We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

1. Generazione di linee cellulari miniSOG <ol><li> Grow U2OS (osteosarcoma umano) cellule in un piatto da 35 mm contenente 2 ml di glucosio basso modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) che è integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 atmosfera. </li><li> Trasfezione le cellule quando sono l&#39;80% confluenti da lipofezione con qualità trasfezione purificato (A269 / 280 rapporto 1,8-2,0) costrutti plasmidici contenenti le sequenze per miniSOG e mCherry contrassegnati proteine ​​di riparazione secondo il protocollo del produttore del reagente trasfezione 19. I plasmidi di espressione miniSOG possono essere ordinati dalla Tsien-Lab: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Ordinare le cellule che esprimono la proteina ricombinante con il tag miniSOG e mCherry per fluorescenza delle cellule attivate ordinamento due giorni dopo la trasfezione. Raccogliere le cellulecon intensità di fluorescenza intermedio per evitare cellule che sono overexpressing 20. </li><li> Cultura le cellule positive su un piatto 10 cm in 10 ml di terreno DMEM che viene supplementato con 10% FBS e 0,6 mg / ml dell&#39;agente selezione G418 (geneticina). </li><li> Dopo colonie visibili sono emersi sulle piastre, schermo per mCherry colonie positive utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza e disegnare cerchi intorno a loro (sul fondo del piatto) con un pennarello indelebile. Utilizzare una lente obiettiva aria basso ingrandimento (ad esempio, 10x) e selezionare i cloni che usano una tecnica sterile grattando attentamente le colonie fuori e lentamente li succhia in una sterile, punta della pipetta 1000 ml. </li><li> Espandere le colonie selezionate e congelare parti di essi verso il basso con il mezzo di crescita descritto al punto 1.1 supplementato con 10% dimetilsolfossido. Metti alla prova le cellule per la formazione DRF da loro crescente su sterili 18 x 18 mm 2 vetrini e esponendoli a2 Gy di radiazioni. Le cellule che esprimono stabilmente irradiati un miniSOG mCherry taggati proteina riparazione deve mostrare il motivo caratteristica tipica focale di DSB quando visualizzati con un microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro-set per l&#39;imaging mCherry. </li></ol> Cultura 2. Cella <ol><li> Cultura cellule U2OS esprimono stabilmente la miniSOG e mCherry contrassegnati proteine ​​di riparazione alle condizioni descritte al punto 1.1. Crescere le cellule a 80% di confluenza in un piatto fondo di vetro di diametro 35 mm contenente 2 ml di DMEM. Assicurarsi che il collante che attacca il vetrino per la plastica e la plastica utilizzata è resistente alle soluzioni acquose e alcoliche e resistente alla resina utilizzata! </li><li> Prima di effettuare l&#39;esperimento, delineare una piccola superficie di circa 1 mm 2 che contiene cellule che esprimono proteine ​​ectopiche graffiando con una penna di diamante sterile utilizzando un microscopio a fluorescenza per identificare la regione di interesse. In alternativa, utilizzare un piatto fondo di vetro tcappello contiene un vetrino con un sistema a griglia di pre-inciso integrato nel vetrino. NOTA: Se si utilizza la microscopia correlativa di alta qualità che combina ESI e fluorescenza immagini microscopiche 21, assicurarsi che lo spessore del vetrino è compatibile con gli obiettivi ad immersione olio. Dovrebbe avere spessore No. 1.5 (0,16-0,18 mm). Scegliere una zona vicino al centro del piatto per la regione da esaminare nella TEM per evitare problemi con la polimerizzazione della resina che può verificarsi in prossimità dei bordi (vedi punto 4,10-4,13). </li></ol> 3. DNA Damage induzione <ol><li> Irradiare le cellule con radiazioni gamma, utilizzare un farmaco radiomimetico, o indurre il danno da micro irradiazione laser su un microscopio confocale (ad esempio, come descritto in 18,22 o 23). </li><li> In questo esempio, irradiare le cellule con 2 e 6 Gy di raggi gamma in un microirradiate cesio 137-sorgente di radiazione laser o utilizzando il sol 405 nmid laser a stato di un microscopio confocale dopo sensibilizzare le cellule per 20 minuti con 0,5 mg / ml Hoechst. </li></ol> Preparazione del campione 4. <ol><li> Fissare le cellule con 1 ml di 4% paraformaldeide cautela in tampone cacodilato 0.1 M di sodio o in 0,1 M tampone fosfato pH 7,4 per 30 minuti a RT al buio. ATTENZIONE: Paraformaldeide e cacodilato sodio sono tossici! Indossare guanti e smaltire in modo adeguato le sostanze tossiche. </li><li> Lavare le cellule due volte con 4 ml di 0,1 M tampone sodio cacodilato pH 7,4 o tampone fosfato pH 7,4. </li><li> Trattare le cellule fissate con glicina 2 ml di 50 mM, 5 mM amminotriazolo e 10 mM cianuro di potassio cautela in 0,1 M tampone sodio cacodilato o tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4) (controllare il pH!) Per 30 minuti per bloccare non reagito gruppi aldeidici e per sopprimere le specie reattive dell&#39;ossigeno generati da gruppi eme, che può aumentare il fondo. ATTENZIONE: cianuro di potassio è estremamente tossico! Wguanti orecchio, lavorano sotto un cappuccio e smaltire adeguatamente le sostanze tossiche. La reazione è molto sensibile al pH, quindi è importante che il pH verificato e preciso. </li><li> Registrare la zona che è stata selezionata al passo 2.2 in 2D o 3D su un microscopio a fluorescenza invertito, se la microscopia correlativa si desidera. </li><li> Preparare una / ml di soluzione di cloridrato ATTENZIONE diaminobenzidina 1 mg ponendo un 10 mg diaminobenzidina cloridrato in una provetta da 2 ml. Aggiungere 980 ml ​​di H 2 O distillata e 20 ml di acido cloridrico concentrato (11,65 M) e miscelare fino a che la soluzione è marrone chiaro e trasparente. Diluire questa soluzione 0,1 M di fosfato di sodio 0,1 M o tampone cacodilato ad una concentrazione finale di 1 mg / ml mentre regolando il pH con idrossido di sodio fino a pH tra 7,0 e 7,6 (pH 7.4 è raccomandato). ATTENZIONE: diamminobenzidina è tossico! Indossare guanti e smaltire in modo adeguato le sostanze tossiche. </li><li> Per fotoossidazione, replace buffer con 2 ml di una / ml soluzione di cloridrato diaminobenzidina 1 mg in 0,1 M tampone sodio cacodilato o tampone fosfato. Protect questa soluzione dalla luce e raffreddarlo in ghiaccio a 4 ° C al fine di aumentare la solubilità di ossigeno. Saturare la soluzione con facendovi gorgogliare ossigeno attraverso la soluzione (utilizzare un tubo che viene inserito nella soluzione e collegato ad una bombola di ossigeno). Controllare di nuovo il pH e regolare se necessario. NOTA: E &#39;fondamentale per la reazione fotossidazione che il pH è compreso tra pH 7,0 e pH 7,6. </li><li> Montare il piatto con le cellule fissate con cura su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di una lente obiettivo 40x olio di immersione e spostarlo l&#39;area di interesse. Excite il tag miniSOG con luce blu utilizzando cubi filtro per GFP o PCP. MiniSOG ha un massimo di eccitazione a 448 nm con una spalla a 473 nm 10. </li><li> Continuare con l&#39;illuminazione, anche dopo il verde miniSOG fluorescenza ettaris completamente scomparsi e finché il prodotto fotoossidazione marrone della diaminobenzidina polimerizzata emerge nel canale luce trasmessa. Quando il prodotto di ossidazione è visibile nella maggior parte delle cellule, disattivare l&#39;illuminazione a fluorescenza per arrestare la foto-ossidazione. NOTA: Foto-ossidazione può richiedere diversi minuti a seconda della lente dell&#39;obiettivo, le lunghezze d&#39;onda di trasmissione filtro e l&#39;efficienza, e la sorgente di illuminazione. </li><li> Postfix le cellule con 1 ml di 2% glutaraldeide in 0,1 M di sodio cacodilato pH 7,4 tampone o tampone fosfato pH 7,4 per 30 min. </li><li> Fissare le membrane delle cellule con 0,1% -0,5% tetrossido di osmio per 20 min in 0,1 M tampone sodio cacodilato pH 7,4 o 0,1 M tampone fosfato a pH 7,4. NOTA: si consiglia di utilizzare la concentrazione più bassa possibile di tetrossido di osmio necessario per stabilizzare le membrane. Poiché i precipitati DAB polimerizzate presentano un&#39;alta densità di azoto, che può essere rilevata direttamente da ESI, un forteosmio colorazione non è necessario per identificare la proteina miniSOG-tag e potrebbe essere dannoso per la ESI. Tetrossido di osmio è molto tossica! Lavorare in una cappa aspirante e smaltire adeguatamente i rifiuti tossici. </li><li> Disidratare le cellule attraverso una serie di etanolo usando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% etanolo (passaggi ogni 5 min). Successivamente, incubare le cellule in una miscela 1: 1 di etanolo al 100% e resina acrilica (LR bianco) e mettere il piatto su un agitatore per 4 ore per facilitare l&#39;infiltrazione nelle cellule prima incubando le cellule per almeno un altro 4 ore a 100 resina acrilica% (LR bianco). </li><li> Per polimerizzare la resina, tagliare il coperchio di una etichetta provetta 2 ml con una lama di rasoio e rivestire il cerchio con acceleratore resina acrilica. Assicurarsi che l&#39;acceleratore copre solo il cerchio e non scorre nel tubo. Successivamente, compilare accuratamente il tubo di circa due terzi con resina LR bianco con una pipetta Pasteur. Fare attenzione che la resina non entrare in contatto with l&#39;acceleratore sul cerchio! </li><li> Rimuovere la resina che infiltrato le cellule nel piatto e posizionare il piatto capovolto sul tubo microcentrifuga permanente posizione verticale in modo che la larghezza del tubo riempie quasi completamente la finestra di osservazione di vetro rivestita del piatto. </li><li> Attendere 1 per 2 min per l&#39;acceleratore per sigillare il tubo e il vetrino, poi invertire il tubo in modo che la resina nel tubo ora copre le cellule. </li><li> Porre la capsula con il tubo in un forno a 60 ° C e curare per 12 hr. </li><li> Quando il blocco viene guarito, rimuovere il piatto con la resina-riempito provetta attaccata dal forno e separare la provetta dal piatto. Facilitare la separazione dai cicli di gelo e disgelo in azoto liquido e acqua calda. </li><li> Eliminare il piatto fondo di vetro e tagliare con attenzione aprire la provetta con una lametta per rimuovere il blocco. </li><li> Etichettare il blocco con un pennarello indelebile. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio per trim il blocco in modo che solo la regione 1 mm 2 che contiene l&#39;area precedentemente segnato con la penna diamante o tungsteno (o contiene l&#39;area con le cellule di interesse) rimane. </li><li> Montare il blocco in un ultramicrotomo, tagliare il blocco con un coltello taglio e tagliare sezioni ultrasottili di circa 50 nm con un coltello di diamante. </li><li> Raccogliete le sezioni ad alta trasmissione 300 reti mesh. Queste griglie sono molto piccoli bar griglia e coprono quindi un minor numero di cellule nella zona di interesse. </li><li> Cappotto sezioni sulle griglie con circa 0,2-0,4 nm di carbonio utilizzando un dispositivo a induzione di carbonio per aiutarli a stabilizzare sotto il fascio di elettroni del TEM. </li></ol> 5. Microscopia Elettronica <ol><li> Caricare le griglie in un TEM che è dotato di un filtro di energia. Dopo aver sintonizzato il microscopio e il filtro di energia in base alle istruzioni del fabbricante, controllare le celle delle sezioni in modalità basso ingrandimento (trasmissione normale) e confrontareloro di fluorescenza dei dati quando opportuno (ottenuto nel passaggio 4.4). </li><li> Una volta che un nucleo con caratteristiche interessanti (danni al DNA delle tracce o riparazione del DNA foci) viene trovato, passare alla modalità di filtraggio energia e registrare una mappa di spessore. NOTA: Questa procedura include la registrazione di una perdita zero e un&#39;immagine non filtrata. Spessori fino a 0,3 cammino libero medio (30% degli elettroni del fascio incidente viene dispersa dal campione) sono abbastanza sottile per generare buone mappe elementari. </li><li> Mappe rapporto record di fosforo e azoto elementi utilizzando il software che controlla il filtro energia del microscopio utilizzato. Registrare le immagini successive fosforo mappa giuntati a 175 eV perdita di energia con una larghezza di 20 eV feritoia e pre-edge immagini a 120 eV perdita di energia, anche con una larghezza di 20 eV feritoia. Per le mappe di azoto, registrare immagini successive giuntati a 447 eV con fenditura di 35 eV e pre-edge immagini a 358 eV, anche con una larghezza di 35 eV feritoia. NOTA: Poiché il contenuto degli elementi di immagine (phosphOrus e azoto) è relativamente bassa (circa. 1%), scegliere &quot;Rapporto Immagine&quot; (qualitativa mappa elementale) sopra il &quot;metodo 3 finestra&quot; (quantificare mappa elementale) al fine di generare immagini con un segnale migliore di rumore. </li></ol> Elaborazione 6. Immagine <ol><li> Aprire le mappe rapporto elementari in un software di elaborazione delle immagini in grado di gestire il formato file delle immagini acquisite (ad esempio, Digital Micrograph). Copiare la mappa azoto nel canale rosso e la mappa di fosforo nel canale verde di un&#39;immagine RGB, sovrapporre e allineare le mappe. </li><li> Esportare l&#39;immagine composita come un file di formato di file di immagine con tag (TIFF). Apri l&#39;immagine con un software di elaborazione di immagini che può utilizzare strati (ad esempio, Photoshop). </li><li> Regolare la gamma dinamica di ciascun canale di riscalare i valori minimo e nell&#39;immagine di un set di dati a 8 bit (da 0 a 255). </li><li> Sottrarre il fosforo dalla mappa di azoto (utilizzando laFinestra &quot;livelli&quot;) al fine di generare una mappa qualitativa che mostra la distribuzione delle proteine. </li><li> Convertire le mappe del acido nucleico (fosforo) e proteine ​​(azoto) creato nella fase precedente in &quot;scala di colore&quot; e creare una tabella di ricerca gialla nello spazio colore CMYK per la mappa che mostra la distribuzione degli acidi nucleici e un tavolo ciano di ricerca per visualizzare la carta non nucleoproteina. I colori sono scelti per generare il massimo contrasto tra le due mappe elementari. </li><li> Creare una nuova immagine e importare i mappe che mostrano le distribuzioni di fosforo e proteine ​​come diversi strati. Utilizzare la modalità di trasparenza &quot;schermo&quot; per vedere entrambi gli strati sovrapposti l&#39;uno sull&#39;altro. </li><li> Aprite l&#39;immagine a perdita zero acquisito nel passaggio 5.2. Questa immagine rappresenta un&#39;immagine dell&#39;area registrata che assomiglia un&#39;immagine TEM convenzionale, ma contiene solo gli elettroni che sono passati attraverso il campione senza urtare il campione. Esportazionequesta immagine come immagine TIFF. </li><li> Aprite l&#39;immagine perdita pari a zero esportato in un editor di foto e copiarlo nella strato superiore della immagine che mostra la mappa elementare. Allineare l&#39;immagine utilizzando la modalità di trasparenza &quot;schermo&quot;. </li><li> Facoltativamente soglia dell&#39;immagine perdita zero per segmentare il segnale che proviene dal miniSOG. Aggiungere l&#39;immagine risultante come livello separato come descritto sopra. </li></ol>

<ol>
	<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometric+analysis+of+protein-+and+nucleic+acid-based+structures+in+the+cell+nucleus.">Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus.</a> Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).</li><li>Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Visualization+of+a+Protein+Nuclear+Architecture.">Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture.</a> Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).</li><li>Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microanalysis+of+biological+specimens+by+electron+energy+loss+spectroscopy+and+by+electron+spectroscopic+imaging.">High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging.</a> Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).</li><li>Leapman, R. D., Ornberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).</li><li>Simon, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spectroscopic+imaging.">Electron spectroscopic imaging.</a> Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).</li><li>Egerton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).</li><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+thickness+correction+of+EFTEM+phosphorus+maps.">Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps.</a> Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).</li><li>Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+molecules+employing+horseradish+peroxidase+as+reporter+enzyme+for+protein+localization+in+the+electron+microscope.">Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope.</a> Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLoS biology. 9, e1001041 (2011).</li><li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+foci:+H2AX+and+the+recruitment+of+DNA-damage+response+factors.">Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).</li><li>Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+Rad51+recombination+protein+in+somatic+cells+after+DNA+damage+and+its+localization+in+synaptonemal+complexes.">Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).</li><li>Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hMre11+and+hRad50+nuclear+foci+are+induced+during+the+normal+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).</li><li>Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+imaging+of+changes+in+the+structure+and+spatial+organization+of+chromatin,+gamma-H2A.X+and+the+MRN+complex+within+etoposide-induced+DNA+repair+foci.">High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).</li><li>Kruhlak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+chromatin+structure+and+mobility+in+living+cells+at+sites+of+DNA+double-strand+breaks.">Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).</li><li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones.">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).</li><li>Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sorting+conditions+for+the+selection+of+stable,+high-producing+mammalian+cell+lines.">Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines.</a> Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).</li><li>Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+spectroscopic+imaging+of+chromatin+in+situ.">Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ.</a> Methods in enzymology. , 375-456 (2004).</li><li>Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair.">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li><li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites.">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li><li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling.">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).</li><li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress.">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li><li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells.">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li><li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprint+of+'Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+(QuEST).">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ESI può servire come un ottimo strumento per l&#39;esame diversi stati di cromatina e ribonucleoproteine ​​nel nucleo, perché è in grado di mappare in particolare le aree che sono ricchi di fosforo. Essa aumenta profondamente la quantità di dettagli che può essere ottenuta con un microscopio elettronico e non dipende opposti metodi non specifici. Uno svantaggio di ESI è che richiede sezioni sottili di TEM convenzionale alla stessa tensione di accelerazione. Questo può essere superato lavorando con sezioni seriali o con metodi tomografici 28. Anche se un sacco di informazioni può essere ottenuto guardando le distribuzioni di fosforo e azoto, che è di interesse per essere in grado di mappare anche la distribuzione di alcune proteine. Con il metodo presentato in questo documento, è stato dimostrato che ESI potrebbe essere combinata con i metodi che si basano sulla polimerizzazione sito-specifica di diaminobenzidina. Anche se questo metodo non aggiunge un full nuovo colore a ESI, è chiaramente utile per mappare la distribuzione di una proteina. Ciò vale in particolare per proteine ​​che interagiscono con la cromatina. Se uno studio ha bisogno di visualizzare più popolazioni proteina, dei metodi di etichettatura utilizzando immunogold possono comunque essere utilizzati quando applicato come colorazione pre-embedding, prima fotoossidazione 9. Rispetto alle linee cellulari stabili, trasfezioni transienti hanno lo svantaggio che i livelli di espressione possono variare notevolmente tra le cellule e quindi rendere difficile trovare più cellule che esprimono simili quantità di proteina tag. Pertanto, si raccomanda la creazione di linee cellulari stabili. Tuttavia, è possibile valutare la quantità relativa di espressione della proteina mediante fluorescenza e selezionare cellule con un&#39;espressione intermedia seguenti trasfezione transiente. Anche se il tag di fusione miniSOG si è fluorescente, la sua resa quantistica è significativamente peggiore rispetto GFP (0,37 vs 0.6) 10. Per il purpose della microscopia correlativa, l&#39;aggiunta di un tag aggiuntivo proteina fluorescente come mCherry permette l&#39;imaging in cellule vive, senza la produzione di ossigeno singoletto che si verifica con miniSOG eccitazione. Il livello di espressione delle proteine ​​miniSOG-tag, la quantità di ossigeno nel buffer-DAB contenente, e il pH può anche influire sulla velocità di fotoossidazione. A volte può essere molto problematico per ottenere omogenea fotoossidazione nella regione di interesse a causa della dipendenza luce della reazione di fotoossidazione. Prolungato fotossidazione può portare a colorazione aspecifica e della deposizione di troppo metallo pesante nel campione, che può complicare il rilevamento di segnali specifici degli elementi da ESI. Il processo di fotossidazione richiede molto tempo in modo che di solito solo una piccola regione contenente poche cellule sul vetrino sono normalmente macchiato. Abbiamo dimostrato la combinazione di proteine ​​miniSOG etichettato con ESI utilizzando un monostrato di un aderente hulinea di cellule di cancro nell&#39;uomo. In linea di principio, il metodo può essere applicato a qualsiasi altro campione (lievito, batteri, tessuti, embrione) fintanto che è possibile esprimere la proteina miniSOG-tag a livelli ragionevoli e fintanto traslucidità e la diffusione di ossigeno e DAB è sufficientemente elevato per consentire una corretta fotoossidazione e quindi la colorazione omogenea. Per cellule in sospensione, sarebbe vantaggioso per fissare la posizione di cellule su un vetrino con un adesivo, come poli-L-lisina. Per i campioni più spessi, gli obiettivi con apertura numerica inferiore raggiungeranno un&#39;illuminazione più omogenea ma richiedere più tempo per foto-ossidare. Abbiamo presentato l&#39;uso di proteine ​​di fusione miniSOG-tag più vicino al protocollo originale pubblicato da Shu et al 10 possibile -. Compreso l&#39;uso di tetrossido di osmio. Ci si può osservare che, oltre preferenzialmente depositarsi sulla DAB-polimeri e membrane, tetrossido di osmio mostra alcuni reattività edeposizione su gran parte del materiale biologico nel campione (10 Figura 3). Tetrossido di osmio ha un vantaggio elementare a 45 eV. Questo segnale ei suoi plasmoni possono essere sovrapposti sullo spettro perdita di energia degli elettroni come lo spessore del provino aumenta e singoli elettroni subiscono più eventi di perdita di energia durante il passaggio attraverso il campione. Ciò può limitare la qualità delle mappe elementari fosforo se vengono utilizzate alte OsO 4 concentrazioni nella preparazione dei campioni. Le concentrazioni che abbiamo usato qui, che sono significativamente inferiori a quello che è stato utilizzato in precedenza 10, ha permesso la generazione di buone mappe fosforo qualità. In un esperimento utilizzando miniSOG tagged proteine ​​che esige maggiori OsO 4 concentrazioni, la migliore concentrazione che consente ancora una buona fosforo creazione di mappa dovrà essere determinato empiricamente. Abbiamo trovato che il polimero DAB che si forma alla foci riparazione del DNA è sufficiente denso per essere visto in modo TEM convenzionale (o in modalità a perdita zero con ancora maggior contrasto) anche quando post-fissazione con tetrossido di osmio è omesso (vedere Figura 8). La segmentazione dei segnali che sono stati registrati in questo modo è così robusta come con i campioni che sono stati trattati con l&#39;osmio. A seconda della proteina nucleare che deve essere visualizzato, le dimensioni delle strutture forma e la necessità di visualizzare i sistemi a membrana, l&#39;uso di tetrossido di osmio potrebbero non essere necessarie e la sua omissione rimuoverà il potenziale di mascherare la firma elementale di fosforo. Rispetto ad altre pubblicazioni che utilizzano ESI 18,29,30 abbiamo utilizzato diverse impostazioni per le immagini pre e post-edge per generare mappe rapporto elementare con la minor quantità di rumore. Abbiamo determinato empiricamente le impostazioni presentati nel manoscritto (vedi figura 9). Le impostazioni scelte intorno ai bordi dovrebbero portare a correggere elemappe mentali meno che le finestre di raccolta si sovrappongono con altri elementi presenti nel campione. Nel nostro caso, lo zolfo può essere un tale elemento. Poiché la concentrazione di zolfo (che si verifica nel aminoacidi metionina e cisteina) è molto bassa e contribuisce alla mappa calcolato solo in quantità trascurabile, riteniamo che il migliore rapporto S / N che abbiamo ottenuto utilizzando le impostazioni utilizzate qui superino gli svantaggi che potrebbe derivare da tracce di zolfo nel campione. Abbiamo rivelato l&#39;ultrastruttura di DRF a risoluzioni nanometri utilizzando le proteine ​​di riparazione del DNA MDC1, 53BP1 e RAD52 in combinazione con tecniche di ESI e TEM. L&#39;organizzazione della cromatina e individuale localizzazione delle proteine ​​di riparazione DSB è stata risolta utilizzando questo approccio. È stato mostrato loro localizzazione in domini ricchi di lesioni del DNA seguenti laser micro-irradiation DNA e la tendenza di proteine ​​di riparazione per riempire lo spazio tra le creste cromatina. Nel caso di RAD52, che plays un ruolo nella ricombinazione omologa, la formazione di strutture sferiche nucleari corpo simile lungo il binario danneggiata laser potrebbe essere osservato e questo era in contrasto con gli altri due proteine ​​testate. Quando il danno è applicata con raggi gamma, 53BP1 formò focolai intorno alla cromatina danneggiata. La composizione e la posizione relativa della cromatina e proteine ​​nel foci sembra cambiare nel tempo. Il rapporto tra queste proteine ​​e la cromatina danneggiata così come i cambiamenti nell&#39;organizzazione della cromatina e la composizione degli organi nucleari può essere facilmente ottenuto con la tecnica della ESI, mentre la microscopia in campo chiaro convenzionale utilizzando uranio e piombo come agenti contrastanti non possono valutare direttamente queste proprietà. Così, questa tecnica mostra un elevato potenziale per lo studio delle relazioni struttura-funzione, in particolare per processi che agiscono sul DNA.

Nonostante i progressi significativi nella microscopia ottica negli ultimi anni 1, cell-biologi soffrono ancora di una lacuna nella risoluzione. Questo limita comprensione delle relazioni struttura-funzione nei processi cellulari fondamentali che coinvolgono l&#39;interazione coordinata tra complessi macromolecolari (ad esempio, nel rimodellamento della cromatina, la riparazione del DNA, RNA trascrizione e replicazione del DNA). Sebbene microscopi elettronici a trasmissione (TEM) s fornire la risoluzione richiesta, è stato difficile da definire questi processi strutturalmente a causa della incapacità di etichettare specifiche proteine ​​pur essendo in grado di determinare la composizione biochimica delle strutture visualizzate. In assenza di membrane interne per aiutare a differenziare le strutture nucleari, il nucleo è stato particolarmente impegnativo. Electron spettroscopica di imaging (ESI) risolve alcune di queste limitazioni, consentendo la determinazione e differenziazione di DNA, RNA, e protein-based strutture nucleari 2-5. Elettrone di imaging spettroscopico: Per mappare distribuzioni elementari ad alta sensibilità e risoluzione al microscopio elettronico, si può usare uno spettrometro ad immagine che seleziona elettroni che sono stati anelasticamente dispersi attraverso le interazioni con elettroni guscio interno di un elemento nel campione 6. Poiché specifici dell&#39;elemento quantità di energia vengono persi come conseguenza della ionizzazione degli atomi nel campione, questi elettroni possono essere separati e visualizzati usando uno spettrometro che è collegato al microscopio elettronico. Pertanto, l&#39;analisi dello spettro degli elettroni che hanno interagito con il campione rivela informazioni qualitative e quantitative sulla composizione elementare del campione 7. Gli elettroni che non perdono energia quando passa attraverso il campione si trovano nella &quot;picco perdita zero&quot; della perdita di energia degli elettronispettro. L&#39;abbondanza di questi elettroni è correlato alla massa, densità e spessore del campione e comprende elettroni che passano attraverso il campione senza urtare il campione o perdere energia durante il passaggio attraverso il campione. Queste informazioni possono essere utili per la quantificazione assoluta dei numeri di atomi di un elemento specifico presente nel campione 8. Poiché campioni biologici consistono principalmente di elementi leggeri che mal deviano gli elettroni nel fascio incidente del TEM, metodi di colorazione utilizzando metallo pesante sali devono essere applicate in modo da generare contrasto nel campione. La mancanza di specificità della maggior parte di questi agenti di contrasto e l&#39;incapacità di visualizzare più di una macchia in cui la specificità è possibile ha limitato il valore di microscopia elettronica convenzionale nello studio del nucleo. ESI ha vantaggi significativi rispetto TEM convenzionali, in particolare per lo studio delle strutture del nucleo cellulare.È possibile sfruttare la natura ricca fosforo di DNA e complessi macromolecolari-RNA contenente distinguere complessi nucleoproteici da complessi proteici e risolvere diversi complessi nucleoproteici basate sulla loro densità di acidi nucleici. Il materiale biologico residuo può essere ripreso in base alla sua abbondanza di azoto. Mappatura solo questi due elementi e analisi della loro distribuzione e abbondanza relativa all&#39;interno di diverse strutture anatomiche ci fornisce un sacco di informazioni sul nucleo. Ad esempio, è facile identificare cromatina e ribosomi nella mappa rappresentano fosforo abbondanza. Lo spazio interchromatin, complessi del poro nucleare, e corpi nucleari, invece, possono essere facilmente individuati nell&#39;immagine azoto mappa. Mini sistema di generatore di ossigeno singoletto (miniSOG) Mentre ESI rappresenta una potente tecnica per studiare in situ struttura della cromatina, perché ci vuoles vantaggio dei rapporti caratteristici di composizione elementare tra il fosforo e l&#39;azoto, la composizione elementare non può essere normalmente utilizzati per discriminare tra le diverse popolazioni di complessi proteici. Anticorpi marcati con piccole particelle d&#39;oro nella gamma nanometri sono stati ampiamente utilizzati per mappare la posizione delle singole molecole. Poiché la particella oro viene normalmente collegato a un anticorpo secondario, apparirà entro una circonferenza di circa 20 nm circa l&#39;epitopo rilevato dal anticorpo primario. In campioni successivi-embedding, anticorpi possono rilevare solo epitopi che sono esposte alla superficie delle sezioni. Mentre è possibile dimostrare la presenza di un antigene e si riferiscono ad una certa struttura anatomica della cellula, le informazioni che si ottiene è incompleta, poiché la maggior parte degli epitopi sono oscurati da resina. Tecniche, che utilizzano protocolli simili a quelli utilizzati per la microscopia a fluorescenza Pre-embedding, consentire l&#39;accesso agli antigeni tuttol&#39;intera profondità del campione ma i passi permeabilizzazione necessari per consentire l&#39;anticorpo di penetrare cella tipicamente richiede la rimozione di membrane lipidiche e rimuovere i componenti che non possono essere risolti con aldeidi. Inoltre, il fissativo aldeide preferito per la conservazione ultrastruttura, glutaraldeide, comunemente distrugge epitopi e, di conseguenza, è in genere necessario paraformaldeide. Questo è meno efficace a proteina-proteina reticolazione. Un altro svantaggio di anticorpi che sono etichettati con una nanoparticella di oro è che l&#39;oro è un materiale molto elettron-denso che crea un forte contrasto che possono oscurare interessanti dettagli strutturali del campione, che ha più debole contrasto. L&#39;emergere della proteina verde fluorescente (GFP) come un tag di proteina espressa ha trasformato l&#39;uso di microscopia a fluorescenza per rispondere alle domande di biologia cellulare. Tagging una proteina con un piccolo dominio fluorescente permette mappatura della sua distribuzione in vivo </em&gt; senza la necessità di procedure di permeabilizzazione che possono alterare la struttura. Per tradurre il principio elegante di usare i tag proteine ​​per mappare distribuzioni cellulari delle proteine ​​di microscopia elettronica, un sistema era necessario che sia in grado di produrre un segnale in prossimità della struttura di interesse e generare contrasto nella TEM. Diaminobenzidina polimerizzato è una macchia che viene spesso utilizzato in istologia per rilevare legame degli anticorpi. Questa macchia è di solito depositato con perossidasi (HRP) coniugata con un anticorpo secondario. Sebbene la reazione produce un risultato affidabile, HRP non è cataliticamente attivo nel citosol delle cellule 9. I prodotti di reazione di HRP possono anche diffondono lontano dal sito di generazione in modo che la loro risoluzione è peggiore rispetto al metodo nanogold 10. Per bypassare questi problemi, il sistema / Reash Flash è stato sviluppato 11. È costituita da proteine ​​di fusione ricombinanti che possiedono un motivo tetracysteine. Questo motivo permette vincolanteun fluoroforo biarsenic. Quando eccitato, il flash associato o Reash è in grado di generare l&#39;ossigeno singoletto altamente reattivo e quindi photoconvert diaminobenzidina (DAB) in un polimero che precipita immediatamente al sito delle proteine ​​tag. Il polimero DAB può essere colorato con tetrossido di osmio, che è denso di elettroni e quindi può essere utilizzato per mappare la distribuzione della proteina di fusione ricombinante nel TEM. Nel 2011, Shu et al. 10 presentato il sistema miniSOG, che consiste in un piccolo 106 amino acidi tag fusione derivato da una flavoproteina di Arabidopsis che è fluorescente e in grado di creare molti radicali ossigeno singoletto eccitato con 448 quando nm luce blu. Tali radicali dell&#39;ossigeno singoletto possono essere utilizzati per foto-diaminobenzidina ossidare per formare polimeri sopra e vicino alla superficie della proteina marcata, che è notevolmente più vicino di anticorpi marcati immunogold 11. Mentre il sistema di flash / Reash richiede portare il fluorocromo e la diaminobenzidina nelle cellule prima di fare il fotoconversione, il sistema richiede solo miniSOG diaminobenzidina e luce e in aggiunta è circa due volte più efficace a polimerizzazione diaminobenzidina. Qui, miniSOG è impiegato in combinazione con ESI per mappare l&#39;ultrastruttura di riparazione del DNA focolai. Riparazione del DNA focolai (DRF) DNA non riparato doppie rotture dei filamenti rappresentano una grave minaccia alla cella in quanto possono portare a traslocazioni e la perdita di informazioni genetiche. A sua volta, questo può portare a senescenza, il cancro, e la morte cellulare. Molte proteine ​​che sono coinvolte nella riparazione del DNA a doppia interruzione filo accumulano nei focolai che assemblare intorno a un DNA a doppio filamento pausa 12-14. Anche se la loro funzione non è nota, rappresentano il sito nel nucleo che contiene il DNA a doppio filamento pausa ed è il sito di DNA a doppio filamento break riparazione. Riparazione del DNA foci (DRF) sono stati caratterizzati da microscopio a fluorescenza e servono come biomarcatori per danno al DNA 12,15. Sono massiccio rispetto alle dimensioni della pausa doppio filamento e sono stati considerati relativamente omogenea fino recenti studi di microscopia super-risoluzione rivelato alcune prove di sub-compartimentalizzazione delle molecole all&#39;interno di ogni fuoco 16. Per comprendere come sono organizzati questi siti, è necessario visualizzare tutte le strutture biologiche sottostanti rispetto all&#39;altro. Ciò non può essere ottenuto mediante microscopia a fluorescenza, ma è possibile attraverso microscopia elettronica 17,18. Qui, viene descritto un metodo che combina elettroni spettroscopica con il metodo miniSOG per illustrare il potenziale di questo approccio combinato di esplorare l&#39;ultrastruttura di DNA a doppio filamento break riparazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD&#160;</td>
			<td>not made for immersion objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White: acryl resin</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White accelerator</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td>
			<td>SPI</td>
			<td>1161123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten-Point Lab Pen</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>41148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater 208carbon</td>
			<td>Cressington</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra microtome Leica EM UC6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS5</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrograph V.2.30</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSOG-Constructs</td>
			<td>Tsien-Lab</td>
			<td></td>
			<td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDC1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rad52 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium 137 radiation source &#34;MARK 1&#34;</td>
			<td>&#160;(J.L. Shepherd &#38; Associated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FiJi</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife ultra 35&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming Knife ultratrim</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>12300</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>16020</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Medigas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-1,2,4-triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>207810</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>15058</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>71960</td>
			<td>Caution Sharp!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

I limiti della risoluzione ottica e la sfida di identificare popolazioni di proteine ​​specifiche in microscopia elettronica a trasmissione sono stati gli ostacoli in biologia cellulare. Molti fenomeni non possono essere spiegati mediante analisi in vitro in sistemi semplificati e necessitano di ulteriori informazioni strutturali in situ, in particolare nel campo tra 1 nm e 0,1 micron, per essere pienamente compreso. Qui, electron spettroscopica di imaging, una tecnica di microscopia elettronica di trasmissione che permette la mappatura simultanea della distribuzione delle proteine ​​e acidi nucleici, e un tag espressione, miniSOG, vengono combinati per studiare la struttura e l&#39;organizzazione di DNA a doppio filamento break riparazione foci.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI at JoVE.com

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

10.0K Views.  University of Alberta. Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Video: Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Ricerca

Biologia

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recupero di fluorescenza dopo Photobleaching di giallo fluorescente proteine Tagged p62 in Aggresome-come le strutture indotta

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)