso per il liquido di perfusione. </li><li> Transcardially profumato con 30-40 ml di soluzione salina tamponata con fosfato freddo seguita da 30-40 ml di freddo 4% paraformaldeide ad una velocità di 10 ml / min a RT. </li><li> Decapitare il mouse e rimuovere il cervello con le forbici sterili per aprire il cranio posteriormente e quindi rimuovere delicatamente il cranio sovrastante con una spatola, mettere il cervello a freddo 4% PFA per 24 ore, e poi il trasferimento al 30% di saccarosio in PBS per 48 ore . </li><li> Preparare quaranta sezioni micron mobile usando un criostato e eseguire l&#39;elaborazione di anticorpi come descritto in precedenza 6-8. In questo studio, utilizzare i seguenti anticorpi: coniglio anti-neurofilamenti 200 (diluizione 1: 500); coniglio anti-vimentina (1: 500); capra anti-GFAP (1: 500); coniglio anti-Iba-1 (1: 1.000). </li></ol> 5. Trattamento del tessuto per proteine ​​o RNA analisi <ol><li> In un intervallo post-ictus appropriato che vanno da 3 ore a 14 giorni dopo l&#39;ictus, eutanasia tramite overdose isoflurano o IACUC locale procedura approvata. </li><li> decapitare ilmouse e rimuovere il cervello con le forbici sterili per aprire il cranio posteriormente e quindi rimuovere delicatamente il cranio sovrastante con una spatola. </li><li> Inserire una sterile 4 millimetri spatola nella parte anteriore del cervello per tagliare il bulbo olfattivo e nervi ottici. Sollevare delicatamente il cervello fuori della calotta cranica e posto in buffer di dissezione ghiacciata (soluzione salina bilanciata di 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 35 mm di glucosio, 4 mM di bicarbonato di sodio, e 0,01 mg / ml Cicloesimide). </li><li> Utilizzando un blocco cervello e nuove lame di rasoio sterile, preparare lastre di 2-3 mm contenenti la corsa e il luogo nel buffer dissezione a freddo. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, identificare la sostanza bianca sottostante corteccia motoria dell&#39;emisfero iniettato. A intervalli post-corsa più lunga, la regione può essere visivamente identificato da necrosi focale e mielina pallore. Nota: A intervalli post-ictus precedenti, l&#39;iniezione di L-Nio mescolato con 1 ml di 10% Veloce verde può permettere l&#39;identificazione visiva della corsa ( <strong&gt; Figura 4A). </li><li> Sotto la guida di un microscopio da dissezione e utilizzando un bisturi fresco, sezionare con cura la regione di sostanza bianca contenente la corsa, identificata da una veloce etichettatura Verde o perdita di tessuto. Rimuovere la corteccia sovrastante e sottostante striato, se lo desideri. </li></ol>

<ol>
	<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129, 28-292 (2014).</li><li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+stroke:+not+listened+to+rather+than+silent.">Silent stroke: not listened to rather than silent.</a> Stroke. 43, 3102-3104 (2012).</li><li>Koton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+and+outcome+of+prevalent+ischemic+brain+disease+in+a+national+acute+stroke+registry.">Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry.</a> Stroke. 44, 3293-3297 (2013).</li><li>Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+vascular+dementia+and+vascular+cognitive+impairment:+a+systematic+review.">Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review.</a> J Neurochem. 115, 814-828 (2010).</li><li>Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+that+matter:+white+matter+stroke+models.">Models that matter: white matter stroke models.</a> Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).</li><li>Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+white+matter+stroke+model+in+the+mouse:+axonal+damage,+progenitor+responses+and+MRI+correlates.">A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates.</a> J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).</li><li>Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+exacerbation+of+white+matter+stroke+outcomes:+a+role+for+oxidative+damage+and+inflammatory+mediators.">Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators.</a> Stroke. 44, 2579-2586 (2013).</li><li>Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+the+axon+initial+segment+after+focal+cortical+and+white+matter+stroke.">Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke.</a> Stroke. 44, 182-189 (2013).</li><li>McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+N-iminoethyl-L-ornithine+as+an+irreversible+inhibitor+of+nitric+oxide+synthase+in+phagocytic+cells.">Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells.</a> Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).</li><li>Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+oligodendrocyte+development.">Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development.</a> J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> CSH prot. , (2006).</li><li>Hughes, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+lesions+in+the+rat+central+nervous+system+induced+by+endothelin-1.">Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).</li><li>Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+a+rat+model+of+cerebral+ischemia+and+beta-amyloid+toxicity:+inflammatory+responses.">Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses.</a> Stroke. 36, 107-112 (2005).</li><li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+capsular+infarct:+endothelin-1+injections+in+the+rat.">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).</li><li>Horie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+focal+cerebral+ischemia+using+endothelin-1.">Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1.</a> J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+deficits+and+delayed+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+multiple+microinfarcts.">Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts.</a> Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).</li><li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes.">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li></ol>

Un certo numero di modelli precedenti di ictus sottocorticale sono stati descritti tra cui iniezioni focali di endotelina-1 nella capsula interna, sostanza bianca sottocorticale e striato nel ratto 6,15 12-14 e mouse. Modelli più recenti di piccoli colpi focali hanno utilizzato il colesterolo microemboli iniezione nella carotide 16 e l&#39;occlusione photothrombotic di un singolo arteriole penetrante 17. Ognuno di questi modelli presenta vantaggi e svantaggi 5. Il modello attualmente descritto produce una lesione che ha una serie di caratteristiche che imitano infarto lacunare umana, compresa l&#39;anormalità assonale e la perdita, il degrado mielina, un core necrotico focale e un deficit clinica che è minimo e dimostra abbastanza rapido recupero dipende da 7 anni. Targeting sostanza bianca murino permette una grande varietà di manipolazioni genetiche in grado di supportare gli studi meccanicistici. la criticafasi del protocollo includono utilizzando le coordinate stereotassica accurate. Perché sostanza bianca murino è di piccole dimensioni e varia da ceppo a ceppo, può essere necessaria la revisione delle coordinate stereotassica a seconda dell&#39;età e la tensione di mouse utilizzato. Il controllo del volume di iniezione è importante anche perché questo è direttamente correlata alle dimensioni dell&#39;infarto. iniezioni più grandi produrranno colpi più grandi che invadono in corteccia sovrastante e striato sottostante. Iniezione focale di ET-1 ricorrendo alla procedura descritta qui stato segnalato ma endotelina-1 è stato dimostrato di avere effetti paracrini diretti sulla differenziazione degli oligodendrociti e la maturazione 10,18 confondere lo studio di post-ictus sostanza bianca biologia. Al contrario, gli Obiettivi di avvicinamento L-Nio cellule endoteliali da solo mentre produce una lesione identico ed elimina eventuali effetti paracrini confondenti sulle cellule coinvolte nella risposta lesioni. L-Nio non è direttamente citotossico ed il Selecdose di Ted è stato determinato da esperimenti preliminari aumento della dose (dati non riportati). L&#39;approccio angolato posteriore è stato sviluppato per più precisamente assoni sottosquadri dalla corteccia motoria primaria che produce il deficit comportamentali massima che può essere attribuito a lesioni della sostanza bianca. L&#39;approccio angolato mediale anche danni assoni corteccia motoria, ma si estende più lateralmente e coinvolge gli assoni sottostanti corteccia sensoriale primaria. La lesione ictus si espande abbastanza rapidamente rispetto al primo 24 ore. Per sette giorni, le dimensioni dell&#39;infarto è massima e non abbiamo osservato una crescita significativa lesione là di quel tempo. Ulteriori eventi cellulari e degenerazione assonale si verificherà oltre questa fase iniziale, ma le dimensioni dell&#39;infarto, misurata dal nucleo necrotico non cambieranno significativamente in assenza di qualsiasi intervento. Co-iniezione di traccianti neuroanatomiche al momento della corsa identifica neuroni vivendo danno assonale ischemico. Utilizzando il medial o posteriore approccio angolato, i corpi cellulari neuronali con proiezioni assonale danneggiati rimangono illesi. Questo crea un modello utile per studiare l&#39;effetto di assotomia ischemico sui neuroni del sistema nervoso centrale. Abbiamo utilizzato traccianti retrogradi principalmente tra destrano ammina e fluorogold, che sia mostrano eccellente assorbimento da assoni ictus-danneggiati. Impiegando l&#39;ampia varietà di transgenici e knock-out linee del mouse, gli utenti di questo protocollo può indagare il ruolo specifico dei geni neuronali coinvolti in bianco ictus materia di risposta e la riparazione lesioni.

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US 1. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia 2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist 4,5. 
The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.
Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) 6 that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded 7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter. 
The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) 9 with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 10. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride</td>
			<td style="width:204px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:133px;">400600-20MG</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceutical, Inc.</td>
			<td>NDC 57319-559-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>50-821-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer</td>
			<td>Parker Instrumentation</td>
			<td>Picospritzer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereotactic setup</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC51725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette puller</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>88-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PY2 72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved Forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PY2 72-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt dissection tool</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>10066-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8220-1/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drill bits</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marcaine</td>
			<td>HOSPIRA</td>
			<td>NDC 0409-1610-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trimethoprim-Sulfamethaxole</td>
			<td>STI Pharmacy</td>
			<td>NDC 54879-007-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluororuby</td>
			<td>Fluorochrome Inc</td>
			<td>30mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP220-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica CM3050 S</td>
			<td>14047033518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23 gauge butterfly needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-840-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M HEPES-KOH, pH 7.4</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>16924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile murine model of subcortical white matter stroke for the study of axonal degeneration and white matter neurobiology

Ictus colpisce conti sostanza bianca fino al 25% delle presentazioni ictus cliniche, avviene automaticamente a velocità che possono essere 5-10 volte maggiore, e contribuiscono alla sviluppo di demenza vascolare. Pochi modelli di focale ictus sostanza bianca esistono e questa mancanza di modelli appropriati ha ostacolato la comprensione dei meccanismi coinvolti nella risposta neurobiologiche danno e la riparazione dopo questo tipo di ictus. La principale limitazione di altri modelli di ictus subcorticali è che essi non focally limitano l&#39;infarto alla materia bianca o sono stati in primo luogo convalidato in specie non murini. Questo limita la capacità di applicare l&#39;ampia varietà di strumenti di ricerca murini per studiare la neurobiologia di bianco ictus materia. Qui presentiamo una metodologia per la produzione affidabile di un ictus focale nella materia bianca murino utilizzando una iniezione locale di un inibitore irreversibile eNOS. Presentiamo anche diverse variazioni sul protocollo generale di cui due stereotassica unicovariazioni, retrograda tracing neuronale, nonché di etichettatura tessuto fresco e sezionamento che ampliare notevolmente le potenziali applicazioni di questa tecnica. Queste variazioni permettono di molteplici approcci per analizzare gli effetti neurobiologiche di questa forma comune e poco studiato di ictus.

Utilizzando il modello presentato, la sostanza bianca zampa anteriore sottostante sensomotorio corteccia può essere mirata in modo affidabile. Questo modello di ictus indotto chimicamente produce assonale focale e la perdita di mielina, astrocitosi, e microgliosis (figura 1), come è tipicamente visto in infarti lacunari umani. Utilizzando tre iniezioni, un modello clinicamente utile è stabilito con insufficienza presto compiti motori zampa anteriore 7 e una piccola ma significativa porzione di esperienze tessuto cerebrale ischemia che immunoistochimica, immunofluorescenza, e biochimici tecniche sono fattibile e affidabile a livello quantitativo. In momenti iniziali (HR) dopo l&#39;induzione ictus, cambiamenti nell&#39;organizzazione molecolare assonale possono essere rilevati (Figura 2). A 7 giorni, la corsa completa la sua maturazione ad una zona circoscritta di perdita assonale (Figura 1a). Nelle nostre mani, questo metodo produce una focale bianco approssi questione lesionetamente 800 micron di diametro orizzontale e l&#39;estensione di circa 1 mm lungo l&#39;asse antero-posteriore del corpo calloso. In 7 giorni, la dimensione media totale dell&#39;infarto è circa 0,200 millimetri 3 ed avrà una forma ellittica. Abbiamo osservato circa il 10% variabilità dimensioni del tratto sia tra animali e tra le sezioni, dipendenti dove dell&#39;ellisse avviene sezione. Ulteriore crescita delle dimensioni dell&#39;infarto è raramente visto oltre 7 giorni. L&#39;aggiunta di una iniezione contemporanea di risultati amminici destrano in significativa etichettatura neuronale nello strato 5 e lo strato 6 corpi cellulari neuronali che hanno assoni sporgenti attraverso la regione di ictus (Figura 3). neuroni corticali sovrastante che non siano danneggiati dagli aspetti sham della procedura (passaggio di ago sottile), subiscono un danno assonale distale e possono essere identificati con l&#39;inclusione di un tracciante con la preparazione L-Nio. Questo approccio è stato l&#39;uso<html> d dimostrare cambiamenti dinamici del segmento iniziale dell&#39;assone dopo l&#39;ictus 8. Mentre la piccola dimensione della regione del tessuto affetto da corsa limita l&#39;uso di altre tecniche comuni come 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione, la regione ictus sostanza bianca può essere identificato in tessuto fresco. L&#39;aggiunta di un colorante comune come veloce verde produce una regione identificabile di tessuto che può essere sezionato sotto un microscopio da dissezione (Figura 4). Una volta sezionato questo tessuto può essere utilizzato per l&#39;analisi proteica con western blot o immunoprecipitazione, o per l&#39;isolamento di RNA e di analisi (Figura 4C). Attraverso l&#39;uso di varie linee topo transgenico, una varietà di approcci innovativi possono essere utilizzati per studiare la neurobiologia dopo focale ictus sostanza bianca compresi gli studi di mappatura destino delle cellule e microdissezione laser (Figura 4C). tenda &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53404/53404fig1.jpg" /> Figura 1:. Focale Corsa bianca Materia Utilizzando Sia mediale e posteriore Approcci angolati etichettatura immunofluorescenza per neurofilamenti (A, rosso) dimostra il grado di perdita assonale sette giorni dopo l&#39;ictus utilizzando l&#39;approccio mediale. Utilizzando l&#39;approccio angolato posteriore, il bianco della lesione ictus questione si rivolge appena sopra il ventricolo laterale (B, C) ​​e mostra microglia intenso (B) e reattività astrociti (C). Due astrociti marcatori intermedi ad incandescenza, vimentina (rosso) e acida fibrillare gliale proteina (GFAP, verde), entrambi mostrano cambiamenti nella morfologia della sostanza bianca astrociti (fibrosi) dopo ictus (C). Scala bar = 500 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53404/53404fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un grande ver</a>sione di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53404/53404fig2.jpg" /> Figura 2:. Bianco Materia Stroke Altera assonale microdomini Organizzazione Entro 3 ore di bianco induzione materia ictus, organizzazione microdomini assonale nel nodo, segnata da beta-IV spettrina (rosso) e al paranode, segnata da proteine ​​contattonel-associata (caspr, verde), è interrotta (frecce, B). Controlaterale assoni della materia bianca mostrano nodale regolare, paranodal, e l&#39;organizzazione juxtaparanodal (A e C), mentre la sostanza bianca ipsilaterale mostra allungamento nodale e paranodal che è tipica degli assoni con contatto axoglial perso (B e D). Barra di scala = 5 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53404/53404fig3.jpg" /> Figura 3: retrograda neuronale Labeling con Bianco Materia Stroke Identifica singoli neuroni con danno assonale. Co-iniezione di ammina destrano fluorescente (rosso) al momento dell&#39;induzione ictus consente l&#39;identificazione dei singoli neuroni con assoni danneggiati da ictus. La maggior parte delle etichette avviene in assoni all&#39;interno Layer 5 e 6 neuroni in corteccia sensorimotorie primarie sovrastanti la corsa. Immagine rappresenta 7 giorni successivi a ictus. Scala bar = 500 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53404/53404fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53404/53404fig4.jpg" /> Figura 4:. Microdissezione di sostanza bianca lesioni del tratto per l&#39;utilizzo in biochimica e trascrizionali saggi co-iniezione di verde veloce al momento dell&#39;induzione ictus permette l&#39;identificazione precoce della regione feriti in 24 ore (A, pannello superiore). Immunoblotting per specifiche proteine ​​assonale può essere eseguita per dimostrare riduzioni nella regione di sola corsa (A, pannello inferiore). Nei punti di tempo più lungo, la regione di sostanza bianca ictus (pannello di sinistra) può essere focally sezionato senza un&#39;etichettatura specifica (B). Pannello superiore destro mostra regione della sostanza bianca dopo la rimozione della regione sezionato mentre il pannello inferiore destro mostra la regione sezionato della sostanza bianca contenente la corsa (B). PCR per i geni specifici oligodendrociti utilizzando RNA isolato da regioni sezionati dalla materia bianca (C). IL = omolaterale; CL = controlaterale; c = controllo; s = corsa. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Iniezione </td><td> Anteriore / posteriore </td><td> Mediale / laterale </td><td> Dorsale / ventrale </td></tr><tr height="21"><td align="right" heigHT = &quot;21&quot; style = &quot;height: 21px;&quot;&gt; 1 </td><td align="right"> 0.22 </td><td align="right"> 0.22 </td><td align="right"> -2.10 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height="21" style="height:21px;"> 2 </td><td align="right"> 0,70 </td><td align="right"> 0.15 </td><td align="right"> -2.16 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height="21" style="height:21px;"> 3 </td><td align="right"> 1.21 </td><td align="right"> 0.15 </td><td align="right"> -2.18 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: coordinate stereotassica per il metodo angolare laterale (in mm). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Iniezione </td><td> Anteriore / posteriore </td><td> Mediale / laterale </td><td> Dorsale / ventrale </td></tr><tr height="21"><td align="right" height = stile &quot;21&quot; = &quot;height: 21px;&quot;&gt; 1 </td><td align="right"> -0.75 </td><td align="right"> -0.96 </td><td align="right"> -2.10 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height="21" style="height:21px;"> 2 </td><td align="right"> -1.00 </td><td align="right"> -0.96 </td><td align="right"> -2.05 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height="21" style="height:21px;"> 3 </td><td align="right"> -1.25 </td><td align="right"> -0.96 </td><td align="right"> -2.00 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Coordinate stereotassica per posteriore Avvicinamento angolare (in mm).

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A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

A Corsa Versatile Modello murino di Subcortical bianco Materia per lo Studio della assonale degenerazione e bianco Materia Neurobiologia

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

a-versatile-murine-model-subcortical-white-matter-stroke-for-study

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.0K Views.  University of California, Los Angeles. Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Ricerca

Medicina

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Un modello murino di impianto di stent a livello dell&#39;arteria carotidea per lo Studio della restenosi

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

Un modello murino di emorragia subaracnoidea

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

DTI of the Visual Pathway - White Matter Tracts and Cerebral Lesions

DTI is a technique that identifies white matter tracts (WMT) non-invasively in healthy and non-healthy patients using diffusion measurements. Similar to visual pathways (VP), WMT are not visible with classical MRI or intra-operatively with microscope. DTI will help neurosurgeons to prevent destruction of the VP while removing lesions adjacent to this WMT. We have performed DTI on fifty patients before and after surgery between March 2012 to January 2014. To navigate we used a 3DT1-weighted sequence. Additionally, we performed a T2-weighted and DTI-sequences. The parameters used were, FOV: 200 x 200 mm, slice thickness: 2 mm, and acquisition matrix: 96 x 96 yielding nearly isotropic voxels of 2 x 2 x 2 mm. Axial MRI was carried out using a 32 gradient direction and one b0-image. We used Echo-Planar-Imaging (EPI) and ASSET parallel imaging with an acceleration factor of 2 and b-value of 800 s/mm&#178;. The scanning time was less than 9 min.
The DTI-data obtained were processed using a FDA approved surgical navigation system program which uses a straightforward fiber-tracking approach known as fiber assignment by continuous tracking (FACT). This is based on the propagation of lines between regions of interest (ROI) which is defined by a physician. A maximum angle of 50, FA start value of 0.10 and ADC stop value of 0.20 mm&#178;/s were the parameters used for tractography.
There are some limitations to this technique. The limited acquisition time frame enforces trade-offs in the image quality. Another important point not to be neglected is the brain shift during surgery. As for the latter intra-operative MRI might be helpful. Furthermore the risk of false positive or false negative tracts needs to be taken into account which might compromise the final results.

Diffusion tensor imaging (DTI) was performed to try to depict the major parts of the visual pathway. The goal was to use an FDA approved standard commercial workstation which could be used for everyday routine in order to try to reduce postoperative damage of the visual pathway in the patients.

DTI della via visiva - White Matter Tracts e lesioni cerebrali

DTI is a technique that identifies white matter tracts (WMT) non-invasively in healthy and non-healthy patients using diffusion measurements. Similar to ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Isolamento e Asportazione di Murine Aorta; Una tecnica versatile nello studio delle malattie cardiovascolari

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Un semplice Critical dimensioni femorale Difetto Modello in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

L&#39;ossigeno-glucosio Deprivazione e riossigenazione come<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemia-riperfusione Injury modello per lo studio barriera sanguigna del cervello Erettile

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

Anestesia, chirurgia e metodo di raccolta per la valutazione delle viti transpedicolari utilizzando un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello della colonna vertebrale della deriva

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...