Name: Video: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 11.8K Views. Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Apprezziamo Sarissa biomedica per il loro lavoro nello sviluppo dei sensori utilizzati nel presente manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122.662 (A. Staruschenko e A. Cowley), un progetto finanziato dal Medical College of commissione per gli affari di ricerca Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e avanzando un sano Wisconsin Programma di Ricerca e Formazione # 9.520.217, e il giovane Investigator Grant del National Kidney Foundation (O. Palygin).

Le seguenti procedure sugli animali aderito alla guida NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. L&#39;approvazione preventiva è stato ottenuto dalla cura e l&#39;uso Comitato istituzionale animali (IACUC). NOTA: Revisione delle istruzioni del produttore del sensore dovrebbe essere fatto durante la progettazione dell&#39;esperimento e prima del loro utilizzo. Seguendo queste istruzioni produrrà risultati ottimali quando si utilizzano i sensori. 1. Calibrazione sensore <ol><li> Preparare soluzioni fresche prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Creare tampone A contenente 10 mM tampone napi, NaCl 100 mM, 1 mM MgCl 2, e glicerolo 2 mM. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Conservare a 2-8 ° C. </li><li> Usando una concentrazione di ATP magazzino (100 mm) conservati a -20 ° C, creare una nuova soluzione di calibrazione 10 mM ATP con l&#39;aggiunta di 10 microlitri magazzino a 90 ml di tampone A. </li><li> Reidratare il sensore ATP posizionando la punta (Figura 2) in tegli camera di reidratazione contenente tampone A per almeno 10 minuti a 2-8 ° C. NOTA: Dopo la reidratazione, i sensori non deve essere esposto all&#39;aria per più di 20 secondi o la sensibilità del sensore può essere ridotta. Se si prevedono lunghe esposizioni all&#39;aria, immergere il sensore per breve tempo in una soluzione di glicerolo. I sensori possono essere utilizzati per diversi esperimenti, ma questi devono avvenire lo stesso giorno come sensore di reidratazione. I sensori possono essere memorizzati nella camera reidratazione con tampone A fino a 24 ore. </li><li> Accendere potenziostato doppio canale (figura 3) e avviare il software di sistema di registrazione. </li><li> Preparare una camera di taratura con 3 ml di tampone A. Inserire l&#39;elettrodo di riferimento nella camera di calibrazione. Prendere ogni sensore dalla camera di reidratazione, quindi collegarlo al manipolatore e inserirla nella soluzione di camera di taratura. NOTA: Utilizzare un siliconato capsula di Petri standard come una camera di taratura. Effettuare tutte le calibrazioni e studies in una gabbia di Faraday su un laboratorio tavolo aria ottimizzata per ridurre il rumore del segnale durante le registrazioni Amperometry (Figura 4). Le calibrazioni sono meglio farlo il più vicino l&#39;inizio della raccolta dei dati il ​​più possibile. Per le applicazioni in vivo il tempo ottimale per la taratura durante il periodo di animale recupero post-operatorio. </li><li> Ex vivo di calibrazione <ol><li> Eseguire voltammetria ciclica nella camera di calibrazione pedalando sensori da -500 mV a +500 mV ad una velocità di 100 mV / sec per 10 cicli. Questo migliora notevolmente la sensibilità dei sensori. Vedere la Figura 5 per le tracce osservate dai 10 cicli. </li><li> Polarizzare sensori al 600 mV dopo l&#39;ultimo ciclo. La corrente del sensore decadrà a un asintoto. Una lettura stabile si ottiene dopo un minimo di 5 min. Registrare la lettura dello zero. </li></ol></li><li> Calibrazione del sensore vivo in <ol><li> Non eseguire la voltammetria ciclica sul senso in vivors. Invece, polarizzare il sensore nella camera di calibrazione per 30 sec a +500 mV. Quindi impostare il potenziostato a 0 mV e consentire al corrente del sensore a salire a un asintoto. La corrente del sensore ci vorranno almeno 2 minuti per asintoto. Registrare la lettura dello zero. </li></ol></li><li> Consecutivamente aggiungere set quantità di soluzione di ATP nella camera di produrre una linea di taratura che comprende un campo di rilevamento desiderata. La soluzione ATP produce un forte picco nel segnale del sensore inizialmente, seguito da un decadimento come ATP diffonde uniformemente in tutta la camera. Valori segnale di registrazione una volta che il livello del segnale è stabilizzata dopo ogni aggiunta di ATP. Figure 6A e 7 mostrano tracce e suggerito concentrazioni di ATP sia ex vivo e in vivo, rispettivamente. NOTA: E &#39;importante confermare la selettività degli elettrodi usando spazzini degli analiti. Il presente protocollo utilizzato apyrase per testare la specificità del sensore ATP e catalasi per l&#39;H &lt;sub&gt; 2 O 2 segnale (figure 6B). Se i farmaci sono da somministrare, misure della loro reattività con i sensori devono essere determinati prima dello studio. </li><li> Aggiungere 3 ml di apyrase da uno stock di 2 mg / ml (89 UN / mg) per verificare la specificità del sensore ATP (la corrente prodotta dall&#39;applicazione ATP dovrebbe ridurre al livello zero (Figura 7). </li><li> Aggiungere 3 ml di catalasi da uno stock di 2mg / ml (100 UN / mg) per testare la specificità del sensore nullo (la corrente prodotta da H 2 O 2 applicazione dovrebbe ridurre la lettura zero). </li></ol> 2. Chirurgia Animale Per Gli Studi Sensor <ol><li> Intervento chirurgico per ex vivo <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale sperimentale con isoflurano (5% di induzione, 1,5-2,5% manutenzione) / medico di grado O 2 o altro metodo riconosciuto. 15 &#39;12 Gli animali devono essere continuamente monitorate al fine di garantire un adeguato livello di anestesia. Stin grado respiratorio reazione votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l&#39;anestesia corretta. Nota: Euthanize l&#39;animale secondo protocolli IACUC approvati. Al termine di tutte le procedure non sopravvivenza eutanasia animali profondamente anestetizzati da toracotomia inducendo pneumotorace per garantire la scomparsa umana dell&#39;animale 12. </li><li> Posizionare il ratto su un tavolo operatorio temperatura controllata in posizione supina. Pur mantenendo una profondità adeguata anestetico, fare una incisione mediana di circa 5 cm in linea con il rene sinistro ed esporre l&#39;aorta addominale distale. </li><li> Avvolgere una legatura attorno al celiaca e arterie mesenterica superiore, e l&#39;aorta addominale sopra queste arterie, ma non legare. Avvolgere due legature intorno all&#39;aorta addominale al di sotto delle arterie renali. </li><li> Bloccare l&#39;aorta addominale sopra le legature. Legare la legatura inferiore. Cateterizzare l&#39;aorta addominale con tubo in polietilene (PE50). Fissare il catetere con la seconda legatura dell&#39;aorta. </li><li> Rimuovere il morsetto e legare le mesenterica e celiaci arterie. Profumato il rene a 6 ml / min con soluzione salina bilanciata Hanks a temperatura ambiente per 2-3 minuti fino a quando il rene è completamente imbiancato. </li><li> Asportare il rene ed il catetere, connessa porzione dell&#39;aorta. Posizionare il rene in una piastra di Petri da 3 ml riempita di soluzione del bagno. Nota: protocollo esperimento può essere eseguita a temperatura ambiente. La soluzione del bagno contiene in mM: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7,35 regolato con NaOH. </li></ol></li><li> Intervento chirurgico per in vivo <ol><li> Anestetizzare il topo utilizzando protocolli IACUC approvati. Per l&#39;analisi in vivo anestetizzare i ratti con ketamina (20 mg / kg IM) e inactin (50 mg / kg ip). Gli animali devono essere costantemente monitorati per garantire un adeguato livello di anestesia. Una reazione respiratoria stabile votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l&#39;anestesia corretta. </li><li> Dopo adeguata profondità dell&#39;anestesia è ottenereed, posizionare il ratto in posizione supina su una superficie a terra temperatura controllata situata sul tavolo dell&#39;aria. La superficie deve essere preriscaldato e mantenuta a 36 ° C. </li><li> Pur mantenendo un&#39;adeguata profondità dell&#39;anestesia, fare una incisione mediana circa 5 cm in linea con il rene. </li><li> Utilizzare una sutura per deviare e ancorare il tessuto cutaneo e sottocutaneo in modo che l&#39;intero organo è visibile. Posizionare il rene in una tazza rene per ridurre al minimo eventuali artefatti da movimento. </li><li> Utilizzare infusione IV del 2% BSA: 0,9% NaCl a 1 ml / 100 g / h attraverso la vena giugulare di mantenere il volume del sangue. Cannulare entrambi gli ureteri per la raccolta delle urine. Posizionare le fasce intorno mesenterici e celiaci arterie superiori e l&#39;aorta distale per la manipolazione della pressione di perfusione renale (Figure 10A). </li><li> Se è richiesta l&#39;applicazione di agenti farmacologici durante gli esperimenti in vivo, l&#39;inserimento di un catetere interstiziale è raccomandato (Figure 10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> Setup 3. Acquisizione Dati <ol><li> Aprire il programma di acquisizione dati e impostare la polarità sia ex vivo e in vivo per anodica positiva. Impostare il programma per salvare i dati come codice ASCII. </li><li> Posizionare i micromanipolatori per rapido inserimento dei sensori nelle reni. NOTA: In alternativa, utilizzare una sonda fittizia attaccato al micromanipolatore per contribuire a realizzare il posizionamento desiderato di sensori. </li><li> Ex vivo acquisizione dati <ol><li> Profumato rene con soluzione del bagno (da 2.1.6) tramite l&#39;aorta cannulata a una velocità costante di 650 microlitri / min. Utilizzando le forbici chirurgiche, rimuovere con attenzione la capsula renale, che è necessaria per l&#39;inserimento del sensore. </li><li> Fissare il rene con elastici legati sopra il rene e collegati al piatto siliconata con perni. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo di riferimento vicino al rene nella capsula di Petri con la punta sommersala soluzione tampone. </li></ol></li><li> In acquisizione dei dati in vivo <ol><li> Posizionare il rene in una tazza rene. A seconda del ceppo e l&#39;età dell&#39;animale utilizzare una dimensione di coppa che contiene il rene liberamente. Figura 8 mostra due dimensioni di tazze renali. Tazze simili sono utilizzati per approcci fisiologici differenti focalizzati sull&#39;analisi della funzione renale come micropuntura ecc 16. Nota: La posizione della coppa rene è fondamentale per eliminare il rumore meccanico prodotto dalla respirazione animale, ma non dovrebbe interferire con o bloccare perfusione renale o flusso di urina. </li><li> Lasciare 45 minuti di tempo di recupero prima di eseguire la raccolta dei dati. </li><li> Utilizzando un ago 26-30G, forare foratura nella posizione desiderata e la profondità del sensore nel rene. Asciugare il foro superficie per rimuovere il sangue trasudato. Aggiungere la soluzione di glicerolo alla superficie del rene. Questo consentirà di evitare la superficie rene si secchi durante l&#39;esperimento. </li&gt; <li> Togliere il primo sensore dalla camera di reidratazione e collegarlo al micromanipolatore. Rapidamente, entro 20 secondi, inserire l&#39;elettrodo nel foro appena creata nel rene. Ripetere i passaggi 3,5-3,9 per il sensore nullo. </li><li> Inserire l&#39;elettrodo di riferimento nel rene, circa 1 cm dal dai sensori. </li></ol></li><li> Accendere potenziostato e attivare il programma di registrazione sul computer. La Figura 9 mostra la configurazione finale del rene ex vivo di acquisizione dati. La figura 10 mostra la configurazione finale del rene in vivo acquisizione dati con un catetere inserito. </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Importare il file di dati ASCII in origine o qualsiasi altro software simile. </li><li> Relazione corrente Concentrazione <ol><li> Utilizzare la funzione di adattamento / estrapolare lineare per costruire una concentrazione lineare (asse x) di corrente (asse y) relazione per l&#39;ATP o H 2 </sub&gt; O 2 punti di taratura (figure 6 e 7). Linea fit lineare: y = mx + b </li></ol></li><li> Equiparare la corrente alla concentrazione </li><li> Sottrarre le tracce misurati del sensore nullo da quelli del sensore ATP per ottenere la corrente attuale prodotta da ATP intracellulare. </li><li> Convertire i valori ATP pA ottenuti dalla amperometria a Nm utilizzando l&#39;equazione di taratura descritto in 4.2.1. Determinare la concentrazione della traccia dati sottratto del sensore ATP importando ogni corrente regolata nel valore &quot;x&quot; e risolvendo per y (la concentrazione di analita). </li><li> Analogamente, calcolare la concentrazione di H 2 O 2 dalla sua equazione di taratura se necessario. </li></ol>

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Sensori per la registrazione video di questo manoscritto sono stati forniti da Sarissa biomedica Limited (Coventry, UK).

Gli attuali protocolli sono stati sviluppati per fornire una maggiore risoluzione temporale e spaziale di ATP e H 2 O 2 di segnalazione per ex vivo isolati, perfusione e in vivo reni sangue-perfusione. Le differenze tra i protocolli ei sensori utilizzati qui garantiscono l&#39;acquisizione dei dati ottimale sia per gli agenti farmacologici o studi fisiologici. I protocolli sono costituiti da 1) calibrazione del sensore, 2) intervento chirurgico, 3) l&#39;installazione di acquisizione dati, e 4) analisi dei dati. Permettono le misurazioni in tempo reale di analiti per numerose condizioni sperimentali. Questo porterà a una maggiore approfondimenti malattie renali e lo sviluppo di più efficaci trattamenti farmacologici. Qui abbiamo usato sensori per analizzare ATP e H 2 O 2. Tuttavia, sensori per altre sostanze sono anche disponibili e possono essere utilizzati. I protocolli descritti qui sono stati applicati per studiare ATP e H 2 O 2 in reni di ratto, ma lo stesso metod può essere facilmente regolato per l&#39;applicazione nei topi. Così, questo approccio ha un grande potenziale vista l&#39;abbondanza di modelli di roditori genetici. Il disegno di base di biosensori microelettrodi enzimatici è stato sviluppato nel 1960 da Clark e Lione 2. In seguito allo sviluppo iniziale di biosensori, i progressi sono stati fatti sia nel design 17-19 e 20 applicazioni. Llaudet et al. 21,22 sviluppato la struttura fondamentale del ATP sensori utilizzati nella presente protocolli durante l&#39;utilizzo di metodi di Cosneir et al. 23 per il rivestimento enzima. Questi sensori hanno rilevato segnalazione ATP in una serie di processi fisiologici, tra cui ATP rilascio dagli astrociti cerebrali 8, regolazione di respirare 4,24, e nel muscolo scheletrico regolazione arteriole 25. Recentemente il protocollo ex vivo è stato usato per misurare la segnalazione ATP nei reni 12. L&#39;obiettivo di questo manoscritto is per fornire indicazioni efficaci e approfondimenti per l&#39;individuazione di sostanze endogene come ATP nei reni. Biosensori enzimatici microelettrodi hanno molti vantaggi rispetto mezzi esistenti per misurare analiti in vivo. Tuttavia, precauzioni particolari dovrebbero essere utilizzati per questo approccio per qualsiasi altro nuovo metodo. Convalida con un approccio consolidato fornisce fiducia nei dati ottenuti. Ad esempio, sono state effettuate le misurazioni di microdialisi come descritto in precedenza 26,27. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra le concentrazioni di picco determinati dai sensori e quelli ottenuti dai campioni di dialisi 12. La limitazione di microdialisi è che misura solo i livelli allo stato stazionario di analita. Come tale, la valutazione delle variazioni dinamiche nella cella di segnalazione può essere raggiunto solo con l&#39;uso dei biosensori enzimatici microelettrodo. Le specifiche manifattura dei tempi di risposta dei sensori differiscono fra sensoretipi. ex vivo sensori hanno un tempo di risposta di 5-10 sec e in vivo di sensori 30-35 sec per la salita del segnale da 10 al 90%. Le tracce di taratura (figure 6 e 7) dimostrano la risoluzione temporale dell&#39;analita aggiunta / rimozione. Per entrambi gli approcci sensori e di microdialisi, l&#39;uso di enzimi specifici per bloccare il segnale prodotto dal analiti è necessario per garantire la specificità. I protocolli descritti hanno molte sfide. Come con qualsiasi inserimento sensori nel tessuto, si verifica il danno tissutale. Ciò potrebbe attivare vie di segnalazione che possono influenzare le misure 28. Per ridurre al minimo il danno cellulare, sarebbero necessari i sensori più sottili. Tuttavia, è difficile penetrare la capsula renale con i sensori in modo aghi sono usati per fare un piccolo foro di entrata. I sensori sottili sono più propensi a piegarsi e interrompere il loro rivestimento su inserimento. I sensori di diametro maggiore sono più resistenti alla flessione e il resultant danni al loro rivestimento. La figura 3 mostra un sensore sottile e di spessore. Oltre alla resistenza spessa del sensore di piegatura, che contengono uno strato più spesso di coating, fornendo una maggiore protezione per lo strato enzimatica. La preoccupazione di danno tissutale causato utilizzando sensori spessi era notevolmente meno in reni di quanto sarebbe nel tessuto cerebrale. La profondità di inserimento è approssimata e il posizionamento finale dovrebbe essere verificata dopo le misurazioni sul rene sono stati completati. Stima tra corteccia e midollo livelli utilizzando il sensore di lunghezza della punta come guida di inserimento e &#39;sufficiente, come la punta del sensore è di 0,5 mm e la corteccia del rene ha uno spessore di 2-3 mm. Incrostazioni del sensore si verifica anche ad una velocità maggiore di sangue, limitando così l&#39;uso del sensore in tempo nei protocolli vivo per un esperimento. I tempi di registrazione di 1 a 1 ½ ora portato ad una piccola deriva sensore. I criteri principali per la valutazione delle prestazioni del sensore ridotto è l&#39;scarsa sensibilitàall&#39;analita durante il processo di calibrazione. Aumento rumore elettrico e instabilità della corrente di base possono anche indicare che la punta del sensore è danneggiato. Per misure accurate di ATP, entrambi i sensori (ATP e Null) devono avere caratteristiche di rumore e stabilità analoghi per l&#39;ulteriore sottrazione del segnale. Altrimenti, uno dei sensori devono essere sostituiti. Per rumore basso e il rilevamento di piccole concentrazioni di analita, l&#39;uso dei nuovi sensori per ogni animale è suggerito. Diversi passaggi sono fondamentali per i risultati sperimentali di successo. I sensori sono molto fragili e devono essere maneggiati con cura per evitare di danneggiare la punta del sensore. Inoltre, dopo la reidratazione, i sensori non devono essere esposte all&#39;aria per più di 20 sec. Registrazioni bassa rumorosità sono necessari per l&#39;individuazione di segnali biologici nei tessuti. A tal fine, è necessaria una tabella Air Lab alte prestazioni e corretto collegamento a terra. L&#39;aggiunta di quantità esatte di analita during frequenze di calibrazione è necessario per la determinazione della concentrazione accurata negli esperimenti. Raggiungere una buona compensazione del rene in ex vivo ambulatori renali si tradurrà in registrazioni di successo. L&#39;uso di enzimi apyrase e catalasi in calibrazioni e in esperimenti consente la valutazione della sensibilità del sensore aspecifica e conferma le misurazioni. Questi protocolli forniscono notevolmente migliorata dettaglio di segnalazione extracellulare nei reni. La maggiore sensibilità e risoluzione temporale offerta dai sensori possono permetterci di risolvere cambiamenti di ATP segnalazione negli stati di malattia e seguenti manipolazione farmacologica che erano precedentemente non rilevabili. Il protocollo in vivo è adatto per studi fisiologici complessi mentre ex vivo è ottimale per lo studio di applicazioni farmacologiche su reni. Il disegno del sensore in vivo qui utilizzato consente resistenza senza precedenti contro le interferenze in bltessuto ood-perfusi. Nel loro insieme, questi sensori offrono una grande quantità di applicazioni che in precedenza non erano possibili con i protocolli e le tecniche esistenti.

Biosensori microelettrodi enzimatico (anche riferimento come sensori nel presente manoscritto) sono stati uno strumento prezioso per lo studio dei processi di segnalazione dinamici nelle cellule e nei tessuti viventi. I sensori offrono una maggiore risoluzione temporale e spaziale delle molecole di segnalazione cellulare in concentrazioni biologicamente rilevanti. Invece di campionamento e analizzare fluidi extracellulari effettuate ad intervalli più lunghi periodi di tempo, questi sensori rispondono più velocemente loro enzimi reagiscono all&#39;analita, producendo misurazioni in tempo reale 1,2. Rilevamento rapido delle concentrazioni interstiziali dei fattori autocrini e paracrini, come purine o perossido di idrogeno, e le dinamiche del loro rilascio può essere utilizzato per stabilire un profilo per gli effetti dei farmaci in condizioni normali e patologiche 3. Attualmente, la maggior parte delle applicazioni che utilizzano sensori sono stati in fettine di tessuto cerebrale e colture cellulari 4-10. I protocolli descritti in questo scopo manoscrittostabilire i mezzi per misurare con precisione le concentrazioni in tempo reale di analiti nei reni interi. I seguenti protocolli sono stati sviluppati per studiare ATP interstiziale e H 2 O 2 segnalazione nei reni. In ambiente nativo del rene, l&#39;ATP extracellulare viene rapidamente catabolizzata da ectonucleotidases endogeni nei suoi derivati ​​(ADP, AMP e adenosina). I sensori utilizzati sono altamente selettivi in ATP su altri purine o ATP prodotti di degradazione 11. Questo offre un grande vantaggio in quanto permette il monitoraggio accurato delle concentrazioni costanti e dinamiche di rilascio di ATP e la sua funzione di segnalazione. Concentrazione di ATP interstiziale viene misurata utilizzando la combinazione di due microelettrodi, un sensore di ATP e un sensore Null. Il sensore Null in combinazione con applicazioni catalasi è in grado di rilevare interstiziale H 2 O 2 12 concentrazioni. I seguenti protocolli utilizzano due diversi disegni di sensors che presentano caratteristiche ottimali sia per ex vivo o in vivo. in applicazioni Entrambi i modelli sono basati sulla reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-fosfato ossidasi contenuta in uno strato sensore enzimatica ed è guidata dalla presenza di ATP. Nella serie di sensori utilizzati negli studi ex vivo, H 2 O 2, il prodotto finale di reazione enzimatica, viene rilevato mediante ossidazione su un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. Sensori per studi in vivo sono invece basati sulla riduzione H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d&#39;oro progettata per il tessuto sangue perfuso. In figura 1 è uno schema di entrambi i protocolli descritti in questo manoscritto. Il sensore Null è identico al suo sensore ATP corrispondente tranne che manca degli enzimi legati. Pertanto, in aggiunta al rilevamento di H 2 O 2 con l&#39;enzima catalasi, il sensore mea NullSures interferenze aspecifiche. Concentrazioni di ATP sono calcolati sottraendo il Null rilevato interferenze aspecifiche e sfondo H 2 O 2 dal segnale sensore ATP. Diversi sensori sono anche disponibili in commercio per individuare altri analiti tra cui l&#39;adenosina, ionosine, ipoxantina, acetilcolina, colina, glutammato, glucosio, lattato, d-serina per applicazioni ex vivo o adenosina, ionosine, e ipoxantina in vivo se abbinato con la corrispondente Null sensore. La capacità del sensore di rilevare esattamente analiti dipende il corretto pre e post-13 calibrazioni. Questo assicura che l&#39;analisi rappresenta la deriva della sensibilità del sensore che si verifica durante l&#39;uso in tessuti biologici. Il sensore contiene un deposito di glicerolo che viene utilizzato come reagente nelle reazioni enzimatiche sensore. Se il sensore non è usato in soluzioni contenenti glicerolo bagno, laverà nel tempo. Shorter rvolte ecording sono poi necessarie per minimizzare la deriva del sensore. Inoltre sensore incrostazione da proteasi endogene e frammenti di proteine ​​può notevolmente diminuire la sensibilità dei sensori 14. Il presente manoscritto stabilisce l&#39;uso di biosensori microelettrodo enzimatiche per ex vivo e in vivo preparazioni renali. Real-time analita quantificazione fornisce dettagli senza precedenti di segnalazione cellulare che possono rivelare nuove informazioni sui meccanismi delle malattie renali e agenti farmacologici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor Kit</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBK-ATP-05-125</td>
			<td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&#160; Also included with the kit is the user&#39;s choice of sensors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-ATP-05-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-ATP-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe null sensor 125&#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-NUL-20-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold null sensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-NUL-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Manual</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage&#160;</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel potentiostat</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2021</td>
			<td>Type II Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition program</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td>Model R99E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic illuminator</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane ventilator</td>
			<td>LEI Medical</td>
			<td>M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S3358OA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>26-30 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Polyethylene tubing (PE50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter tissue glue</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any 2-4 mm wide rubber bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone</td>
			<td>Momentive</td>
			<td>RTV-615 Clear 1#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard dissection kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit should include scalpel and dissection sissors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney Cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Of own design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard chemicals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559-25UMO</td>
			<td>100 mM ATP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>2010012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

Biosensori microelettrodi enzimatici sono stati ampiamente utilizzati per misurare il segnale extracellulare in tempo reale. La maggior parte del loro uso è stato limitato a fettine di cervello e colture cellulari neuronali. Recentemente, questa tecnologia è stata applicata a tutto organi. I progressi nella progettazione dei sensori hanno reso possibile la misurazione di segnalazione delle cellule nel sangue-perfuso nei reni vivo. Elencare i presenti protocolli i passi necessari per misurare ATP e H 2 O 2 segnalazione nell&#39;interstizio rene di ratto. Due disegni sensore separato sono utilizzati per la ex vivo e in vivo protocolli. Entrambi i tipi di sensori sono rivestiti con un biolayer enzimatico sottile sopra di uno strato permselettività dare rapida risposta, biosensori sensibili e selettivi. Lo strato permselettività protegge il segnale dagli interferenti in tessuto biologico, e lo strato enzimatica utilizza la reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-phosphate ossidasi in presenza di ATP per produrre H 2 O 2. La serie di sensori utilizzati per gli studi ex vivo ulteriormente rilevato analita mediante ossidazione di H 2 O 2 in un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. I sensori per gli studi in vivo sono invece basati sulla riduzione di H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d&#39;oro progettata per il tessuto sangue perfuso. Modifiche concentrazione finale vengono rilevati da amperometria tempo reale seguito da taratura a concentrazioni note di analita. Inoltre, la specificità del segnale amperometrico può essere confermato con l&#39;aggiunta di enzimi quali catalasi e apyrase che rompono H 2 O 2 e ATP corrispondentemente. Questi sensori anche dipendono fortemente calibrazioni accurate prima e dopo ogni esperimento. I due protocolli seguenti stabiliscono lo studio di rilevamento in tempo reale di ATP e H 2O 2 in tessuti renali, e può essere ulteriormente modificato per estendere il metodo descritto per l&#39;uso in altre preparazioni biologiche o organi interi.

Il disegno del microelettrodo biosensore enzimatico consente il rilevamento in tempo reale di analiti nei reni interi. Il disegno esperimento generale sia ex vivo o in vivo è illustrato in Figura 1 .I sensori utilizzati e le procedure chirurgiche variano a seconda se lo studio è ex vivo o in vivo. Per ottenere risultati riproducibili, pre accurate calibrazioni e post sono critici. Figura 6A mostra una traccia rappresentativa del segnale visto dal sensore ex vivo ATP durante calibrazioni. Si noti che apyrase rapidamente eliminato il segnale di ATP. Catalasi ha avuto alcun effetto sul segnale ATP e dimostra la sua specificità al H 2 O 2 crea (Figura 6B). La procedura di taratura produce un adattamento lineare che viene utilizzato per calcolare le variazioni dinamiche di ATP (Figura 6A, pannello di destra). In vicalibrazione del sensore vo produce una traccia simile a quella del sensore ex vivo. Tuttavia, questo sensore rileva riduttiva anziché correnti ossidativi e come tale la corrente prodotta è negativo. La calibrazione di questi sensori produce anche una misura lineare in un range da 0,3 a 80 mM (Figura 7A pannello di destra). Specificità del sensore in vivo ad ATP rispetto ad altri prodotti purine è mostrato nella Figura 7B. L&#39;approccio qui descritto ci permette di misurare entrambi i livelli basali di sostanze endogene e cambiamenti acuti in risposta a infusione del farmaco 12. In figura 11 sono Ang variazioni di concentrazione endogena interstiziale di H 2 O 2 in ratti sale-resistenti e sensibili al sale II-indotta. Per questi esperimenti, reni appena isolate da Sprague Dawley (SD) o Dahl (SS) ratti sale-sensibili sono stati perfusi con 1 mM Ang II sotto flusso laminare costante (650 ml / min). Come shown in Figura 11, Ang II induce il rilascio acuto di H 2 O 2 in reni da SD e ratti SS. Tuttavia, l&#39;ampiezza massima di ogni risposta è stata significativamente elevati nei ratti SS, soprattutto quando gli animali sono stati alimentati con una dieta ricca di sale 12. In figura 12 è un&#39;applicazione rappresentante dei biosensori in vivo. L&#39;infusione di catalasi (5 mg / ml) blocca completamente il segnale H 2 O 2 rilevato dal biosensore. Questi esperimenti mostrano l&#39;uso di specifici biosensori enzimatici combinati con la tecnica amperometrico per la rilevazione dei livelli basali di sostanze endogene e misurazioni in tempo reale del loro rilascio in risposta ad intervento farmacologico. Ulteriori applicazioni di questo approccio per studiare il ruolo della segnalazione purinergico e perossido di idrogeno miglioreranno la nostra conoscenza e la comprensione delle patologie renali come l&#39;ipertensione sale-sensibile, bue renalelo stress idative e malattia renale cronica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig1.jpg" /> Figura 1. Schema dei protocolli. Calibrazione con analita di interesse e testare la sua specificità viene effettuata immediatamente prima dell&#39;inizio degli esperimenti. Il protocollo in vivo dovrebbe essere seguita per esperimenti fisiologici complessi e ex vivo per applicazioni farmacologiche. Taratura esperimento post dovrebbe essere fatto e preso in considerazione durante l&#39;analisi dei dati. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig2.jpg" /> Figura 2. Enzimatica microelettrodo sensore. I dueDimensioni sensore utilizzato per applicazioni ex vivo sono mostrati, a 50 micron e 125 micron di diametro. Ciascun filo sensore estende in un tubo capillare per la connessione a un connettore terminale oro (non mostrato). Inserto mostra una punta del sensore rivestito con enzimi per la rilevazione di ATP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig3.jpg" /> Figura 3. Dual Channel Potenziostato. I canali potenziostato etichettati CH1 e CH2. 1) CH1 il collegamento del sensore ATP e 2) CH2 le Null collegamento sensore 3) connessioni che sono elettricamente accoppiati per l&#39;elettrodo di riferimento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> ass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig4.jpg" /> Figura 4. Impostazione sensore. L&#39;acquisizione dei dati avviene in una gabbia di Faraday per ridurre il rumore elettrico e su un tavolo da laboratorio ad alte prestazioni per una superficie di lavoro senza vibrazioni. 1) Una tabella chirurgica temperatura controllata viene utilizzato per mantenere la temperatura corporea degli animali durante gli esperimenti fisiologici 2) micromanipolatori sono attaccati agli adattatori di montaggio magnetici per il posizionamento flessibile dei sensori durante l&#39;esperimento 3) Una sorgente di luce è necessaria per procedure chirurgiche e inserimento sensore 4 ) a doppio canale potenziostato 5) Supporto per i sensori. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Voltammetria ciclica. Per ex vivo studi, sensore voltammetria ciclica è condotto per 10 cicli tra -0.5 e 0.5 V prima del protocollo di calibrazione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig6.jpg" /> Figura 6. Calibrazione Amperometry ex vivo. (A) Calibrazione utilizza l&#39;aggiunta di concentrazioni di ATP noti alla soluzione del bagno. Corrispondente amperometriche registrati a livello di asintoto (traccia nera). Le correnti ottenute creano una equazione di taratura. Un esempio è mostrato sul pannello di destra. La traccia rossa è il current del sensore Null che risponde alla sola aggiunta di H 2 O 2. (B) Il sensore Null è calibrato con l&#39;aggiunta di H 2 O 2 conosciuto concentrazioni (frecce rosse), per la soluzione del bagno e gli asintoti amperometriche sono registrati (sottili frecce nere). L&#39;aggiunta di catalasi alla soluzione del bagno (spessore freccia nera) si traduce in rapido decadimento corrente. Il pannello di destra mostra il Null equazione di taratura del sensore. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig7.jpg" /> Figura 7. Calibrazione Amperometry per;. In Vivo taratura del in vivo elettrodi viene eseguita in modo simile a quella di cui gli studi ex vivo eccetto reazioni di riduzione causare una corrente inversa (polarità). (A) L&#39;aggiunta di concentrazioni di ATP noti produce una corrente amperometrico sul sensore ATP (traccia nera), ma non ha alcun effetto sul sensore Null (traccia rossa). Aggiunta apyrase spegne la corrente del sensore ATP. (B) La specificità del sensore ATP viene confermata mediante l&#39;aggiunta di 10 mM di diversi agenti purinergici (UTP, UDP e adenosina). Ulteriori applicazioni di ATP forniscono una corrente amperometrico rilevabile stabile. (C) Microfotografia dei sensori in vivo sulla base di un elettrodo d&#39;oro mediatore rivestito. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figu</a>ri. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig8.jpg" /> Figura 8. Coppe rene. Negli studi in vivo, i reni si svolgono ancora utilizzando le tazze di rene in acciaio inox indicate. Due dimensioni di tazze sono utilizzati per accogliere variazione dimensionale rene. Queste tazze di ridurre gli artefatti di movimento che vengono generati dalla respirazione degli animali. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig9.jpg" /> Figura 9. Ex Vivo isolati e perfusi rene. Il rene isolato viene inserito in un piatto 1) Petri rivestito con una spessa sibottom licone per pin inserimento 2) l&#39;arteria renale è cannulata e collegato ad una pompa a siringa per perfusione costante durante l&#39;esperimento 3) il sensore ATP, 4) e il sensore Null sono inseriti nel rene 5) l&#39;elettrodo di riferimento è posizionata vicino al rene sommersa nella soluzione del bagno. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig9large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig10.jpg" /> Figura 10. In Vivo Sangue Rene perfusi. (A) Il rene sinistro è esposto e messo in una tazza rene, il rene destro rimane intatta all&#39;interno dell&#39;animale. Entrambi i sensori sono inseriti nel rene. BSA: NaCl è infuso attraverso la vena giugulare cateterizzato per contrastare la perdita di liquidi causata by sono inseriti grande mid-linea di incisione (B) Esempio di esperimento in vivo con un catetere interstiziale impiantato per applicazioni farmacologiche dirette 1) il rene è tenuto da una tazza rene 2) Sensore ATP 3) Sensore Null e 4) elettrodo di riferimento nella superficie ventrale del rene 5) catetere impiantato nel rene e collegato a una pompa peristaltica per l&#39;infusione farmacologica laminari. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig10large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig11.jpg" /> Figura 11. Ex Vivo Analisi di H 2 </<html> sub&gt; O 2 nel rene. Ang II perfusione provoca H 2 O 2 rilascio nella corteccia rene di ratto. (A) i cambiamenti in tempo reale della media H 2 O 2 concentrazione (barre grigie mostrano errore standard) su un totale di N = 8 applicazioni (4 reni da 4 ratti diversi). Barre sulla parte superiore rappresentano applicazione Ang II. (B) L&#39;H 2 O 2 massimo valori di ampiezza concentrazione durante Ang II perfusione per Sprague Dawley (SD) e Dahl sensibili al sale (SS) ratti nutriti con una bassa e alta diete sale, rispettivamente. * - P &lt;0,05 rispetto ratti SD. Il dato è tratto dal riferimento 12 con il permesso. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> /files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg &quot;/&gt; Figura 12. In Vivo Analisi di H 2 O 2. Esempio della valutazione in vivo della concentrazione interstiziale H 2 O 2 nel midollo di un ratto SS alimentati con una dieta povera di sale (come mostrato in Figura 10B). L&#39;applicazione interstiziale di catalasi tramite un catetere impiantato per l&#39;intervallo 5 min prodotto un blocco totale del segnale H 2 O 2 nel midollo renale. Riduzione di catalasi, dal dilavamento da parte del flusso ematico renale, ha determinato un parziale recupero del segnale, che è stato bloccato ancora una volta da un&#39;applicazione aggiuntiva catalasi (10 min). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig12large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

L&#39;utilizzo di biosensori enzimatica per quantificare endogena ATP o H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Nel rene

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.8K Views.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Ricerca

Biologia

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

L&#39;uso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Misurazione dell'attività enzimatica della lattasi in laboratorio

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

L'utilizzo di biosensori enzimatica per quantificare endogena ATP o H

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L'uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l'attività della proteasi

L'uso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF