This research was supported by the FP7 European Research Council Grant 281501, ENGVASC.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato delle Etico di esperimenti su animali del Technion. Per questa procedura, topi nudi atimici sono stati usati per evitare il rigetto immunologico. Se si utilizza un altro tipo di mouse, i topi dovrebbero essere rasata prima della procedura chirurgica e la somministrazione di ciclosporina (o un altro sostituto anti-rigetto) è raccomandato. 1. Ponteggio Preparazione e Cell Embedding <ol><li> Preparare ponteggi composto da 1: 1 miscela di poli-L-lattico-acido (PLLA) e polilattico-glicolico-co-acido (PLGA), nel modo seguente: <ol><li> Sciogliere 500 mg di PLLA e 500 mg di PLGA in 10 ml di cloroformio. </li><li> Aggiungere 0,24 ml della soluzione di polimero a 0,4 g di particelle di cloruro di sodio raccolti in Teflon stampi. Utilizzare un diametro di 212-600 micron di sale. Lasciare che il cloroformio evaporare O / N. </li><li> Percolare il sale utilizzando acqua distillata che porta a interconnessi scaffold 3D porosi. </li><li> Tagliare pezzi di polimeriutilizzando un paio di forbici, poi immergere in 70% di etanolo (v / v) per 30 minuti e lavare 3 volte in PBS per 2 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare un tri-coltura delle seguenti cellule in 1: medio cella 1 endoteliale (EGM-2 integrato con i componenti del suo kit proiettile e medie cellule muscolari (mezzo essenziale minimo di Dulbecco (DMEM), supplementato con siero bovino fetale al 10% (FBS ), 2,5% tampone HEPES, 100 U / ml di penicillina, e 0,1 mg / ml di streptomicina (Pen-Strep Solution). <ol><li> Utilizzare 0,5 x 10 6 C2C12 mioblasti, 0,9 x 10 6 vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) e 0,2 x 10 6 normali fibroblasti dermici umani (NHDF). </li></ol></li><li> Mescolare insieme le cellule in una provetta e centrifugare a 200 xg per 4 minuti, aspirare il terreno e risospendere il pellet in una miscela di soluzione di matrice extracellulare freddo 4 microlitri ghiaccio e 4 microlitri medio cellule. </li><li> Tagliare un pezzo di 10 mm x 7 mm x 1 mm (lunghezza x larghezza x spessore) PLLA / PLGUn ponteggio e Seed la sospensione cellulare in una piastra da 6 pozzetti, lasciare che la soluzione matrice extracellulare solidificare (30 min, 37 ° C, 5% CO 2) prima di aggiungere 4 ml di mezzo cellulare. </li><li> Incubare le impalcature per dieci giorni prima dell&#39;impianto e sostituire il mezzo a giorni alterni. </li></ol> 2. Prima di avviare la procedura chirurgica <ol><li> Preparare e sterilizzare (autoclave) i seguenti strumenti chirurgici: un piccolo, multa, forbici diritte, un paio di forbici a molla, una scala, pinze punta fine, una pinza dentata e un porta-aghi. </li><li> Preparare una miscela di ketamina: soluzione xylazina in una provetta mescolando 425 ml di ketamina e 75 xylazina microlitri in una siringa da 1 ml. </li><li> Diluire 0,3 mg / ml in soluzione fisiologica sterile buprenorfina (1,20). </li></ol> 3. Flap costruzione (Graft impianto) <ol><li> Utilizzando una siringa da insulina, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xylazina (35 microlitri per20 g di peso corporeo). </li><li> Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) prima della opperation. </li><li> Posizionare il mouse su un palco riscaldato a 37 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Utilizzando punte di cotone, amministrare lubrificante pomata occhio agli occhi del mouse (per evitare la disidratazione). </li><li> Usando punte di cotone, pulire il sito di incisione con iodio e poi con il 70% di etanolo, per stabilire un campo di lavoro asettico. </li><li> Utilizzando piccole forbici e pinze, fare un&#39;incisione attraverso la pelle, dal livello del ginocchio per legamento inguinale, parallelo ai vasi femorali, fino l&#39;arteria femorale e vena (AV) navi sono esposti. </li><li> Tenere la pelle verso il basso con un divaricatore, per ottenere un migliore accesso al tessuto. </li><li> Utilizzando forbici primavera e pinze, isolare con cura i vasi arteria e vena femorale dal tessuto circostante. Inizia dal livello della lig inguinaleament alla biforcazione dei vasi epigastrici superiori. Lasciare la profunda intatto, al fine di preservare il flusso di sangue alla gamba e prevenire la conseguente ischemia. </li><li> Piegare l&#39;innesto (dal punto 1) intorno al AV femorale esposta, sotto la profunda e al di sopra della biforcazione al tibiale e proneal AV, e unire le estremità con 8-0 punti di sutura in seta. </li><li> Per garantire la vascolarizzazione dell&#39;impianto dai capillari che spuntano solo dai vasi femorali AV, avvolgere un pezzo di lattice sterile intorno al trapianto, e suturare con 6-0 punti di sutura. </li><li> Chiudere la pelle sovrastante con 4-0 punti di sutura in seta. </li><li> Monitorare il mouse strettamente fino al recupero dall&#39;anestesia e ogni giorno successivo, fino a quando l&#39;innesto viene trasferito come lembo. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2-3 giorni. NOTA: Utilizzare soluzione salina in ogni fase, per evitare la disidratazione del tessuto esposto. </li></ol> 4. Flap Transfer <ol><li> Ad una odue settimane dopo l&#39;impianto, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xilazina (35 ml / 20 g), utilizzando una siringa da insulina. </li><li> Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) prima della opperation. </li><li> Posizionare il mouse su un palco riscaldato a 37 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Utilizzando punte di cotone, applicare lubrificante pomata occhio agli occhi del mouse (per evitare la disidratazione). </li><li> Utilizzando punte di cotone, pulire il sito di incisione (dalla zona del ginocchio per l&#39;addome) con iodio e poi con il 70% di etanolo, per stabilire un campo di lavoro asettico. </li><li> Utilizzando un paio di forbici e pinze, aprire con attenzione i punti di sutura nella pelle e, utilizzando un paio di forbici, fare un&#39;incisione attraverso la pelle parallela al legamento inguinale, proseguendo attraverso la pelle ventrale. </li><li> Rimuovere con attenzione il pezzo di lattice con una pinza ed esporre il lembo vascolarizzato. </li><li> Utilizzando un SCISSors e pinze, sezionare il lembo di tessuto dal tessuto circostante. </li><li> Utilizzando una pinza e un porta-aghi, legare l&#39;estremità distale del femore AV con 8-0 punti di sutura in seta per prevenire le emorragie dal AV. Poi, cauterizzare la AV a livello del ginocchio, distalmente al tessuto impiantato ripiegato e le suture 8-0. </li><li> Trasferire delicatamente il AV femorale avvolto dal trapianto, verso la parete addominale ventrale, evitando di danneggiare l&#39;arteria, per determinare a quale distanza il difetto a tutto spessore dovrebbe essere fatto. ATTENZIONE: Tirando l&#39;arteria troppo per evitare di danneggiare l&#39;arteria. </li><li> Utilizzando una multa forbici, fare un&#39;incisione nella parete addominale ventrale. </li><li> Utilizzando un paio di forbici a molla, fare un&#39;incisione nel muscolo retto addominale. Rimuovere un segmento x 0,8 centimetri circa 1 cm del muscolo retto addominale con la pelle sovrastante. </li><li> Trasferire il AV femorale, avvolto dal trapianto vascolarizzato, come un lembo assiale, al difetto a tutto spessore nel abdom ventralemuro inale. </li><li> Suturare il lembo di tessuto muscolare circostante, utilizzando 8-0 punti di sutura in seta, per evitare ernia. </li><li> Per evitare di sutura gli organi interni, aumentare il muscolo con una pinza quando la sutura del lembo al muscolo addominale. Lasciare la cute ventrale esposta per simulare l&#39;effetto di una completa difetto della parete addominale. </li><li> Coprire la ferita della pelle con garza iodato e una benda sterile per prevenire la contaminazione della superficie esposta. </li><li> Suturare la pelle della gamba utilizzando 4-0 suture di seta. </li><li> Monitorare il mouse strettamente fino al recupero dall&#39;anestesia e ogni giorno successivo, fino recupero del lembo. Sottocutanea iniettare buprenorfina (concentrazione finale di 0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2-3 giorni. </li><li> NOTA: Utilizzare soluzione salina in ogni fase per evitare la disidratazione del tessuto esposto. </li></ol> 5. Determinazione di Ecografia Vascolare perfusione del Graft NOTA: Prima di trasferimento, la perfusione vascolare of l&#39;innesto viene misurata a una e due settimane dopo l&#39;impianto, con l&#39;ecografia. <ol><li> Anestetizzare il mouse utilizzando 2% isoflurano. </li><li> Posizionare il mouse su una fase mobile riscaldato a 38 ° C, per assicurare una temperatura corporea normale, e quindi fissare il mouse utilizzando un bendaggio adesivo. </li><li> Trova l&#39;arteria e vena vasi femorali con trasduttore non lineare impostata sul B-mode. </li><li> Esaminate la pervietà dei vasi femorali dell&#39;innesto utilizzando il trasduttore impostato sulla modalità colore Doppler. </li><li> Preparare agente non mirato contrasto secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Collegare un catetere vena della coda (12 cm tubo con un ago 27 G) ad una siringa da 1 ml riempito con soluzione fisiologica. Fissare la siringa accanto al mouse sulla fase di riscaldamento (per evitare il movimento della siringa). </li><li> Collegare il catetere alla vena della coda del mouse e fissare l&#39;ago. </li><li> Iniettare alcuni dei salina sia garantire che le iniezioni vengono effettuate in vena e per riempireil tubo con soluzione salina (per evitare bolle d&#39;aria). </li><li> Riempire una siringa da 1 ml con 70 ml di mezzo di contrasto e sostituire la siringa salina con la siringa agente di contrasto. </li><li> Impostare la ultrasuoni per iniezione immagine del mezzo di contrasto. Nelle proprietà della modalità non lineare impostare il numero di fotogrammi da 1.500 e l&#39;impulso di interruzione 30% delle esposizioni. NOTA: Dopo l&#39;impulso interruzione, le microbolle ri-riempire i vasi ad una velocità che dipende dalla portata delle microbolle nei capillari ed è indipendente dalla velocità di iniezione delle microbolle. Il numero di fotogrammi può essere modificato a seconda del tempo di riempimento 19,20. </li><li> Iniettare lentamente il mezzo di contrasto nella vena della coda. </li><li> Cattura immagini in modalità contrasto non lineare del sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione. </li><li> Analizzare i risultati utilizzando il software, come descritto in precedenza 19,20. <ol><li> Disegnare una regione di interesse (ROI) sull&#39;immagine ottenuta immediatamente dopo l&#39;impulso interruzione nel contrasto modalità. Il ROI dovrebbe delineare l&#39;area riempita solo dal mezzo di contrasto. </li><li> Calcolare il miglioramento picco (PE), che è il rapporto tra l&#39;intensità media del segnale non lineare dopo l&#39;iniezione delle microbolle contro dopo l&#39;impulso interruzione, ed è una misura del volume di perfusione. </li><li> Calcolare la portata, che è determinato dal tempo (T) che deve trascorrere prima del segnale di picco (P). </li></ol></li></ol> 6. Determinazione della misura di Graft Vascolarizzazione NOTA: Il grado di innesto di tessuto vascolarizzazione è determinata una o due settimane dopo l&#39;impianto. <ol><li> Utilizzando una siringa da insulina, anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina: xilazina (35 ml / 20 g). </li><li> Uso 1 siringa ml, per via endovenosa iniettare 200 ml di 10 mg / isotiocianato-destrano coniugato ml fluoresceina (FITC-destrano, MW = 500.000) nella vena della coda. &lt;/ li&gt; <li> Dieci secondi dopo il completamento dell&#39;iniezione, eutanasia il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Aprire la gamba del mouse e esporre l&#39;innesto. </li><li> Lavare la zona di innesto con tampone fosfato (PBS) e applicare il 10% formalina tamponata neutra. </li><li> Immagine l&#39;innesto nella gamba del mouse, utilizzando un microscopio confocale. </li><li> Quantificare densità dei vasi funzionale (FVD). <ol><li> Isolare il canale verde (eccitazione = 488 nm) delle immagini microscopiche confocale. </li><li> Passare le immagini risultanti attraverso un filtro passa-alto, per accentuare le strutture ad alto contrasto. </li><li> Utilizzare un filtro despeckling per rimuovere il rumore che potrebbe essere stato amplificato dal filtro passa-alto. </li><li> Impostare il valore di soglia sulla immagine risultante; il valore di soglia è regolata in modo che le caratteristiche e le strutture dell&#39;immagine originale sono visibili nell&#39;immagine binaria. </li><li> Applicare una size-soglia in modo che solo i gruppi di pixel connessi più grandi del siz definitae soglia rimangono nell&#39;immagine binaria. </li><li> Delineare lo scheletro dei vasi del trapianto utilizzando l&#39;algoritmo di Zhang-Suen 21. </li><li> Calcolare il FVD sommando le lunghezze della linea mediana di ciascun recipiente e dividendo il risultato per l&#39;area della ROI. </li></ol></li></ol> 7. immunoistologica e istologica colorazione della Graft <ol><li> Colorazione immunoistologico <ol><li> Dopo confocale, recuperare il trapianto utilizzando un piccolo forbici e pinze. Sezionare i vasi AV nelle due estremità dell&#39;innesto e recuperare l&#39;innesto. </li><li> Fissare gli innesti nel 10% formalina tamponata neutra per 30 minuti - 2 ore. </li><li> Posizionare gli innesti in cassette istologia e conservare in etanolo al 70% fino a paraffina. </li><li> Incorpora in paraffina utilizzando una fissazione standard incorporare il protocollo 22 e affettare le paraffina tessuti in 5 micron fette utilizzando un microtomo. Tagliate tutto il tessuto perpendicolarmente al AVvasi. </li><li> Deparaffinare sezioni incluse in paraffina per immersione in 100% xilene due volte, per 10 minuti ciascuno. </li><li> Disponete le diapositive di una da 250 ml di plastica vaschetta Coplin. </li><li> Reidratare per immersioni seriali in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% e acqua bidistillata (DDW)) per 3 minuti ciascuno. </li><li> Preparare la soluzione smascheramento dell&#39;antigene diluendo 2,35 ml di soluzione di smascheramento dell&#39;antigene con 250 ml di DDW. Riscaldare la soluzione antigene smascheramento per 2 minuti in un forno impostato a 95 ° C. </li><li> Inserire i vetrini nella soluzione di antigene smascheramento preriscaldata e riscaldare di nuovo per 3 minuti in un forno a microonde impostato a 95 ° C. Raffreddare i vetrini a 50 ° C. </li><li> Riscaldare di nuovo per 2 minuti e poi raffreddare a RT. </li><li> Incubare i vetrini in 3,3% H 2 O 2 soluzione in metanolo per 10 minuti, a temperatura ambiente per estinguere l&#39;attività di perossidasi endogena e quindi risciacquare due volte in PBS. </li><li> Preparare una camera di incubazione: posto abso bagnatofogli rbent all&#39;interno di una scatola di istologia e asciugare le diapositive usando tergicristalli compito delicato. </li><li> Circle l&#39;area della sezione sul vetrino utilizzando una penna idrofobico e incubare per 30 min a temperatura ambiente, con circa 50 ml di siero di capra una soluzione bloccante (2%, preparato in PBS) per fetta. </li><li> Diluire il coniglio anti-CD31 anticorpo 1:50 in soluzione bloccante, applicare circa il 50 microlitri anticorpo per fetta e incubare O / N, a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Diluire la capra biotinilato anti-coniglio anticorpo secondario 1: 400 in PBS, posto sopra scivoli circa 50 ml di anticorpi per fetta e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Diluire streptavidina-perossidasi 1: 400 in PBS, applicare circa 50 microlitri per fetta e incubare con vetrini per 30 minuti, a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ciascuno. </li><li> Applicare circa 50 ml di aminoethylcarbazole (AEC) substrato per fetta, secondo il produttore &amp; #8217; s istruzioni. Immergere i vetrini in DDW per arrestare la reazione. </li><li> Stain i nuclei in blu immergendo sezioni in circa 50 ml di soluzione di ematossilina di Mayer per 2 min. Lavare delicatamente in acqua e poi coprire le sezioni con mezzo di montaggio. </li><li> Quantificare CD31-positivo colorazione utilizzando un approccio a doppio cieco. CD31 colorazione appare come una macchia marrone. Scegliere 4-5 campi differenti in un campo visivo di ingrandimento 40X sotto un microscopio binoculare. Contare il numero di lumen CD31-positivo. <ol><li> Calcolare il numero medio di lumen CD31-positive per scaffold dividendo il numero totale di lumen contato con il numero di campi e fieldarea (secondo i dati binoculare). NOTA: Il volume di reagente applicato deve essere sufficiente a coprire l&#39;intera fetta delineato. </li></ol></li></ol></li><li> Colorazione istologica <ol><li> Fissare innesti nel 10% formalina tamponata neutra. </li><li> Innesti Incorpora in paraffina utilizzando le normalifissazione e le procedure di incorporamento. </li><li> Rimuovere la paraffina dalle sezioni incluse in paraffina per immersione in 100% xilene due volte per 10 min. </li><li> Lavaggio rapido due volte per la reidratazione in 100% di isopropanolo. </li><li> Lavaggio rapido due volte il 95% di etanolo. </li><li> Lavare tre volte in acqua di rubinetto. </li><li> Immergere in ematossilina per 10 min. </li><li> Lavare tre volte in acqua di rubinetto. </li><li> Immere in Eosina per 2 min. </li><li> Lavaggio rapido disidratare in etanolo al 95% due volte. </li><li> Veloce lavaggio 100% di isopropanolo due volte. </li><li> Veloce lavaggio 100% xilene due volte. </li><li> Coprire con colla DPX con vetro di copertura spessore di 1,5 mm. </li><li> Immagine utilizzando microscopio in 40X di ingrandimento. </li></ol></li></ol> 8. Proprietà meccaniche Assessment <ol><li> Recuperare l&#39;innesto con un piccolo forbici e pinze. </li><li> Sciacquare il trapianto in PBS. </li><li> Misurare la larghezza e lo spessore dell&#39;innesto e calcolare l&#39;area della sezione trasversale come larghezza moltiplicato per lo spessore. </li><li> Noivia e lo strumento di prova per generare una curva sforzo-deformazione degli innesti idrati. <ol><li> Montare l&#39;innesto tra le impugnature di trazione del sistema e misurare la lunghezza finale tra le due impugnature (ad esempio, lunghezza iniziale). </li><li> Applicare una velocità di deformazione di 0,01 mm / sec, fino alla rottura. </li><li> Registrare la forza sviluppata e lo spostamento utilizzando il protocollo del produttore. </li><li> Generare una curva sforzo-deformazione in Matlab. <ol><li> Calcolare ceppo secondo spostamento diviso per la lunghezza iniziale. Lo stress è calcolata come la forza misurata divisa per l&#39;area della sezione trasversale. </li><li> Determinare rigidità come la pendenza lineare regione nella curva sforzo-deformazione e il punto di massimo della curva è la resistenza a trazione. </li></ol></li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revascularization+of+human+acellular+dermis+in+full-thickness+abdominal+wall+reconstruction+in+the+rabbit+model.">Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model.</a> Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).</li><li>Buinewicz, B., Rosen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+cadaveric+dermis+(AlloDerm):+a+new+alternative+for+abdominal+hernia+repair.">Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair.</a> Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).</li><li>Bringman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hernia+repair:+the+search+for+ideal+meshes.">Hernia repair: the search for ideal meshes.</a> Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).</li><li>Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biological+and+composite+scaffolds+for+abdominal+wall+reconstruction.">Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction.</a> Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).</li><li>Cheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+blood+vessel+networks+connect+to+host+vasculature+via+wrapping-and-tapping+anastomosis.">Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis.</a> Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).</li><li>Shandalov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+muscle+flap+for+reconstruction+of+large+soft+tissue+defects.">An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects.</a> PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).</li><li>Zhang, T. 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Part A. 16 (1), 115-125 (2010).</li><li>Levenberg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue.">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li><li>Bearzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlGF-MMP9-engineered+iPS+cells+supported+on+a+PEG-fibrinogen+hydrogel+scaffold+possess+an+enhanced+capacity+to+repair+damaged+myocardium.">PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium.</a> Cell death &amp; disease. 5, e1053 (2014).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1+expression+by+mesenchymal+stem+cells+results+in+trophic+support+of+cardiac+myocytes+after+myocardial+infarction.">SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction.</a> FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).</li><li>Dvir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevascularization+of+cardiac+patch+on+the+omentum+improves+its+therapeutic+outcome.">Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome.</a> PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).</li><li>Marsano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+controlled+expression+of+VEGF+by+transduced+myoblasts+in+a+cardiac+patch+on+vascularization+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction.">The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction.</a> Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+infarct+stabilization+and+neovascularization+mediated+by+VEGF-loaded+PEGylated+fibrinogen+hydrogel+in+a+rodent+myocardial+infarction+model.">Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model.</a> Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).</li><li>Nillesen, S. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+angiogenesis+in+acellular+scaffolds+by+combined+release+of+FGF2+and+VEGF.">Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF.</a> J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).</li><li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fabrication+of+functional+three-dimensional+tissues+with+perfusable+blood+vessels.">In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels.</a> Nat Commun. 4, 1399 (2013).</li><li>Tee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+engineered+cardiac+muscle+flaps+in+syngeneic+rats.">Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats.</a> Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).</li><li>Morritt, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering+in+an+in+vivo+vascularized+chamber.">Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber.</a> Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

I progressi in ingegneria dei tessuti sono stati raggiunti con una crescente domanda per i tessuti sostitutivi per la ricostruzione dei vari tipi di tessuto. Una varietà di sintesi 1,17,18 e biologici 14-16 materiali, nonché i metodi di fabbricazione sono stati valutati per la loro capacità di far fronte a queste esigenze. Tuttavia, nonostante i progressi nella cura clinica e in ingegneria dei tessuti, il restauro di difetti della parete addominale a tutto spessore rimane una sfida. Un tessuto adeguato per la ricostruzione di tali difetti massicce deve essere (1) di spessore e (2) vascolarizzato, e dimostrare (3) integrità meccanica, e (4) vitalità nel tempo 23. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato passo-passo per la creazione di un lembo di tessuto denso, vitale, e vascolarizzato, che può servire come alternativa a lembi di tessuto autologhe. Il lembo fabbricato è stato costruito in due fasi: (1) A ponteggio PLLA / PLGA è stato impiantato intorno ai vasi AV del mouse hindlimb e separato dal tessuto circostante per permettere vascolarizzazione soltanto dalle navi AV. (2) Il vascolarizzato, lembo di tessuto denso creato è stato poi trasferito con i vasi AV, che serviva come il suo peduncolo, in un difetto della parete addominale a tutto spessore. Lembo corretta vascolarizzazione è essenziale per la sua integrazione di successo all&#39;interno del 17,18,24 ospite. Vari approcci per creare ingegneria tessutale vascolarizzato al fine di migliorare la fornitura di ossigeno e diffusione nei tessuti spessi, sono stati discussi in letteratura. Tra questi erano i metodi che comportano la semina delle cellule endoteliali (ECS) su vari tipi impalcatura 13,20,25-30, varie tecniche per la fornitura di fattori angiogenici al sito di impianto (sia per la somministrazione diretta per iniezione, l&#39;uso di cellule trasformate esprimendo i fattori 31 rilascio -34 o lenta di diversi ponteggi 35,36), l&#39;uso di bioreattori per garantire ingegneria tessutale perfusione 37 </sup&gt; e l&#39;occupazione delle camere a circuito AV 38,39. Qui, l&#39;innesto di tessuto è stato vascolarizzato in vivo, per lo sfruttamento dei vasi autologhi. L&#39;innesto, che si è rivelato vitale, vascolarizzato e perfuso, è stato poi trasferito come un lembo di tessuto spesso per riparare un difetto della parete addominale a tutto spessore. Una settimana dopo il trasferimento, il lembo era praticabile e caratterizzato resistenza meccanica sufficiente a sostenere i visceri addominali. Qui, abbiamo utilizzato topi nudi atimici, che portano un sistema immunitario compromesso; quando si utilizza qualsiasi altro tipo di mouse o altro animale, la possibilità di reazioni immunitarie dovrebbe essere preso in considerazione (soprattutto quando semina scaffold con cellule). Altre limitazioni di questa tecnica sono: (1) il trasferimento di navi AV femorali, che forniscono il flusso di sangue al hindlimb. Tuttavia, la tecnica lascia il profunda e vasi femorali profondi intatta e senza ischemia degli arti posteriori è stata osservata dopo il trasferimento lembo. Inoltre, in animali più grandi e negli esseri umani, l&#39;uso divasi periferici saranno informati quanto sono ridondanti nel corpo; (2) il tempo necessario per ottenere una adeguata vascolarizzazione prima lembo trasferimento, può essere un fattore limitante nei casi urgenti; e (3) creazione lembo viene eseguita in vivo, che può limitare la sua rilevanza nell&#39;uomo. In futuro, ci proponiamo di sviluppare un mezzo per creare questo lembo ex vivo. Il vantaggio del metodo presentato risiede nella capacità di migliorare la formazione di un tessuto autologo (con cellule autologhe) intorno al ponteggio. Il tessuto risultante presenta una valida alternativa ad un lembo di tessuto autologo. Inoltre, l&#39;impalcatura può essere seminato con cellule autologhe prima dell&#39;impianto, per migliorare ulteriormente la vascolarizzazione dell&#39;innesto e integrazione nel tessuto ospite. L&#39;utilizzo di cellule autologhe e una impalcatura biodegradabile e biocompatibile, in grado di aggirare il sostanziale rischio di reazioni immuno-rigetto e presentare un&#39;alternativa a lembi autologhe, evitando la raccolta e scarifi postoperatoriocatione. Il metodo descritto può tradotto in esperimenti animali di grandi dimensioni e in seguito esteso a studi clinici sull&#39;uomo. Inoltre può essere tradotto per riparare vari tessuti danneggiati all&#39;interno del corpo. Negli esseri umani e in grandi animali, le alette possono essere generati in giro vasi periferici anziché sui vasi femorali AV.

Difetti della parete addominale spesso sorgono a seguito di traumi gravi, il trattamento del cancro, le ustioni e la rimozione della rete infetti. Questi difetti spesso comportano una significativa perdita di tessuto, che richiedono procedure chirurgiche complesse e la presentazione di una grande sfida per i chirurghi plastici di ricostruzione 1-4. Ricercatori di ingegneria dei tessuti alla ricerca di nuove fonti per i tessuti artificiali hanno esplorato diversi materiali, fonti di cellule e fattori di crescita. Restauri positivo di vari tessuti, come trachea 5,6, vescica 7, cornea 8, 9 e osso pelle 10, per impiantazione di tessuti ingegnerizzati sono stati segnalati in precedenza. Tuttavia, la fabbricazione di uno spesso ingegneria tessutale vascolarizzato, in particolare per la ricostruzione di grandi difetti, rimane una sfida significativa in ingegneria dei tessuti. Uno dei principali fattori limitanti lo spessore di un costrutto tessuto vitale è il controllo dell&#39;alimentazione di ossigeno ad suoi svantaggicellule tituent. Quando basandosi sulla diffusione, costruire spessore è limitato a quello di uno strato molto sottile. La distanza massima tra ossigeno e nutrienti capillari fornitura in vivo è di circa 200 micron, che è correlato con il limite diffusione dell&#39;ossigeno 11,12. Vascolarizzazione insufficiente può provocare ischemia tissutale e aumentare al riassorbimento del tessuto o necrosi 13. Inoltre, il materiale ideale utilizzato per la ricostruzione del tessuto deve essere biocompatibile e non immunogenica. Deve anche essere in grado di promuovere una maggiore integrazione di cellule ospiti con il biomateriale, e mantenendo l&#39;integrità strutturale. Vari biologici 14-16 e sintetiche 1,17,18 matrici sono stati precedentemente esplorati per la ricostruzione dei tessuti, ma il loro uso rimane limitato a causa della mancanza di afflusso di sangue efficace, infezioni o la forza del tessuto insufficiente. In questo studio, un biocompatibile, cell-embimpalcatura edded composto da Food and Drug Administration (FDA) l&#39;acido L-lattico poli -approvato (PLLA) / poli acido lattico-co-glicolico (PLGA), è stato impiantato intorno all&#39;arteria femorale e vena (AV) le navi di un topo nudo e separato dal tessuto circostante, assicurando vascolarizzazione solo dai vasi AV. Una settimana dopo l&#39;impianto, l&#39;innesto è stato vitale, denso e ben vascolarizzato. Questo tessuto vascolarizzato spessore con vasi AV, è stato poi trasferito come lembo peduncolato un difetto a tutto spessore addominale nel mouse stesso. Una settimana dopo il trasferimento, il lembo era praticabile, vascolarizzato e ben integrato con il tessuto circostante, tenendo forza sufficiente a sostenere visceri addominali. Così, la spessa, lembo di tessuto vascolarizzato ingegneria, recanti un peduncolo autologo, presenta un nuovo metodo per la riparazione di difetti della parete addominale a tutto spessore.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>small fine straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight forceps with fine tip</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serrated forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small vessel cauterizer&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>18000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duratears</td>
			<td>Alcon</td>
			<td align="right">5686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sedaxylan</td>
			<td>Euravet</td>
			<td>DJ03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorketam 1000</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4A0726B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>vetmarket</td>
			<td>B15100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 silk sutures</td>
			<td>Assut sutures</td>
			<td align="right">647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 polypropylene sutures</td>
			<td>Assut sutures</td>
			<td>9351F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 silk sutures</td>
			<td>Assut sutures</td>
			<td align="right">684568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (6mm needle)</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">324911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 high-resolution ultrasound system</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS250 non-linear transducer</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromarker non-targeted contrast agent</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td>VS-11694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tail vein catheter</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td>VS-11912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 software</td>
			<td>VisualSonics inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FD500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td align="right">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antigen unmasking solution</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin-peroxidase</td>
			<td>Jackson&#160;</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hamatoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MHS-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit</td>
			<td>Life technologies, Invitrogen&#160;</td>
			<td>00-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectamount</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-5501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered vascularized muscle flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

Vascolarizzazione del trapianto e la perfusione in vivo Gli innesti sono stati impiantati una o due settimane prima del loro trasferimento come lembi assiali. A uno e due settimane dopo l&#39;impianto, l&#39;osservazione al lordo della zona dell&#39;innesto rivelato innesti di tessuto vitali e vascolarizzate. Questi innesti dimostrato di essere altamente vascolarizzati, come determinato mediante immunocolorazione CD31 positivo (Figura 1A) e altamente perfuso, come evidenziato da misurazioni iniezione coda vena e ultrasuoni FITC-destrano. Molti vasi sono stati già osservati a una settimana dopo l&#39;impianto, un numero che è aumentato significativamente dopo un&#39;ulteriore settimana in prossimità dei vasi AV. Determinazione a base di destrano FITC della densità dei vasi funzionale (FVD) (Figura 1B) ha mostrato che il trapianto è stato altamente vascolarizzato in una settimana post-impianto e che nessun cambiamento significativo ha avuto luogo nella settimana supplementare in vivo. Vessel pervietà e perfusione sono stati dimostratiper ecografia (il FVD era 5,71 millimetri - 1 ± 0,51 millimetri - 1 e 10,28 millimetri - 1 ± 2,71 millimetri - 1, una e due settimane dopo l&#39;impianto, rispettivamente) Figura 1C confermato ospite femorale pervietà e integrità nave dopo trapianto impianto. . Inoltre, l&#39;esame ecografico rivelato perfusione nell&#39;area dell&#39;innesto, di poco superiore due settimane dopo l&#39;impianto rispetto ad una settimana post-impianto (Figura 1D). Proprietà Flap Esame superficiale dei lembi uno settimana post-trasferimento ha rivelato un tessuto vitale, vascolarizzato e ben integrati. I lembi sono stati sottoposti a fermo attaccamento ai loro dintorni. Quando si confrontano i lembi, cellulari-embedded pre-vascolarizzati per controllare acellulare, innesti nonvascularized, l&#39;ex ha mostrato proprietà meccaniche superiori, come manifestato da una maggiore rigidità e resistenza ( <strong&gt; Figura 2). Abbiamo anche osservato che deiscenza della ferita e ernia fatte meno frequenti nei topi trattati con alette cellule-embedded, rispetto agli animali trattati con innesti controllo, che può essere attribuito alla maggiore resistenza meccanica del tessuto trapiantato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52984/52984fig1.jpg" /> Figura 1. Graft vascolarizzazione. (A) La densità dei vasi CD31-positive, misurata a una e due settimane dopo l&#39;impianto, rispetto al gruppo di controllo. Tutti i valori sono normalizzati alla zona di innesto (2 mm). * = T-test p &lt;0.05. (B) Funzionale densità vascolare (FVD) a una e due settimane post-impianto. Nessuna differenza significativa è stata osservata, p = 0,08 (T-test). (C) le navi AV brevetti come ripreso utilizzando gli ultrasuoni in modalità color Doppler. Blu e rosso rappret il flusso di sangue nel trapianto. Il quadrante giallo evidenzia la zona di innesto. (D) Graft perfusione a una e due settimane post-impianto. (E e F) H &amp; E colorazione delle alette integrate con il tessuto ospite: nero punta della freccia arteria vitale; frecce bianche indicano fibre muscolari addominali; frecce gialle indicano resti patibolo. (H e G) distribuzione destrano FITC come mostrato dalle immagini di microscopia confocale. Per tutte le determinazioni, la dimensione del campione è stata n ≥ 3 e tutti i valori sono rappresentati come media ± errore standard della media. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52984/52984fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52984/52984fig2.jpg" /> Figura 2. Proprietà meccaniche del lembo uno settimanapost-trasferimento. (A) La rigidezza e (B) il carico di rottura (UTS) dei lembi. Controllo significa un innesto vuota senza le cellule, le cellule stand innesti tri-cultura. * = T-test p &lt;0.05, n = 3. I valori sono rappresentati come media ± errore standard della media. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52984/52984fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Engineered Vascularized Muscle Flap

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.2K Views.  Kaplan Medical Center. To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps. 

Video: Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

A base di seta-collagene Engineered Modello 3D del tessuto neurale polarizzata

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Ricerca

Bioingegneria

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

applicazioni di<em&gt; In Vivo</em&gt; Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

Innesto ingegnerizzato per la ricostruzione esofagea circonferenza nei ratti

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to nanomolar ranges, several orders of magnitude less than many physiological ligand concentrations. Optical nanostructures called zero mode waveguides (ZMWs), which are 100&#8722;200 nm in diameter apertures fabricated in a thin conducting metal such as aluminum or gold, allow imaging of individual molecules at micromolar concentrations of fluorophores by confining visible light excitation to zeptoliter effective volumes. However, the need for expensive and specialized nanofabrication equipment has precluded the widespread use of ZMWs. Typically, nanostructures such as ZMWs are obtained by direct writing using electron beam lithography, which is sequential and slow. Here, colloidal, or nanosphere, lithography is used as an alternative strategy to create nanometer-scale masks for waveguide fabrication. This report describes the approach in detail, with practical considerations for each phase. The method allows thousands of aluminum or gold ZMWs to be made in parallel, with final waveguide diameters and depths of 100&#8722;200 nm. Only common lab equipment and a thermal evaporator for metal deposition are required. By making ZMWs more accessible to the biochemical community, this method can facilitate the study of molecular processes at cellular concentrations and rates.

Described here is a nanosphere lithography method for parallel fabrication of zero mode waveguides, which are arrays of nanoapertures in a metal-clad glass microscopy coverslip for single molecule imaging at nano- to micromolar concentrations of fluorophores. The method takes advantage of colloidal crystal self-assembly to create a waveguide template.

Fabbricazione di guide d'onda in modalità zero per microscopia ad alta concentrazione a singola molecola

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generazione di equivalenti di pelle umana vascolarizzata auto-assemblati

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study skeletal muscle reformation and function in a scalable format that is amenable to experimental manipulations. 3D muscle culture systems are desirable as they enable scientists to study skeletal muscle ex vivo in the context of human cells. 3D in vitro&#160;models closely mimic aspects of the native tissue structure of adult skeletal muscle. However, their universal application is limited by the availability of platforms that are simple to fabricate, cost and user-friendly, and yield relatively high quantities of human skeletal muscle tissues. Additionally, since skeletal muscle plays an important functional role that is impaired over time in many disease states, an experimental platform for microtissue studies is most practical when minimally invasive calcium transient and contractile force measurements can be conducted directly within the platform itself. In this protocol, the fabrication of a 96-well platform known as &#39;MyoTACTIC&#39;, and en masse production of 3D human skeletal muscle microtissues (hMMTs) is described. In addition, the methods for a minimally invasive application of electrical stimulation that enables repeated measurements of skeletal muscle force and calcium handling of each microtissue over time are reported.

This manuscript describes a detailed protocol to produce arrays of 3D human skeletal muscle microtissues and minimally invasive downstream in situ assays of function, including contractile force and calcium handling analyses.

Valutazione delle metriche funzionali della salute del muscolo scheletrico nei microtessuti muscolari scheletrici umani

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex vivo. Recently developed organoid models have facilitated the expansion and study of lung epithelial progenitors in vitro, but these platforms typically rely on mouse tumor-derived matrix and/or serum, and incorporate just one or two cellular lineages. Here, we describe a protocol for generating engineered lung tissues (ELTs) based on the multi-lineage recellularization of decellularized precision-cut lung slices (PCLS). ELTs contain alveolar-like structures comprising alveolar epithelium, mesenchyme, and endothelium, within an extracellular matrix (ECM) substrate closely resembling that of native lung. To generate the tissues, rat lungs are inflated with agarose, sliced into 450 &#181;m-thick slices, cut into strips, and decellularized. The resulting acellular ECM scaffolds are then reseeded with primary endothelial cells, fibroblasts, and alveolar epithelial type 2 cells (AEC2s). AEC2s can be maintained in ELT culture for at least 7 days with a serum-free, chemically-defined growth medium. Throughout the tissue preparation and culture process, the slices are clipped into a cassette system that facilitates handling and standardized cell seeding of multiple ELTs in parallel. These ELTs represent an organotypic culture platform that should facilitate investigations of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus as well as biochemical signals regulating AEC2s and their niche.

This protocol describes a method to generate reproducible, small-scale engineered lung tissues, by repopulating decellularized precision-cut lung slices with alveolar epithelial type 2 cells, fibroblasts, and endothelial cells.

Tessuti polmonari ingegnerizzati preparati da fette di polmone decellularizzate

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, failed by the first steps of the reconstructive ladder. Despite promising aesthetic and functional outcomes, the main limiting factor remains the need for a drastically applied lifelong immunosuppression and its well-known medical risks, preventing broader indications. Therefore, lifting the immune barrier in VCA is essential to tip the ethical scale and improve patients&#39; quality of life using the most advanced surgical techniques. De novo creation of a patient-specific graft is the upcoming breakthrough in reconstructive transplantation. Using tissue engineering techniques, VCAs can be freed of donor cells and customized for the recipient through perfusion-decellularization-recellularization. To develop these new technologies, a large-scale animal VCA model is necessary. Hence, swine fascio-cutaneous flaps, composed of skin, fat, fascia, and vessels, represent an ideal model for preliminary studies in VCA. Nevertheless, most VCA models described in the literature include muscle and bone. This work reports&#160;a reliable and reproducible technique for saphenous fascio-cutaneous flap harvest in swine, a practical tool for various research fields, especially vascularized composite tissue engineering.

The present protocol describes the porcine fascio-cutaneous flap model and its potential use in vascularized composite tissue research.

Un modello affidabile di lembo fascio-cutaneo suino per studi di bioingegneria di allotrapianti compositi vascolarizzati

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...