Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051.406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101.171, e F32 DK 104516-01.

Affermazione Etica: Il Comitato Washington University Animal Studies approvato tutte le infezioni del mouse e procedure nell&#39;ambito del numero di protocollo 20120216, che è stato approvato 2013/01/11 e 2016/01/11 scade. Cura generale degli animali era in linea con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio da parte del Consiglio Nazionale delle Ricerche e la cura Resource Guide USDA animale. Eutanasia procedure sono in linea con le &quot;linee guida AVMA per l&#39;eutanasia degli animali edizione 2013&quot;. 1. UPEC UTI protocollo, inoculazione Ago Preparazione (Figura S1) <ol><li> Togliere il tappo del G 30 ago. Infilare circa 1 pollice di tubo PE10 sull&#39;albero dell&#39;ago. UV sterilizzare i gruppi di aghi durante la notte. Aghi cateterizzati possono essere conservati a tempo indeterminato in piastre Petri sterili. </li></ol> 2. UPEC batterica Inoculum Preparazione <ol><li> Preparare UTI89 inoculo (inizio 72 ore prima della inoculizione giorno) <ol><li> Streak UTI89 su un LB (Luria-Bertani) piastra di agar da uno stock congelato. Incubare per una notte a 37 ° C. Scegliere una colonia e inoculare in 10 ml di LB in un pallone da 125 ml. Incubare a 37 ° C per 24 ore, in modo statico. </li><li> Seminare 10 ml di coltura durante la notte in 10 ml di LB in un pallone nuovo 125 ml per altre 24 ore a 37 ° C, in modo statico. </li><li> Trasferimento 3 ml (variano in base alla tensione e alle dimensioni inoculo desiderato) per sterili provette da 1,5 ml e centrifugare a 7.000 xg per 3 min e risospendere il pellet in 1x PBS e centrifugare una seconda volta. Risospendere il pellet batterico in 1 ml di PBS 1x. </li></ol></li><li> Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione alla densità inoculo desiderato. La concentrazione standard dell&#39;inoculo utilizzato è 10 7 batteri; Tuttavia, questo può variare a causa del disegno dello studio. </li></ol> 3. batterica Inoculazione <ol><li> Pulire la stazione di lavoro con il 70% di etanolo e csu area con carta assorbente (o usare cappa a flusso sterile). </li><li> Disegna fino a 0,9 ml di inoculo batterico preparato in un 1 ml (TB) siringa (rimuovere le bolle d&#39;aria). Collegare un ago sterile inoculazione preparata con tubi PE10, sulla siringa contenente l&#39;inoculo, quindi sterilmente tagliare il tubo in polietilene. NOTA: Lasciare 1 mm tubo sopra la punta dell&#39;ago per evitare la puntura della vescica. </li><li> Tagliare un pezzo quadrato 1 pollice di parafilm e mettere una piccola quantità di lubrificante chirurgica (circa le dimensioni di una monetina) sulla parte superiore. </li><li> Anestetizzare femminile topi C3H / nubilato mettendoli in un vaso di vetro 32 once contenente una sfera di tè-infusore con batuffoli di cotone imbevuti di 3 ml di isoflurano o camera vaporizzatore (segue produce protocollo) fino incosciente ma ancora respirando normalmente (1 respiro / sec) . NOTA: Alcuni comitati IACUC non approvano l&#39;uso di un vaso o vaporizzatore. Si prega di seguire le indicazioni del comitato IACUC della vostra istituzione. NOTA: Se vaso di vetrocon tè-ball e / o di cono con batuffoli di cotone vengono utilizzate isoflurano-soakd, l&#39;animale deve essere osservato con attenzione per evitare overdose di anestetico e la morte. Il vantaggio di utilizzare una camera di vaporizzatore e anestesia è che fornisce somministrazione isoflurano controllato che evita overdose accidentale. ATTENZIONE: Isoflurano è un anestetico per inalazione. Utilizzare in un ambiente ben ventilato e ridurre al minimo l&#39;inalazione. </li><li> Rimuovere il mouse dal vaso / vaporizzatore e posizionarlo sul dorso su un tovagliolo di carta e diffondere le gambe. </li><li> Coprire il naso del mouse con un cono (un tubo collegato al vaporizzatore che fornisce una dose controllata isoflurance che è dotato su alcune unità vaporizzatore) o 50 ml tubo conico con un batuffolo di cotone contenente una piccola quantità (circa 1-2 ml ) di isoflurano. </li><li> Palpitate delicatamente la vescica per indurre la minzione e garantire una vescica annullata. Pulire la zona periuretrale con il 100% di etanolo pulire. Tamponare l&#39;inoculazione ago / siringa, primo punto, nelLubrificante chirurgico. </li><li> Inoculare ciascuna mouse con 50 microlitri della soluzione batteri inserendo l&#39;ago inoculazione transurethrally, di circa 12 mm, e premendo sullo stantuffo della siringa delicatamente per dispensare l&#39;inoculo in vescica delicatamente (10 ml / sec). Rimuovere l&#39;ago inoculazione dal mouse. NOTA: il ritorno immediato di inoculo in apertura uretrale quando si inizia per inoculare indica l&#39;inserimento improprio o incompleta dell&#39;ago. </li><li> Rimuovere il mouse dal cono e tornare alla sua gabbia. Ripetere i passaggi 3,3-3,8 per ogni mouse. Quando / se il passaggio di inoculo condizioni / ceppi, gettare la siringa e l&#39;ago inoculazione in un apposito contenitore approvato e ricominciare punto 3.2. NOTA: inoculazione di organismi uropatogeni generalmente non causa gravi sintomi di dolore. Tuttavia, in rari casi, la somministrazione di forti dosi di agenti patogeni può causare febbre, riduzione di cibo e acqua e l&#39;assunzione di un comportamento anomalo. LaNimal salute deve essere monitorato durante tutto l&#39;esperimento. Se i sintomi di dolore sono evidenti preavviso, un analgesico, come la buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea), può essere applicato. Le procedure dovrebbero essere in accordo con IACUC di ciascuna istituzione. </li></ol> 4. Determinazione degli oneri batteriche <ol><li> Preparare separati 5 ml provette per ogni coppia vescica e reni per essere raccolto. Aggiungere 1 ml di PBS 1x / tubo / mouse vescica per essere raccolte. Aggiungere 0,8 ml di PBS 1x / tubo / coppia di reni del mouse per essere raccolto. Etichettare ogni provetta corrispondere ad un determinato mouse. Preparare una piastra a 96 pozzetti contenenti 180 ml di PBS 1x in ogni pozzetto per 01:10 diluizioni seriali. </li><li> Pulire l&#39;area di lavoro con il 70% di etanolo e coprire l&#39;area con una copertura o tovagliolo di carta assorbente. </li><li> Anestetizzare il mouse con isoflurano (vedi punto 3.4) fino a quando il mouse smette di respirare per circa 1 minuto, poi posizionarlo sul coperchio o tovagliolo di carta assorbente. Altri metodi di euthanaSia sono accettati anche da comitati IACUC, come l&#39;anidride carbonica, e può essere sostituito in caso di sovradosaggio isoflurano. </li><li> Sacrificare il mouse rapida dislocazione cervicale che consiste di immobilizzare la collo alla base della testa e tirando la coda distanza orizzontale dal corpo finché non si verifica dislocazione. NOTA: La maggior parte dei comitati IACUC richiedono un mezzo secondario di eutanasia e dislocazione cervicale è un metodo comune. Tuttavia, altri metodi possono essere utilizzati, se approvato dal comitato IACUC. </li><li> Posizionare il mouse guasto sul dorso e spruzzare 70% di etanolo sull&#39;addome. Sezionare il mouse, raccogliere la vescica e reni, in questo ordine per minimizzare la contaminazione potenziale dal sangue dopo la dissezione rene. Posizionare gli organi in modo indipendente nei preparati da 5 ml provette contenenti 1x PBS (vedi punto 4.1). NOTA: utilizzare forbici diverse per la dissezione esterna e per il prelievo di organi per ridurre al minimo la contaminazione. </li><li> Toccare il tubo per assicurare gli organi sono in tegli 1x PBS. Ripetere il passaggio 4,3-4,5 per ogni mouse. Forbici pulite e pinze in etanolo al 70% dopo ogni mouse. </li></ol> 5. batterica Recovery <ol><li> Omogeneizzare vescica raccolti e reni nelle provette da 5 ml con un omogeneizzatore tessuto, 15 sec per rene e 30 sec per la vescica. Sciacquare omogeneizzatore sequenzialmente in 1x PBS, il 70% di etanolo e 1x PBS tra i campioni. </li><li> Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -8 e piastra ogni diluizione per UFC (unità formanti colonie) su piastre di agar LB. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo. </li></ol> 6. IBC Enumeration <ol><li> Asetticamente rimuovere la vescica e posizionarlo in 1x PBS in una piastra da 6 pozzetti con fondo silicone. Le piastre possono essere preparati utilizzando un kit di elastomero di silicone e versando circa 1 cm di silicone in ogni pozzetto, vedere produce istruzioni. Tagliare la vescica a metà con le forbici. </li><li> Utilizzando piccoli perni metallici splay delicatamente la fogliader modo che il lume della vescica è rivolto verso l&#39;alto. Assicurarsi di posizionare i perni sui bordi più esterni delle sezioni vescica per garantire la quantità massima di dell&#39;urotelio è esposto. </li><li> Dopo strombatura, lavare delicatamente la vescica una volta con PBS 1x. Rimuovere la PBS 1x per pipetta. Fissare la vescica aggiungendo abbastanza 3% paraformaldeide per coprire l&#39;intera vescica strombato. ATTENZIONE: Paraformaldeide è cancerogeno. Attrezzatura protettiva adatta, compresi i guanti, deve essere indossato in ogni momento. I rifiuti devono seguire le linee guida istituzionali. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovere la soluzione paraformaldeide. Lavare una volta con PBS 1x. </li><li> Lavare con soluzione di lavaggio LacZ (2 mM MgCl 2, 0,01% sodio desossicolato e 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) tre volte per 5 minuti a lavaggio. </li><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere abbastanza macchia LacZ (9,5 ml di soluzione di lavaggio LacZ, 0,4 ml di 25 mg / ml di X-gal e 0,1 ml di 100 mM K-ferrocianuro / K-ferricianuro) per coprire le vesciche. Incubare a 30 ° C overniGHT al riparo dalla luce. </li><li> Rimuovere vesciche strombate da incubatore e osservare IBC, che appaiono come blu puncta come visualizzato con un ambito dissezione, 40-60X ingrandimento. NOTA: A volte un mouse può urinare prima del posizionamento del tubo sotto l&#39;uretra. In questo caso, attendere 15-20 minuti prima di tentare di raccogliere di nuovo le urine. </li></ol> 7. raccolta di urine per batteriuria CFU Enumeration (non applicabile per CAUTI) <ol><li> Per la raccolta delle urine pre o post infezione frenare dolcemente il mouse tenendo la coda e collocata su una superficie elevata piatta (parte superiore della gabbia del mouse). </li><li> Tenere una provetta sterile da 1,5 ml sotto l&#39;uretra mouse. Premere delicatamente verso il basso sul retro del mouse vicino alla coda per esercitare una pressione alla vescica. Cattura l&#39;urina nella provetta da 1,5 ml. </li><li> Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -7 e piastra ogni diluizione adeguati LB. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo. </li></ol> 8. CAUTI modello di protocollo, catetere Ago Preparazione per CAUTI Model (figura S2) <ol><li> Togliere il tappo del G 30 ago. Tagliare un pezzo 7 millimetri di tubo PE10 e 5 mm pezzo di tubo in silicone come RenaSIL. Infilare l&#39;ago con tubi PE10 finché il tubo tocca la base dell&#39;ago. </li><li> Poi alimentare il pezzo 5 millimetri sul ago-PE10 contenenti. UV sterilizzare i aghi assemblee durante la notte. NOTA: Quando si carica il tubo di silicone, lasciare circa 1 millimetro del tubo che si estende oltre la punta dell&#39;ago. </li></ol> 9. E. faecalis OG1RF batterica Inoculum Preparazione <ol><li> Preparare OG1RF inoculo di partenza 48 ore prima del giorno inoculazione. Streak OG1RF su un BHI (Brain Heart Infusion) piatto da uno stock congelato. </li><li> Scegli una colonia e inoculare in 10 ml di BHI e coltivarla staticamente per 18 ore a 37 ° C. Centrifugare la cultura e lavare il pellet (3 volte) in 1 ml di volume di PBS sterile 1x. </li><li> Risospendere il pellet batterico in 1x PBS. Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione alla dimensione inoculo desiderato. La concentrazione standard dell&#39;inoculo utilizzato è 10 7; tuttavia, questo può variare a causa del disegno dello studio </li></ol> 10. Catetere impianto <ol><li> Pulire la stazione di lavoro con il 70% di etanolo e coprire l&#39;area con una copertura assorbente (o usare cappa a flusso sterile). </li><li> Fissare il catetere-ago a un vuoto 1 ml (TB) siringa. Tagliare un pezzo quadrato 1 pollice di parafilm e mettere una piccola quantità di lubrificante chirurgica (circa le dimensioni di una monetina) sulla parte superiore. NOTA: Due aghi differenti sono utilizzati per la deposizione del catetere e per l&#39;inoculo di minimizzato inoculazione accidentale dovuto alla manipolazione meccanica necessaria per l&#39;impianto del catetere. Questo permette anche per la comodità di preparare un minor numero di aghi di inoculazione. </li><li> Anestetizzare C57BL / 6 topi mettendoli in un vaso di vetro contenente 32 once un tèpalla -infuser con batuffoli di cotone imbevuti di 3 ml di isoflurano o camera vaporizzatore (segue produce protocollo) fino incosciente ma ancora respirando normalmente (1 respiro / sec). </li><li> Poi mettere il mouse sul dorso su un tovagliolo di carta e diffondere le gambe. Coprire il naso del mouse con un cono di naso o tubo da 50 ml con batuffoli di cotone contenente una piccola quantità (circa 1-2 ml) di isoflurano. ATTENZIONE: Isoflurano è un anestetico per inalazione. Utilizzare in un ambiente ben ventilato e ridurre al minimo l&#39;inalazione dal ricercatore. </li><li> Palpitate delicatamente la vescica per indurre la minzione e garantire una vescica annullata. Pulire zona periuretrale con etanolo al 100% pulire. </li><li> Disinfettare la zona periuretrale con soluzione di iodio-povidone al 10% con un applicatore di cotone-punta. Tamponare l&#39;inoculazione ago / siringa, primo punto, nel lubrificante chirurgico. NOTA: povidone-iodio viene utilizzato per l&#39;impianto del catetere, che è una soluzione asettica forte di alcol. Catetere impianto richiedepiù manipolazione meccanica per inserire il catetere e quindi un maggiore potenziale di contaminazione. </li><li> Inserire il catetere nell&#39;apertura uretrale. Una volta in, utilizzare pinzette per spingere la (7 millimetri PE10) lungo pezzo verso la vescica, quindi spingendo la (5 mm silicone) piccolo catetere e depositarlo nella vescica. Rimuovere l&#39;ago, con il tubo 7 millimetri ancora attaccato, immediatamente. </li></ol> 11. batterica Inoculazione <ol><li> Seguire il protocollo di inoculazione batterica nella sezione 3, utilizzando l&#39;inoculo preparato dalla sezione 9. Rimuovere il mouse dal cono naso e tornare alla sua gabbia </li></ol> 12. A ciascun intervallo di Sacrifice <ol><li> Preparare provette da 5 ml per la vescica e del rene (per organi seguire passo 4.1) e 1,5 ml provetta Eppendorf per cateteri. Aggiungere 1 ml di PBS 1x in 1,5 ml provetta Eppendorf per i campioni catetere </li><li> Seguire i passaggi 4,3-4,5. Sezionare il mouse, la raccolta della vescica, reni e del catetere, placing i tessuti in modo indipendente in 5 provette ml contenenti 1x PBS e il catetere nel 1,5 ml Eppendorf (vedi punto 12.1). NOTA: utilizzare forbici diverse per la dissezione esterna e per la raccolta di organi e il recupero del catetere per minimizzare la contaminazione </li><li> Poi seguire passo 4.6. </li></ol> 13. batterica Recovery <ol><li> Per gli organi, seguire i passi 5.1 e 5.2. Per il recupero batterica da cateteri, vortex alla velocità massima per 30 sec, sonicare campioni catetere per 5 minuti utilizzando un bagno sonicatore, e poi vortex alla velocità massima per altri 30 sec. </li><li> Fai seriali diluizioni 1:10 out a 10 -8 e piastra ogni diluizione per CFU enumerazione su piastre BHI. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte e contare le colonie il giorno successivo. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Comunità Semplice acquisito UTI è un&#39;infezione comune e costosa contabilità per diversi milioni di visite di assistenza primaria ogni anno 46. Inoltre, Cautis sono un sanitario comune infezione acquisita che è diventato estremamente oneroso per gli operatori sanitari, come i Centri di Medicare e Medicaid Services non rimborsa i fornitori per il costo aggiunto di trattamento risultante dall&#39;ospedale acquisito CAUTI 45. I modelli murini di UTI, sia cistite non complicata e CAUTI, descritti in questi protocolli forniscono strumenti preziosi per la comprensione delle basi molecolari delle interazioni ospite e patogeno necessari per l&#39;avvio, il mantenimento, e modulando il risultato di diverse forme di UTI. Questi modelli consentono l&#39;applicazione di potenti genetica batterica e mouse, immunologici, microscopico, strumenti genetici biochimici e chimici per l&#39;analisi di UTI 23,47-49. Inoltre, i protocolli qui esposti hanno fornito una piattaformaper lo sviluppo e la sperimentazione di nuove strategie terapeutiche e preventive comprese le piccole molecole inibitrici della virulenza batterica e nuovi bersagli di vaccinazione e le strategie di 50-55. Ci sono diverse condizioni critiche che devono essere mantenute per l&#39;applicazione di successo del modello di cistite non complicata. Come per tutte le procedure del mouse anestesia, la cura deve essere presa per prevenire la mortalità del mouse a causa di un eccesso di anestesia. Nel preparare il catetere inoculazione, il tubo di silicone deve essere sufficientemente lungo da coprire la punta dell&#39;ago, ma non così lungo da danneggiare la parete della vescica sulla cateterizzazione. Inoltre, a causa della vicinanza e dimensioni dell&#39;apertura vaginale, bisogna fare attenzione ad inserire il catetere inoculo nell&#39;uretra e non la vagina. Durante strombatura vescica per IBC enumerazione, è essenziale che le vesciche essere divaricate il più rapidamente possibile dopo la dissezione e il tessuto da fissare per approximately 1 ora, ma non durante la notte. Per IBC enumerazione LacZ colorazione, è anche necessario che il batterio in questione produce LacZ durante la colonizzazione delle cellule uroteliali. Quando si utilizza ceppi dove l&#39;enzima LacZ non si produce, è ancora possibile enumerare IBC con immunofluorescenza con anti- E. anticorpi coli o GFP batteri che esprimono. Una caratteristica particolare di questo modello è i modelli differenti di progressione della malattia e la gravità presentato da diverse linee pure del mouse e il potenziale patogeno variabile del prototipo UPEC ceppi 33,56. Queste differenze sono sia un punto di forza e la limitazione di questa tecnica in quanto riassumono la variazione naturale di suscettibilità dell&#39;ospite e della diversità patogeno che è stata osservata negli studi clinici e fenotipici mentre complicando disegno sperimentale e l&#39;interpretazione 57,58. Queste variazioni forniscono fonti di confronto che consentono di chiarire ospite e Mechan battericoismi modulando la patogenesi della semplice UTI 33,56. Tuttavia, significano anche che, a causa del diverso grado di linea di topi UTI suscettibilità, la massima cura deve essere presa nella scelta della linea di topi corretta e tensione UPEC per affrontare il problema particolare un investigatore sta chiedendo. Ad esempio, topi C57BL / 6 sono un ottimo modello di infezione acuta, presentano titoli elevati batteriche e un gran numero di GIR a primi punti temporali. Questo ceppo poi risolve rapidamente l&#39;infezione tra i 3 ei 7 dpi con la sola colonizzazione persistente derivante da infezioni renali gravi e quiescenti serbatoi intracellulari 33,34. Il / 6 modello C57BL può rappresentare accuratamente il risultato più comune per molti pazienti UTI in cui i sintomi presenti e poi risolvono. Al contrario, il mouse sfondo C3H / nubilato presenta un alto grado di sensibilità a cistiti croniche che li rende un ceppo ideale per studiare IVU ricorrenti. Sono stati inoltre istituiti Altri modelli UTIin CBA, DBA e C3H / HeJ topi sfondo dimostrando utile per studiare particolari aspetti di UTI 33,59. Lo svantaggio sperimentale primaria esposto dal modello cistite non complicata è l&#39;esistenza di più colli di bottiglia infezione limitare l&#39;applicazione di metodologie di screening su larga scala genetica per la scoperta di nuovi fattori batterici necessari per acuta, cronica e ricorrente cistiti 60. Le considerazioni critiche per il modello cistite non complicata tutti si applicano al modello CAUTI basato impianto con due ulteriori preoccupazioni. In primo luogo, occorre prestare attenzione a garantire che l&#39;inserimento dell&#39;impianto avviene in modo sterile, a causa della maggiore suscettibilità alle infezioni della vescica conferito dall&#39;impianto. In secondo luogo, è essenziale che il catetere sia tenuto in posizione durante la rimozione dell&#39;ago impiantazione. I principali limiti del modello CAUTI sono che ha una gamma ridotta di accoglienza disponibili background genetico, il propensity per la perdita del catetere nel tempo e l&#39;incapacità di raccogliere l&#39;urina a causa di una disfunzione della vescica derivanti da impianto. Per compensare la perdita di impianto e l&#39;impossibilità di monitorare l&#39;infezione tramite analisi delle urine longitudinale, questo modello richiede in genere un numero maggiore di topi cateterizzato per momenti successivi e gruppi di topi devono essere sacrificati in ogni punto desiderato. L&#39;host limitato sfondi risultati genetici alla frequenza proibitivo in cui alcuni ceppi di topi, come C3H / nubilato, perdono l&#39;impianto (P. Guiton, comunicazione personale 2010). Come risultato, i protocolli Cauti sopra descritte sono solo stati ottimizzati nel ceppo C57BL / 6 del mouse. Tuttavia, mentre la limitazione di ceppi di topi disponibili per CAUTI è un peccato, molte varianti genomiche sono state stabilite in C57BL / 6 di fondo e il modello CAUTI espande la diversità batteriologico disponibili per lo studio durante UTI alterando l&#39;ambiente vescica per facilitare la colonizzazione da parte di organismi che sonoaltrimenti non patogeni nel modello murino di UTI. Un esempio di questo è la recente scoperta del ruolo di Fg rilasciato durante catetere indotta infiammazione della vescica in E. crescita faecalis, formazione di biofilm, e persistenza durante CAUTI 42. Questo esempio illustra la potenza del modello di impianto di CAUTI nel chiarire non solo meccanismi molecolari della patogenesi batterica ma anche il ruolo di fattori dell&#39;ospite durante l&#39;infezione. Tutte queste caratteristiche contribuiscono a comprendere questa infezione clinica rilevante, che è stato in precedenza understudied. Oltre agli approcci sperimentali sopra descritti, i modelli murini di cistite e CAUTI sono suscettibili di numerose modifiche metodologiche. Nel caso del modello cistite non complicata, queste modifiche possono includere la riduzione del volume inoculazione e la forza applicata durante l&#39;instillazione dell&#39;inoculo per ridurre il numero di batteriintrodotto nei reni 61, variando la durata dell&#39;infezione, sacrificando in momenti già nel 1 hpi e mediante saggi di protezione gentamicina per valutare il grado in cui la uropatogeno ha invaso la vescica cellule epiteliali 62. Le vesciche strombate da topi sacrificati tra 6 e 24 HPI possono essere sezionato e colorati con gli anticorpi ai vari host e / o epitopi batteriche e osservati al microscopio confocale a fluorescenza o di osservare la struttura IBC, flussaggio batterica e filamentazione e tessuto ospite condizioni 25,33 , 63,64. L&#39;effetto di infezione uropatogeno e / o l&#39;impianto sulle risposte immunitarie locali e sistemici del paese ospitante può essere valutata utilizzando il sistema di citometria tallone Bioplex o test basati ELISA per determinare i livelli di citochine nelle urine o nel siero, rispettivamente, 33,65. Infine, la condizione del tessuto della vescica, la posizione e la morfologia di colonizzazione batterica e la struttura del biofilm depositato suil catetere può essere valutata da varie tecniche di imaging tra cui microscopia elettronica 25,41. Questi modelli di base di infezione può anche essere adattati per imitare altri fenomeni clinicamente rilevanti tra cui ricorrenti UTI e lo sviluppo di una risposta immunitaria adattativa attraverso infezioni multiple. In questo contesto, ripetuta infezione di C57BL / 6 topi risultati in maggiore resistenza cistite acuta mentre nel modello C3H / gallina, previo lo sviluppo di cistite cronica seguita dalla liquidazione dell&#39;infezione tramite la somministrazione di antimicrobici sensibilizza questi topi sviluppare cistite cronica nelle successive 66 vaccinazioni. Inoltre i meccanismi molecolari di fattori di rischio per lo sviluppo di UTI possono essere esaminati. Il diabete e l&#39;obesità hanno entrambi dimostrato di aumentare la frequenza e la gravità delle infezioni del tratto urinario. Il diabete di tipo 2 può essere geneticamente modellati nei topi in background FVB / NJ e un modello indotto chimicamente di diabete di tipo 1 è already dimostrato di aumentare la gravità delle infezioni del tratto urinario causate da entrambi UPEC e K. pneumophila 67,68. Infine, questi sistemi modello rappresentano un banco di prova ideale per lo sviluppo e l&#39;ottimizzazione delle modalità terapeutiche volte a curare o prevenire UTIs e Cautis. La comprensione molecolare della patogeno ospite forniti da questi modelli ha già favorito lo sviluppo di strategie di vaccinazione efficaci volte a colpire importante fattori di virulenza 51-55. Inoltre, piccole molecole inibitrici di UPEC adesione hanno dimostrato di essere efficaci nel trattamento di semplice UTIs acuta e cronica, nonché Cautis causata da UPEC 12,69,70. Entrambi i modelli UTI e Cauti semplici descritti in questi protocolli forniscono gli strumenti sperimentali per analizzare i dettagli molecolari delle interazioni ospite-patogeno del tratto urinario. Questi strumenti possono essere sfruttati in molti modi per espandere la nostra understanding di questo complesso insieme di condizioni e facilitare lo sviluppo di più efficaci interventi terapeutici.

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The ethics statement has been updated from:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the &#8220;AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.&#8221;
to:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the &#8220;AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.&#8221;
Step 3 has been updated from:
3. Bacterial Inoculation
<ol>
	<li>Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).</li>
	<li>Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing. 
	NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.</li>
	<li>Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.</li>
	<li>Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec). 
	NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution. 
	NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.</li>
	<li>Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.</li>
	<li>Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.</li>
	<li>Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.</li>
	<li>Inoculate each mouse with 50 &#181;l of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 &#181;l/sec). Remove the inoculation needle from the mouse. 
	NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.</li>
	<li>Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.&#160;&#160; 
	NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05&#8722;0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution&#8217;s IACUC.</li>
</ol>
to:
3. Bacterial Inoculation
<ol>
	<li>Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).</li>
	<li>Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing. 
	NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.</li>
	<li>Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.</li>
	<li>Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec). 
	NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution. 
	CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.</li>
	<li>Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.</li>
	<li>Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.</li>
	<li>Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.</li>
	<li>Inoculate each mouse with 50 &#181;l of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 &#181;l/sec). Remove the inoculation needle from the mouse. 
	NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.</li>
	<li>Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.&#160;&#160; 
	NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05&#8722;0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution&#8217;s IACUC.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52892/establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Infezioni del tratto urinario (UTI) sono una delle più comuni infezioni batteriche e possono essere suddivisi in due categorie a seconda del meccanismo di acquisizione, comunità e nosocomiali acquisita UTI. IVU si verificano spesso nelle donne e negli studi altrimenti sane acquisita in comunità hanno dimostrato che circa il 50% delle donne avranno almeno un UTI nella vita 1. Inoltre, la recidiva è un grave problema. Una donna che ha una infezione acuta iniziale ha una probabilità del 25-40% di avere una seconda infezione entro sei mesi, nonostante adeguato trattamento antibiotico e molte donne continuano ad avere recidive frequenti 2. I batteri che causano queste infezioni stanno diventando resistenti ulteriori protocolli terapeutici sempre più confondenti antibiotico 3-6. UTI colpiscono milioni di persone ogni anno costano circa 2,5 miliardi di dollari di spese relative di assistenza sanitaria negli Stati Uniti, sottolineando l&#39;impatto e prevalenza della malattia1,7 .Nosocomial acquisito IVU sono associati principalmente con la presenza di corpi estranei, quali cateteri. Catetere-associate infezioni del tratto urinario (CAUTI) rimangono il nosocomiale più comune acquisito UTI, pari al ~ 70-80% di tali infezioni 8. Inoltre, CAUTI è associata ad un aumento della morbilità e della mortalità ed è la causa più comune delle infezioni del sangue secondarie 9. UPEC comunità associata acquisita IVU sono pensato per essere causato dall&#39;introduzione di batteri nella vescica da giacimenti nel tratto gastrointestinale attraverso la manipolazione meccanica durante il rapporto sessuale, scarsa igiene o di altri dinamica delle popolazioni microbiche tra host differenti nicchie 10. Una volta dentro la vescica, UPEC impiegano numerosi fattori di virulenza, tra cui capsule, sistemi di acquisizione di ferro, le tossine, un plasmide di virulenza, tRNA, isole di patogenicità e fattori di colonizzazione che hanno dimostrato di avere un ruolo nella patogenesi &lt;sup&gt; 11-14. Fondamentale per la creazione di colonizzazione UPEC, UPEC codificare anche più tipi di chaperone adesivo usciere pathway (CUP) pili che riconoscono i recettori con specificità stereochimica 15. Tipo 1 pili, rovesciato con l&#39;adesina FimH, sono espressi da UPEC e BIND uroplakins 16 e α-1, β-3 integrine 17, che si esprimono sulla superficie luminale di entrambe le vesciche umane e di topo 18 mannosylated. Queste interazioni FimH mediata facilitano la colonizzazione batterica e l&#39;invasione delle cellule epiteliali superficiali 19,20. Una volta all&#39;interno della cellula, UPEC può sfuggire nel citoplasma dove un singolo batterio può rapidamente dividere per formare una comunità batterica intracellulare (IBC), che A maturazione, può contenere circa 10 4 21 batteri. Formazione IBC è stata dimostrata in almeno sei diversi ceppi di topi, C3H / nubilato, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / NJ e BALB / c, e con una grande varietà di differenti UPECeppi C e altri enterobatteri 22-24. Tuttavia le differenze temporali e spaziali della formazione IBC può variare a seconda del fondo mouse e il ceppo infettante UPEC. In topi C3H / HeN infettati con il prototipo UPEC ceppi UTI89 o formazione CFT073, IBC possono essere visualizzati come piccoli biomasse di batteri già il 3 HPI (infezione post hr). Questa comunità continua ad espandersi e raggiunge un &quot;punto medio&quot; di sviluppo circa 6 hpi quando i batteri astiformi occupano una grande percentuale di spazio citoplasmatica di cellule superficiali ombrello terminalmente differenziate Questi prima forma GIR in maniera relativamente sincrono con la maggioranza visualizzazione dimensioni simili e morfologie. ~ 8 hpi i batteri nel cambiamento IBC da un bacilli a Cocci morfologia. IBC sono di natura transitoria. Così, IBC maturazione 12-18 risultati HPI in continua espansione della popolazione batterica, seguito dal loro filamentazione e dispersione dal wi cellulareth successiva diffusione di cellule vicine 23. Così, la nicchia IBC consente per la crescita batterica rapida in un ambiente protetto dalle risposta immunitaria e antibiotici 25. Le fasi distinte di infezione UPEC che si vedono nei topi si osservano anche negli esseri umani, come i GIR ei filamentazione, sostenendo il modello murino di UTI come uno strumento utile che può essere utilizzato per modellare UTI nell&#39;uomo 22,26-28. Mentre la maggioranza delle donne sperimenta un UTI nella vita, l&#39;esito di queste infezioni può variare da infezione autolimitante acuta senza recidiva, a frequentare cistiti ricorrenti. Inoltre, gli studi hanno dimostrato una forte presenza familiare di UTI, il che suggerisce una componente genetica contribuisce alla UTI suscettibilità 29. Abbiamo scoperto che i diversi risultati UTI visto in cliniche possano essere riprese dai risultati diversi di infezione sperimentale UPEC tra ceppi di topi inbred 30. Ad esempio, C3H / nubilato, CBA, Topi DBA e C3H / HeOuJ sono suscettibili, in maniera dose-dipendente infettiva, a lunga durata, cistite cronica caratterizzata da persistente, batteri alto titolo (&gt; 10 4 unità formanti colonie (CFU) / ml), alto titolo batteriche oneri vescica al sacrificio&gt; 4 settimane dopo l&#39;infezione (WPI), infiammazione cronica, e necrosi uroteliale. Questi topi mostrano anche elevati livelli sierici di IL-6, G-CSF, KC, e IL-5 entro il primo 24 HPI che servono come biomarcatori per lo sviluppo di cistite cronica. Questo può rappresentare accuratamente il corso naturale della UTI in alcune donne, come gli studi placebo hanno dimostrato che una grande percentuale di donne che subiscono UTI manterrà livelli elevati di batteri nelle urine per diverse settimane dopo i primi sintomi della cistite se non somministrato il trattamento antibiotico 31 , 32. Inoltre, utilizzando topi C3H / nubilato, abbiamo scoperto che una storia di cistite cronica è un fattore di rischio significativo per le successive gravi infezioni ricorrenti. Ricorrente UTI è la più significant manifestazione clinica della UTI e il topo C3H / nubilato è attualmente il modello studiato solo che riassume una maggiore predisposizione dopo l&#39;esposizione precedente. Un altro risultato UTI è ricapitolato in C57Bl / 6 topi in cui l&#39;infezione acuta UPEC è autolimitante, con una risoluzione di infiammazione della vescica e batteriuria entro circa una settimana. È interessante notare che, in questo modello, UPEC facilmente formare riserve intracellulari di riposo all&#39;interno del tessuto della vescica da cui UPEC sono capaci di emergere da uno stato inattivo a ricominciare una UTI attivo, potenzialmente spiegare uno dei meccanismi per lo stesso ceppo UTI ricorrente negli esseri umani 33, 34. Oltre alle influenze genetiche sulla UTI suscettibilità, introduzione di un catetere in vescica aumenta notevolmente la probabilità di avere un&#39;infezione nonché aumentare la gamma di batteri in grado di causare un&#39;infezione. È stato dimostrato che la cateterizzazione urinaria umana provoca istologico ecambiamenti immunologici nella vescica a causa di stress meccanico che si traduce in una risposta infiammatoria robusto, esfoliazione, edema della lamina propria e submucusa, assottigliamento uroteliale, e mucosa lesioni dell&#39;urotelio e rene 35,36. Inoltre, il catetere fornisce una superficie di attacco batterico creando così un ambiente utilizzato da diverse specie di causare CAUTI. Mentre UPEC sono ancora una delle principali cause, Enterococcus faecalis rappresenta il 15% di questi CAUTI 37. E. faecalis sta diventando sempre più resistenti agli antibiotici con vancomicina resistenza emersione, che presentano un grave problema per la salute 38. E. faecalis possiedono numerosi fattori di virulenza tra cui tossine e adesine necessari per il fissaggio sia per il catetere e epitelio 38. Durante cateterizzazione urinaria, l&#39;host è vulnerabile a microbica adesione, moltiplicazione e diffusione del 39,40 tratto urinario. E. faecalis forma un biofilm sul catetere come parte di un meccanismo a persistere nella vescica e diffondere ai reni, che viene riprodotto in un modello di topo CAUTI 41. Recentemente, è stato dimostrato durante cateterizzazione urinaria, fibrinogeno (Fg) viene rilasciato nella vescica come parte della risposta infiammatoria. Fg accumula nella vescica, ricopre il catetere ed è essenziale per E. faecalis formazione di biofilm, funzionando come un ponteggio allegato. In un modello C57BL / 6 del mouse di CAUTI, abbiamo scoperto che E. formazione di biofilm faecalis sul catetere, e quindi la persistenza nella vescica, era dipendente dalla pilus Ebp, in particolare la sua EBPA punta adesina. Abbiamo trovato che il dominio N-terminale di EBPA lega specificamente a FG rivestimento del catetere. Inoltre, si è riscontrato che E. faecalis utilizza Fg come fonte metabolita durante l&#39;infezione, rafforzando in tal modo la formazione di biofilm 42. Modelli murini hanno dimostrato fondamentale per underdagiato nonché prevedere manifestazioni cliniche di UTI e CAUTI 41. In questo articolo abbiamo dimostrato la preparazione inoculo della cistite UPEC isolare UTI89 e inoculazione transuretrale di topi C3H / celibato. Inoltre, dimostriamo un protocollo per l&#39;inserimento del catetere in topi C57BL / 6 e inoculazione del E. ceppo faecalis OG1RF. Entrambe queste tecniche portano a UTI coerente e affidabile o CAUTI nei topi. Mostriamo anche le tecniche utilizzate per osservare la formazione di IBC durante cistite acuta e raccolta delle urine per l&#39;analisi di cistite cronica o ricorrente. Topi C3H / nubilato sono stati utilizzati per studiare gli aspetti della UPEC patogenesi tra cui l&#39;invasione iniziale batterica, la formazione di IBC, filamentazione e lo sviluppo di cistite cronica 23,33,43. Questi parametri di virulenza sono stati studiati anche in una varietà di altri ambiti del mouse 22,33. Per CAUTI, il / 6 modello C57BL permette per l&#39;impianto di corpi estranei nella vescica con conseguente co battericalonization, che può essere mantenuta per 7 giorni dopo l&#39;infezione 41. Questi modelli sono stati utili per valutare i meccanismi di virulenza batterica, le risposte di accoglienza per UTI e meccanismi per sovvertire risposta dell&#39;ospite, gran parte del quale è stato successivamente ricapitolato o osservati nella popolazione umana clinici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for catheter and needle preparation:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ga needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td>30Gx &#189; (0.3 mm x 13mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE10 polyethylene tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>427400</td>
			<td>Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter &#8211; 0.024 in (0.61 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc</td>
			<td>SIL 025</td>
			<td>inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for infections:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane &#8211; Isothesia</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>29405</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Glass Straight-Sided Jar</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>5413289V 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Tea Infuser</td>
			<td>Schefs-Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton balls</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-456-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotec 3 -vaporizer</td>
			<td>Ohmeda</td>
			<td>1224478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear punch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-201</td>
			<td>(when necessary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Betadine solution</td>
			<td></td>
			<td>10% Povidie-iodine topical solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-037-924</td>
			<td>6 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diapers for bench</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14206 63</td>
			<td>Absorbent Underpads (20&#8221;X36&#8221;mats)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical lubricant</td>
			<td>Surgilube</td>
			<td>0281-0205-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor</td>
			<td>Fine Science tools, INC</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science tools, INC</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Tuberculin slip tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td>4 in x 125 FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf rack</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>AVX-T-17-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvesting catheters, bladders and kidneys:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>PRO Scientific INC</td>
			<td>Bio-Gen Pro 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>352063</td>
			<td>for organ homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>Georgia-Pacific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>11100020S</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar&#8482; Clear Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate sodium saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210</td>
			<td>Branson Ultrasonics Corporation</td>
			<td>1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBC materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture test plate</td>
			<td>Techno Plastic Products</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15520-034</td>
			<td>Ultrapure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet-P40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754599001</td>
			<td>Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60299</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of uti and cauti in a mouse model

Infezioni del tratto urinario (UTI) sono altamente prevalenti, una causa importante di morbilità e sono sempre più resistenti al trattamento con antibiotici. Le femmine sono sproporzionatamente afflitti da UTI: il 50% di tutte le donne avranno un UTI nella vita. Inoltre, il 20-40% di queste donne che hanno un primo UTI subirà una ricorrenza con qualche sofferenza recidive frequenti con un grave deterioramento della qualità della vita, il dolore e il disagio, interruzione delle attività quotidiane, l&#39;aumento dei costi sanitari, e poche opzioni di trattamento diverso di profilassi antibiotica a lungo termine. Uropatogeni Escherichia coli (UPEC) è l&#39;agente eziologico principale di acquisita in comunità UTI. Catetere-associata UTI (CAUTI) è la più comune infezione acquisita in ospedale pari a un milione di eventi negli Stati Uniti ogni anno e costi sanitari drammatici. Mentre UPEC è anche la causa primaria di CAUTI, altri agenti causali sono di maggiore importanza tra cui Enterococcusfaecalis. Qui utilizziamo due modelli murini consolidate che ricapitolano molte delle caratteristiche cliniche di queste malattie umane. Per UTI, un modello C3H / nubilato ricapitola molte delle caratteristiche di virulenza UPEC osservati negli esseri umani, tra cui le risposte di accoglienza, formazione e IBC filamentazione. Per CAUTI, un modello con topi C57BL / 6, che mantengono gli impianti vescica catetere, ha dimostrato di essere sensibili a E. faecalis infezione della vescica. Questi modelli rappresentativi vengono utilizzati per ottenere sorprendenti nuove informazioni sulla patogenesi della malattia UTI, che sta portando allo sviluppo di nuove terapie e strategie di gestione e di prevenzione.

I modelli intravescicali di semplice e catetere IVU associate forniscono piattaforme flessibili per chiarire i meccanismi molecolari della patogenesi batterica, l&#39;impatto di queste malattie sulla tessuto ospite, e lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi approcci per gestire queste infezioni comuni e costosi. A seconda del ceppo di topi e patogeno, inoculazione intravesical può essere usato per studiare le interazioni ospite-patogeno per chiarire fattori necessari per avviare o modulante acuta (Figura 1 e 3), croniche o ricorrenti (Figura 2) cistite. I dati riportati nella figura 1 sono rappresentativi della fase acuta (24 HPI) colonizzazione del tratto urinario dal prototipo UPEC cistite isolano UTI89 44. Dopo l&#39;inoculazione, le infezioni possono sviluppare per 24 ore a che punto i topi vengono sacrificati e il tessuto della vescica e del rene omogeneizzato. Gli omogenati di tessuti sono in serie diluted e placcato per il conteggio dei batteri che colonizzano. Colonizzazione UPEC cronica e infiammazione della vescica possono essere istituiti e mantenuti in alcune linee del mouse (in particolare C3H / nubilato) in una dose infettiva e modo uropatogeno dipendente. Cistite cronica è definita come persistenti batteriuria ad alto titolo (&gt; 10 4 CFU / ml), infiammazione della vescica e ad alto titolo oneri vescica batteriche (&gt; 10 4 CFU / vescica) al momento del sacrificio 33. I dati riportati nella figura 2 sono CFU rappresentativi che si verificano quattro settimane dopo l&#39;inoculazione di topi C3H / nubilato con 2 x 10 7 CFU di UTI89. In queste condizioni sperimentali, 20-50% dei topi infettati sviluppano cistite cronica mentre il restante 50-80% dei topi risolvere l&#39;infezione. Questa dualità di esito dipende da un punto di controllo ospite-patogeno che si decide entro il primo 24 HPI. L&#39;attivazione (o meno) dei risultati checkpoint nella distribuzione bimodale osservata di titoli batteriche, che inizia a manifestarsi inurine a 3 dpi (giorni dopo l&#39;infezione) e nella vescica al sacrificio 28 dpi (Figura 2) 33. I topi con una storia di cistite cronica sono significativamente predisposti a ricorrenti cistite cronica sulla sfida dopo l&#39;infezione iniziale è eliminato con terapia antibiotica 33. Allo stesso modo, una storia di UTI è un noto fattore di rischio per UTI ricorrente negli esseri umani. Così, questo è l&#39;unico modello noto utilizzato per studiare la patogenesi della ricorrente UTI. Quando sperimentalmente modellazione UTI in ambiti alternativi del mouse, è importante determinare se il ceppo di topi è suscettibile di UTI, UTI ricorrenti o CAUTI, dato che alcuni ceppi sono più o meno resistenti allo sviluppo di queste sindromi 33. Una misura aggiuntiva di cistite acuta è IBC enumerazione. Formazione IBC è limitata alle cellule superficiali ombrello terminalmente differenziate. IBC quantificazione è una misura informativo di carica batterica durante cisti acutaitis e alti livelli di IBC correlano con il rischio di sviluppare la cistite cronica 21. Formazione IBC verifica solo nelle fasi acute della malattia. Dopo l&#39;esfoliazione delle cellule superficiali ombrello, GIR non sono più rispettati. Nel modello UTI C3H / nubilato, IBC può essere misurato 6 ore dopo inoculando ~ 1 x 10 7 CFU di UTI89 nella vescica transurethrally. Vesciche sono divaricate con perni metallici su lastre di silicone e colorate per l&#39;espressione di LacZ. LacZ, β-galattosidasi, un enzima batterico comunemente espressa che scinde il legame β tra il galattosio e altri zuccheri. Questo enzima può essere utilizzato per rilevare i batteri fornendo X-gal, un analogo β-galattoside, che produce un colore blu sulla fenditura. Dopo la colorazione, le camere d&#39;aria vengono esposte sotto un microscopio da dissezione con il GRV che appaiono come puntini punctae blu / viola sul urotelio e IBC possono essere elencati contando i punti (figura 3A). Mentre il numero di IJacket formate per animale varia, nel C3H / nubilato sfondo una media di ~ 50 IBC sono visti per la vescica (Figura 3B). Aumento GIR in modo dose-dipendente. Il numero di IBC che si formano varia tra UPEC e ceppi di topi di sfondo. Ad esempio, in C57BL / 6, un inoculo di ~ 1 x 10 7 UTI89 porta alla formazione di diverse centinaia di IBC per vescica. Al di là della comunità semplice acquisita UTI modellato sopra, brughiera-cura associate infezioni del tratto urinario rappresenta un onere significativo per il sistema sanitario. IVU rappresentano circa il 40% di tutte le infezioni associate sanitari e fino al 95% di tutti sanitario associato IVU sono catetere associati 45. Qui mostriamo un modello murino di impianto della vescica di CAUTI che rappresenta un potente sistema per l&#39;analisi sperimentale di questo difficile problema clinico. I dati presentati in Figura 4 sono rappresentative del 24 hr infezioni con il modello E. faecalis s<html> addestrare OG1RF. Quando 1 x 10 7 CFU di OG1RF sono via endovescicale inoculato in una vescica non impiantato, l&#39;infezione comincia a chiaro 24 HPI (Figura 4A) e del 3 dpi la risoluzione dell&#39;infezione 41. Al contrario, l&#39;inoculazione di OG1RF in un impiantati risultati della vescica in colonizzazione sia il catetere e la vescica, con 10 volte superiori livelli di colonizzazione della vescica a 24 HPI di quelli osservati nelle vesciche non impiantato (Figura 4A e 4B). Inoltre, questa infezione è mantenuta a&gt; 10 6 CFU nella vescica fino alla perdita catetere circa 7 dpi 41. Tutti i modelli sperimentali descritti sono suscettibili di un elevato grado di flessibilità sperimentale, compreso ma non esclusivo di vari approcci per imaging macroscopica e microscopica dei tessuti infetti e superfici, dimensioni inoculo alterati e tempi di malattia, infezioni competitivi e ospitano analisi immunologiche . ve_content &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52892/52892fig1.jpg" /> Figura 1:. 24 ore colonizzazione del tratto urinario femminile, 7-8 settimane di età C3H / mice HeN stati transurethrally inoculato con ~ 2 x 10 7 CFU del prototipo UPEC cistite isolare UTI89 per 24 ore. CFU rappresentativi recuperati dai tessuti della vescica e del rene raccolte vengono mostrati, n = 5. La linea tratteggiata denota il limite inferiore di rilevamento (20 CFU). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52892/52892fig2.jpg" /> Figura 2:. 28 giorni di colonizzazione del tratto urinario femminile, 7-8 settimane di età topi C3H / HeN stati transurethrally inoculato con ~ 2 x 10 7 CFU UTI89. Urina era raccogliere in indicati infezione giorni dopo (dpi) e placcato per CFU enumerazione. Rappresentante della vescica 28 giorni e renali titoli vengono anche visualizzati, n = 8. Urine CFU limite inferiore di rilevazione (1.000 UFC / ml) è indicato con la linea tratteggiata. Rappre linea tratteggiatats limite il tessuto inferiore di rilevamento, 20 CFU / tessuto. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52892/52892fig3.jpg" /> Figura 3:. IBC enumerazione Femmina, 7-8 settimane di età topi C3H / HeN stati transurethrally inoculato con ~ 1 x 10 7 CFU UTI89. Vesciche sono state raccolte 6 HPI e allargate per IBC colorazione. (A) Immagine di vescica strombato dopo LacZ colorazione. GIR sono rappresentati come puntini blu. L&#39;immagine inserto è un ingrandimento digitale della sezione dell&#39;immagine nella scatola nera. (B) numeri rappresentativi di IBC formati nei topi C3H / nubilato 6 HPI, n = 10. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52892/52892fig4.jpg" /> Figura 4: E. faecalis catetere-associata UTI. C57BL / 6 topi sono stati inoculati con o senza cateteri con ~ 1 x 10 7 CFU della <em&gt; E. faecalis ceppo OG1RF per 24 ore. (A) E. faecalis colonizzazione della vescica in presenza o assenza di catetere. (B) E. faecalis colonizzazione del catetere. Test di Mann-Whitney U è stato utilizzato per esperimenti di topo, p &lt;0,05 è stato considerato statisticamente significativo. **, P &lt;0.005. <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/52892/52892figS1.jpg" /> Figura S1:. UTI preparazione inoculo ago diagramma mostra inoculazione fasi di preparazione dell&#39;ago compresi materiali necessari (1), filettatura del catetere sul all&#39;ago (2) e del taglio del tubo prima dell&#39;inoculazione (3). <img alt="Figura S2" src="/files/ftp_upload/52892/52892figS2.jpg" /> Figura S2:. CAUTI preparazione inoculo ago diagramma mostra materiali di preparazione dell&#39;inoculo aghi necessari (1), filettatura del catetere inoculazione (2) e il catetere impiantazione suall&#39;ago (3).

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Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K Views.  Washington University School of Medicine. The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Istituzione di un modello di occhio secco severo utilizzando la dacrigofectomia completa nei conigli

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Establishment of a Mouse Severe Acute Pancreatitis Model using Retrograde Injection of Sodium Taurocholate into the Biliopancreatic Duct

The prevalence of acute pancreatitis (AP), especially severe acute pancreatitis (SAP), is increasing in younger age groups annually. However, there is a lack of effective treatments in the current clinical practice. With the easy accessibility of transgenic and knockout strains and their small size, which allows minimal doses of drugs required for in vivo evaluation, a well-established experimental model in mice is preferred for AP research. Moreover, SAP induced through sodium taurocholate (TC) is currently one of the most widely used and best characterized models. This model has been investigated for novel therapies and possible molecular events during the process of AP. Here, we present the generation of an AP mouse model using sodium taurocholate and a simple homemade microsyringe. Moreover, we also provide the methodology for the subsequent histology and serological testing.

A mouse model of severe acute pancreatitis is described herein. The procedure presented here is very rapid, simple, and accessible, thereby potentially allowing the study of the molecular mechanisms and different therapeutic interventions in acute pancreatitis in a convenient way.

Creazione di un modello di pancreatite acuta grave del topo mediante iniezione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto biliopancreatico

The prevalence of acute pancreatitis (AP), especially severe acute pancreatitis (SAP), is increasing in younger age groups annually. However, there is a ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Un modello murino BALB/c neonatale di enterocolite necrotizzante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

Establishment and Evaluation of a Porcine Vein Graft Disease Model

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutic strategies. 
To perform the surgery, we enter the cardiac chamber through the third intercostal space and carefully dissect the internal mammary vein and immerse it in normal saline. The right main coronary artery is then treated for ischemia. The target vessel is incised, a shunt plug is placed, and the distal end of the graft vein is anastomosed. The ascending aorta is partially blocked, and the proximal end of the graft vein is anastomosed after perforation. The graft vein is checked for patency, and the proximal right coronary artery is ligated. 
CABG surgery is performed in minipigs to harvest the left internal mammary vein for its use as a vascular graft. Serum biochemical tests are used to evaluate the physiological status of the animals after surgery. Ultrasound examination shows that the proximal, middle, and distal end of the graft vessel are unobstructed. In the surgical model, turbulent blood flow in the graft is observed upon histological examination after the CABG surgery, and venous graft stenosis associated with intimal hyperplasia is observed in the graft. The study here provides detailed surgical procedures for the establishment of a repeatable CABG-induced VGD model.

In this protocol, novel pig vein bypass grafting was performed through a small incision in the left chest wall without cardiopulmonary bypass. A postoperative pathology study was done, which showed intimal thickening.