Questo lavoro è stato sostenuto da NSERC concessione 386634. Vorremmo ringraziare i membri della Screaton Lab per le discussioni utili.

1. Preparazione dei reagenti, piatti, e celle <ol><li> Rendere 500 ml di tampone di lisi: 25 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 mM beta-glicerofosfato, glicerolo 5%. Conservare a 4 ° C. Immediatamente prima dell&#39;uso, aggiungere 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF), e 1 mM vanadato di sodio. Dopo questo passo, PMSF non è richiesto in ogni buffer di risciacquo. </li><li> Fai 20 ml di 10x Kinase Buffer: Tris 200 mM pH 7.5, 50 mM beta-glicerofosfato (FW 216), 2 mM vanadato di sodio. Aliquota in 1 ml provette e conservare a -20 ° C. Immediatamente prima dell&#39;uso, aggiungere 5 mM DTT. </li><li> Fai 20 ml di 10x tampone di M-ATP: 300 micron adenosina trifosfato (ATP), 66 mM MgCl 2, 33 MnCl mM 2. Aliquotare in 1 ml provette e conservare a -20 ° C. </li><li> Rendere 100 ml di 2x sodio dodecil solfato (SDS) tampone di lisi: 1,5 g base di TRIS, 20 ml di glicerolo, 30 ml di H 2 O. Sciogliere e regolare il pH a 6,8 con HCl. Aggiungere 40ml 10% SDS, regolare il volume a 100 ml. Aggiungere 25 mg di blu di bromofenolo. </li><li> Spot 4 ml di 25 ng / ml plasmide di espressione di mammifero che codificano un GST-chinasi 14 per bene in gruppi di 96 pozzetti e targhette di conseguenza. Seal e congelare le piastre a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> 1-2 giorni prima della trasfezione, le cellule cultura HEK293T in Modified Eagle Medium completo di Dulbecco (DMEM) + 10% siero fetale bovino (FBS) e antibiotici in un 37 ° C incubatore integrato con CO 2 (finale 5%). Passaggio con tripsina e non consentono lo stock di diventare&gt; 80% confluenti durante l&#39;espansione. Un minimo di 6 x 10 7 cellule sono necessari per lo schermo (circa 3 x 15 cm piatti di cellule HEK293T al 80% confluenza). </li></ol> 2. Trasfezione Nota: Vedere la Figura 1 per un diagramma di flusso intero protocollo. <ol><li> Se sono stati congelati piastre contenenti plasmidi chinasi, scongelare a temperatura ambiente unnd centrifugare a 1900 xg per 3 minuti per raccogliere l&#39;umidità al fondo dei pozzetti. </li><li> Mescolare 8,6 ml di mezzo di siero ridotta (ad esempio, OPTI-MEM) con 312,7 ml di base lipidica trasfezione reagente. Lasciate riposare per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzo di siero ridotto a ciascun pozzetto usando un dosatore automatico provvisto di un piccolo volume di cassette. </li><li> Aggiungere 10 ml per pozzetto di riduzione a medio siero / trasfezione miscela reagente dal punto 2.2 utilizzando un dosatore automatico provvisto di un piccolo vassoio di volume. Lasciate riposare per 20 a 45 minuti. </li><li> Risospendere le cellule 293T a 7,5 x 10 5 cellule / ml a 80 ml ​​di DMEM completo. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare (cioè 7,5 x 10 4 cellule) per pozzetto utilizzando un dosatore automatico munito di una cassetta volume standard. </li><li> Controllare pozzi al microscopio per la distribuzione cellulare uniforme e tornare a incubatore per 24 ore. </li></ol> Pulldown 3. GST-chinasi <ol><li> Fai fresh: 4 mm soluzione pervanadate mescolando 60 ml di 0,2 M vanadato di sodio con 540 ml di H 2 O. In una seconda miscela tubo 2,7 ml di perossido di 30% e 1,4 ml di PBS. Aggiungere le due soluzioni insieme e lasciate riposare per 15 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Usando una pipetta multicanale (non utilizzare un distributore automatico di liquido in quanto crea troppa turbolenza nel pozzo) dispensare 2 ml di 0,25 M CaCl 2 in ogni pozzetto, seguiti da 2,5 ml di pervanadate preparato al punto 3.1. Incubare ogni piastra a 37 ° C per 10 min e poi posto su ghiaccio. </li><li> Preparare 35 ml di tampone di lisi con l&#39;aggiunta di DTT, PMSF e vanadato di sodio come indicato nella Sezione 1 (Preparazione dei reagenti). </li><li> Mantenere le piastre in ghiaccio, rimuovere media da ogni pozzetto usando un aspiratore a vuoto. Aggiungere immediatamente 50 ml / pozzetto di tampone di lisi freddo ghiaccio utilizzando un dosatore automatico munito di una cassetta standard. Lasciare riposare 30 minuti in ghiaccio per Lyse (opzionale: può fermare qui, se necessario, plat di tenutaE e memorizzazione a -80 ° C. Per continuare, piastre disgelo su ghiaccio). </li><li> Piastre far girare a 1900 xg per 3 minuti a 4 ° C. </li><li> Raschiare le cellule da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e trasferire tutti i contenuti per etichettato in modo appropriato piastre 96 e V-bottom. Piastre far girare a 1900 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Durante la rotazione, riempire piastre rivestite glutatione (uno per ogni piastra a 96 pozzetti) con 100 l / pozzetto di ghiaccio tampone di lisi freddo (senza PMSF) come un risciacquo. Mantenere le piastre in ghiaccio. </li><li> Rimuovere piastre V-bottom dalla centrifuga. Uno alla volta, capovolgere le piastre di glutatione su un lavandino per scuotere il tampone di lisi e macchia su un tovagliolo di carta. Trasferire tampone di lisi dalle piastre V-bottom alle piastre glutatione inclinando la piastra e con una pipetta multicanale, facendo attenzione a non disturbare il pellet sul fondo. Coprire e lasciare le piastre in ghiaccio per un minimo di 2 ore per legare. </li><li> Vicino alla fine della fase di legame 2 hr, preparare una workstation radioattività, garantendo tegli necessarie precauzioni di sicurezza sono in atto per il lavoro radioattivo. Impostare fornetto di 30 ° C. </li><li> Preparare 200 ml di tampone di lisi aggiungendo DTT e sodio vanadate come indicato nella Sezione 1. PMSF non è necessario in questa fase. </li><li> Capovolgere le piastre di glutatione su un lavandino per scuotere il tampone di lisi e asciugare su un tovagliolo di carta. Sciacquare pozzi 3x con 100 microlitri tampone di lisi (senza PMSF). Non lasciate che i pozzi si siedono a secco - tenerli in risciacquo fino al momento di procedere. </li><li> Preparare 55 ml di tampone chinasi 1x (KB) diluendo lo stock 10x e l&#39;aggiunta di DTT come indicato nella Sezione 1. placche Sciacquare una volta con 50 ml di 1x KB utilizzando un dosatore automatico dotato di una cassetta volume standard. Lasciare 1x KB in pozzi fino a quando la soluzione A è pronta: <ol><li> Preparare una soluzione aggiungendo 500 a 530 ug del substrato di interesse, 500 mg di proteina basica della mielina (MBP), 2,65 ml di 10x KB, 13.25 ml di 1 M DTT e H 2 O fino a 15,9 ml. </li></ol></li&gt; <li> Uno alla volta, capovolgere le piastre su un lavandino per rimuovere 1x KB risciacquo, asciugare su carta assorbente, e subito aggiungere 30 ml di soluzione A utilizzando un dosatore automatico provvisto di un piccolo volume di cassette. Mantenere le piastre in ghiaccio. </li><li> Preparare Soluzione B nell&#39;area di lavoro radioattività aggiungendo 2,5 ml 10x M-ATP, 500 pCi gamma- 32 P ATP, e H 2 O a 10 ml. <ol><li> Aggiungere 20 ml di soluzione B per bene con una pipetta repeater che aiuta nel mescolare dovuto alla forza di espulsione. Coprire e incubare a 30 ° C ibridazione forno per 30 min. </li></ol></li><li> Dopo 30 minuti, trasferire lastre di nuovo al ghiaccio. Aggiungere 50 ml di tampone di lisi 2x SDS in ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Può procedere a questo punto il passo successivo, o sigillare le piastre con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C fino conveniente. </li></ol> 4. Esecuzione, colorazione, e gel di essiccazione Nota: Tutti i lavori devono essere eseguiti in una zona DESIGNAted per la radioattività. <ol><li> Accendete il forno di ibridazione e impostato a 85 ° C. Piastre scongelare a temperatura ambiente. Una volta che il forno ha raggiunto la temperatura, piastre di trasferimento a forno e incubare per 10 minuti a denaturare campioni. </li><li> Carico di 26 e gel prefabbricati con 15 ml di ogni reazione utilizzando una pipetta multicanale per riempire diversi pozzi in una sola volta. Bisogna fare attenzione che tutti i suggerimenti siano allineati con le corrispondenti bene prima di aggiungere i campioni. Eseguire gel a 150 V. Non lasciate che il colorante inseguimento (linea blu) scappare del fondo del gel come questo contiene il prive di personalità giuridica ATP. </li><li> Smontare i gel e tagliare la prive di personalità giuridica ATP (linea blu) con un bisturi o un bordo dritto come sarà sovraesporre i film. Mettere il gel in contenitori etichettati e coprire con macchia Coomassie per 15 min. </li><li> Rimuovere la macchia Coomassie, sciacquare brevemente il gel con acqua e aggiungere Decolorare soluzione. Decolorare i gel finché le proteine ​​sono chiaramente visibili. Una band per MBP e una banda per il substrato dovrebbevisibile per ogni campione. </li><li> Per asciugare i gel: <ol><li> Tagliare un grande foglio di carta da filtro e posizionarlo sul asciugatrice. </li><li> Bagnate un foglio di cellophane in acqua distillata fino a che non è liscia e ruga libero, e posizionarlo sulla parte superiore del foglio. </li><li> Disporre il gel sulla parte superiore del foglio di cellophane, prendendo nota dell&#39;ordine di gel. Bagnare un secondo foglio di cellophane e posto sulla sommità del gel. </li><li> Stendere tutte le bolle (un rullo di tenuta piatto funziona bene per questo) per una superficie bella uniforme. Chiudere il lembo, attivare il vuoto, ed asciugare il gel per 3 ore a 80 ° C. </li></ol></li><li> Una volta che i gel sono asciutti, esporli a pellicola XAR utilizzando uno schermo per intensificare il segnale. Avvolgere la cassetta con involucro di saran o un sacchetto di plastica e sigillare con nastro adesivo per tenere fuori gelo. Conservare la cassetta a -80 ° C durante la notte. </li></ol> 5. Sviluppare XAR Films <ol><li> Il giorno seguente, rimuovere cassetta dal freezer e lasciare scongelare a temperatura ambiente. Sviluppare il film inuna camera oscura utilizzando un processore pellicola secondo le istruzioni del produttore. Nota: Esaminare i film per la prova di coppie chinasi-substrato. Una seconda esposizione più lunga può anche essere utile per rilevare eventi di fosforilazione più deboli. </li></ol>

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	<li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites.">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).</li><li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications.">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li><li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser/Thr-based+signaling.">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li><li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , (2006).</li><li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling.">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li><li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity.">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li><li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomics:+methods+for+deciphering+the+kinome.">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains.">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips.">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li><li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases.">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li><li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKIS:+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites.">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247 (2013).</li><li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling.">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li><li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2.">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li><li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways:+control+of+CRTC2/TORC2+by+the+AMPK+family.">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li><li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion.">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Poiché le pubblicazioni originali descrivono l&#39;approccio 14,15, la libreria originale di 180 GST-chinasi è stata ampliata per 420 membri, o ~ 80% della proteina kinome umana. Con la libreria espanso, il protocollo come descritto richiede 4-5 giorni e poi 1-4 giorni per sviluppare film (se ritenuto necessario), che può essere ridotto mediante l&#39;uso di phosphorimaging e valorizzazione segnale digitale. Ci sono diversi passaggi chiave in cui occorre prendere cura (vedi figura 1 per una panoramica di protocollo). In primo luogo, è la salute dello stock di cellule (micoplasmi libera, mai permesso di raggiungere la confluenza durante l&#39;espansione, e trattati con tripsina ad ogni passaggio) durante la fase di espansione batch e nelle piastre da 96 pozzetti al momento della transfezione. Le cellule devono essere uniformemente testa di serie, e l&#39;80% confluenti quando trasfezione ha luogo (punto 1.5). In secondo luogo, è ideale durante la trasfezione di utilizzare un dosatore automatico per minimizzare il volume trasfer errori, limitando in tal modo il coefficiente di variazione (&quot;cvs&quot;) tra i pozzi. Per i piccoli volumi, montaggio il distributore con un volume più piccolo perdita limiti cassette di reagente a causa di volumi morti ridotti e aumenta la precisione di erogazione. La fase di trattamento con pervanadate sodio, un inibitore della tirosina fosfatasi pan, è usato come stimolo generale per aumentare stato di fosforilazione delle chinasi bersaglio. Inclusione di calcio in questa fase aumenta l&#39;adesione cellula-matrice, evitando la perdita di cellule a causa degli arrotondamenti indotta da trattamento pervanadate prolungato. Questo passo dovrebbe essere fatto con rigoroso rispetto del tempo di incubazione di 10 minuti. In terzo luogo, per la chinasi test in sé, ci sono diverse considerazioni nella scelta del substrato ricombinante: peptidi, domini proteici, o proteine ​​intatte grandi come 120 kDa possono tutti essere usati. Se un sito di fosforilazione specifico è noto, un substrato peptidico è l&#39;approccio più straight-forward, ma deve essere abbastanza grande da rilevaresu un gel SDS-PAGE. Pertanto, i substrati peptidici possono essere fuse a GST e purificate da batteri per dare un MW di&gt; 25. Proteine ​​più grandi hanno il vantaggio che essi possono piegati e loro residui fosforilabili esposti come sarebbero nella cella, ancora giunto con l&#39;inconveniente che includeranno residui aggiuntivi che potrebbero essere fosforilato e dare il segnale nel saggio. La nostra preferenza è di eseguire uno schermo mediante un substrato peptidico composto di 15-20 aminoacidi che circondano un residuo che è noto per essere fosforilata in vivo ed è noto regolare evento biologico, poiché questo rende convalida delle chinasi candidati dalla schermata sia in vitro e in vivo molto più velocemente. Ultimo, idealmente la quantità di approcci di proteine ​​o superiore a 1 mg per bene; questo naturalmente varia con la MW del substrato. Meno proteine ​​per bene può produrre risultati significativi, ma il &#39;di più è meglio&#39; regola si applica in quanto aumenta il segnale: noise. Standard, gel non gradiente sono raccomandati come gel gradiente crepa troppo spesso durante l&#39;asciugatura. Dopo l&#39;essiccazione il gel, il rilevamento di un segnale radioattivo su sfondo con un contatore Geiger dà un&#39;ottima indicazione del successo del test. Poiché lo schermo è in vitro ed esistono ulteriori livelli di complessità in vivo, una chinasi candidato (s) per un determinato substrato deve essere convalidato in cellule. In particolare, lo schermo può identificare un membro della famiglia che ha la capacità biochimica di fosforilare il substrato in vitro, ma non è espresso nello stesso tipo cellulare o nello stesso compartimento subcellulare come substrato. Ad esempio, mentre MARK2 e MARK3 erano entrambi risultati in una schermata per chinasi che può fosforilare CRTC2 sulla Ser275, solo MARK2 formato un complesso con il substrato in cellule 14. La seguente è una serie di esperimenti supplementari che possono essere utilizzati per confermare la rilevanza fisiologica di una chinasi candidato. Abetest, mobilità spostamenti del substrato su SDS-PAGE seguito coespressione della chinasi candidato può essere utilizzato come controllo conferma. Controlli appropriati tale cotrasfezione di una chinasi attività catalitica in grado di confermare la specificità. In secondo luogo, il substrato può essere immunoprecipitata da estratti cellulari che sono stati incubati con 32 P-ortofosfato per confermare l&#39;incorporazione di fosfato nel substrato in presenza del tipo selvatico e non una chinasi cataliticamente inattiva. In terzo luogo, un anticorpo phosphospecific può essere generato contro la sequenza phosphoacceptor (se conosciuto) e usato per confermare un aumento della fosforilazione del substrato quando la chinasi è sovraespresso. Uno schermo secondario con un substrato mutante con un residuo non fosforilabile al sito bersaglio può confermare la specificità prima generazione di un phosphoantibody, un controllo particolarmente importante con grande dominio e proteina intera substrati. Inibizione farmacologica approcci per inibire un candiData chinasi può essere utilizzato anche, ma la cautela deve essere esercitata come l&#39;inibizione della chinasi correlate è una realtà sottovalutata. Ultimo, silenziamento della chinasi candidato (s) in cellule RNAi mediata seguita e western blotting per controllare la perdita di fosforilazione sito bersaglio con un anticorpo phosphospecific può essere effettuata.

Proteina modificazioni post-traduzionali (PTM) sono essenziali per la comunicazione intracellulare. Forse il più studiato di tutti PTM è fosforilazione, catalizzata da proteina chinasi, che regolano una miriade di funzioni proteiche, compresa la loro attività biochimica, localizzazione subcellulare, conformazione e stabilità. L&#39;individuazione dei siti di fosforilazione di proteine ​​bersaglio può essere eseguito la mappatura fosfopeptide trittico o mediante tecniche di proteomica ormai standard che utilizzano i campioni arricchito da peptidi fosforilati 1,2. Mentre tre quarti del proteoma espresso dovrebbero essere fosforilata 3 e identificate 200.000 siti di fosforilazione 5, con stime fino a 1 milione 6, molti di questi non hanno biologia assegnato, percorso di segnalazione, o proteine ​​chinasi. Mentre individuazione dei siti fosforilazione è relativamente semplice, una sfida comparativamente più grande è quella diidentificare la chinasi affine (s) che gli obiettivi di questi siti, un processo che chiamiamo mappatura chinasi: coppie di substrato. Diversi approcci per identificare chinasi: coppie di substrato sono stati descritti, sia partendo con una chinasi di interesse e cerchi suoi substrati o iniziare con un substrato di interesse e il tentativo di trovare una chinasi modificante sperimentalmente 7-11 o computazionalmente 12. Per identificare chinasi per un noto substrato fosforilato, bioinformatica possono essere utilizzate per identificare le proteine ​​che contengono una breve sequenza di amminoacidi conservati che fiancheggiano il residuo fosforilato (sito consensus), nonché individuare chinasi che formano un complesso precipitable con il substrato. Tuttavia, questi approcci sono in termini di tempo e spesso non hanno successo. Abbiamo sviluppato un approccio funzionale sistematica di individuare rapidamente chinasi che può fosforilare un determinato substrato 13. Il saggio schermo produce eccellente specificolità, con molto chiara selezione di potenziali chinasi affini. Data la centralità della fosforilazione di segnalazione biologica, lo schermo è utile per la scoperta in quasi tutti i cellulari vie di segnalazione 14-16. Lo schermo comporta l&#39;esecuzione di un test chinasi larga scala con una libreria di proteine ​​chinasi umani. Le chinasi sono state contrassegnate con glutatione batterica S-transferasi (GST) proteine ​​e sono purificato da estratti cellulari di mammifero, il che significa che gli enzimi ricombinanti - a differenza di quelli preparati da batteri - sono generati in presenza delle proteine ​​chinasi a monte spesso necessari per la enzimi ricombinanti hanno attività in vitro. Infatti, mentre l&#39;attività della chinasi serina, treonina e tirosina per l&#39;attivazione della chinasi a valle sono presenti nel lievito 10, il genoma di lievito codifica 122 protein chinasi, indicando che il kinome mammiferi, con oltre 500 geni 17, è diventato molto più complesso per regulaTE i processi unici per gli organismi di ordine superiore. Inoltre, l&#39;effetto di diversi stimoli rilevanti alla biologia cellulare e malattie umane (quali piccole molecole, fattori di crescita, ormoni, ecc) può essere utilizzato per attività chinasica 14,15 modulate in un contesto appropriato.

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&amp;nbsp;U/ml penicillin, 100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (20-200 &amp;#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (1-10 &amp;#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione coated 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST tagged substrate</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&amp;nbsp;ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.4</td></tr><tr><td>26-well precast TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10% acetic acid, 20% methanol</td></tr><tr><td>Labeled gel containers</td><td>Made in house</td><td></td><td>Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel</td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane sheets (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Double emulsion autoradiography film</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensifying screen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening

Abbiamo sviluppato una piattaforma di screening per identificare proteine ​​chinasi dedicati umani per substrati fosforilati che possono essere utilizzati per delucidare nuovi percorsi di trasduzione del segnale. Il nostro approccio è caratterizzato dall&#39;uso di una libreria di purificate protein chinasi umana GST-tag e una proteina ricombinante di interesse substrato. Abbiamo utilizzato questa tecnologia per identificare MAP / microtubuli affinità regolazione chinasi 2 (MARK2) come chinasi per un sito di glucosio-espresso nelle CREB-regolato trascrizionale coattivatore 2 (CRTC2), una proteina necessaria per la proliferazione delle cellule beta, nonché la famiglia di tirosina chinasi Axl come regolatori di metastasi delle cellule di fosforilazione della proteina dell&#39;adattatore ELMO. Descriviamo questa tecnologia e discutiamo come può aiutare a stabilire una mappa completa di come le cellule rispondono agli stimoli ambientali.

I risultati rappresentativi di uno schermo sono illustrati nella Figura 2. 180 chinasi sono stati proiettati utilizzando un peptide substrato GST-tag corrispondenti a aa 268-283 da CRTC2 così come la proteina basica classico saggio di chinasi substrato mielina (MBP). Solo due chinasi, MARK2 e altamente connessi MARK3 chinasi fosforilate il peptide CRTC2. MBP è incluso come controllo interno in tutti i saggi, in quanto contiene molti residui fosforilabili e funziona a 18 kDa, verso il fondo del gel. Questo permette una interpretazione di specificità: alcuni chinasi sarà robusta fosforilare un substrato e MBP. Da notare qui è che i pozzetti contenenti solo GST (ad esempio i controlli senza chinasi) purificano sempre qualche attività chinasi endogena, quindi c&#39;è sempre sfondo fosforilazione nel dosaggio. Anche se questo non esclude che la fosforilazione del substrato è reale, suggerisce che in vitro in impostazione chinasi può essere meno selettiva.E &#39;particolarmente informativo per includere più substrati di diversa MW di trarre conclusioni sulle chinasi-specificità di substrato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso che mostra passaggi chiave del protocollo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53152/53152fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig2.jpg" /> Figura 2. Esempio di esito schermo. Autoradiografie di uno schermo di versione 1 della biblioteca (180 protein chinasi umani) eseguita utilizzando substrati GST-peptide corrispondente alla aa 268-283 di topo CRTC2 (riprodotto da Jansson et al., 2008). MBP, è indicato proteina basica della mielina. L&#39;elevato grado di sselezione ubstrate da chinasi correlate è una caratteristica dello schermo. Ciascuna corsia rappresenta i prodotti di reazione di un saggio chinasico distinta. MARK3 (Gel 1) e MARK2 (Gel 16), gli unici chinasi di fosforilano TORC2 268-283 peptide, sono indicati. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53152/53152fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Ricerca

Biochimica

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Un metodo semplice per identificare le cinasi che regolano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali mediante screening di inibitori ad alta percentuale

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Biologia dello sviluppo

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Screening dell'inibitore della kinasi in microarray proteici umane auto-assemblati

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biologia

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Bioingegneria

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...