The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.

Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo procedura standard; Esperimenti sono stati approvati dalla University of Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee. 1. Preparazione di embrioni / larve <ol><li> Per condurre accoppiamenti a tempo, impostare adulti maschi e femmine Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 pesci hemizygous o omozigoti O / N e inserire un divisore tra di loro. Rimuovere questo divisore il mattino seguente quando si desidera accoppiamento. Raccogliere gli embrioni da sforzare l&#39;acqua con un colino a maglia fine di plastica. </li><li> Girare il filtro a testa in giù e risciacquare la superficie a rete con un bel flusso di acqua uovo erogata da un flacone. Trasferire 100 embrioni in una capsula di Petri 100 mm con 25 ml di acqua uovo. Mantenere non più di 100 embrioni per capsula di Petri e aumentare a 28 ° C. </li><li> Per inibire la pigmentazione, aggiungere feniltiourea (PTU) nelle capsule di Petri prima di 10 ore dopo la fecondazione (HPF), ed aumentare embryos / larve fino a 80 HPF. La concentrazione finale di PTU è 0,2 mM. ATTENZIONE: PTU è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione. </li><li> Anestetizzare le larve aggiungendo 3-amino etil estere benzoico (Tricaine), ad una concentrazione finale di 0,016%, nelle piastre di Petri. Quindi, utilizzando un microscopio a epifluorescenza, larve sorta CFP-positivi. Utilizzare larve con una dimensione del fegato simile e scartare quelli con un fegato più piccolo o più grande. NOTA: qualsiasi larve CFP-positivi, indipendentemente dall&#39;intensità, può essere utilizzato perché non c&#39;è differenza nel grado di epatociti ablazione tra le larve emizigote e omozigote. ATTENZIONE: tricaine è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua uovo contenente Tricaine e aggiungere acqua uovo integrato con 0,2 PTU mm. Tenere il embrioni / larve a 28 ° C. </li></ol> 2. Mtz Trattamento <ol><li> Preparare fresco soluzione Mtz 10 mM sciogliendo 0,171 g di polvere in 1 MtzAcqua uovo 00 ml integrato con 0,2% PTU mM DMSO e 0,2. Per sciogliere completamente la Mtz, mescolare la soluzione a temperatura ambiente, con una rapida agitazione per 20-30 minuti. Per aiutare solubilizzare Mtz e per migliorare Mtz permeazione in larve, aggiungere DMSO durante la preparazione Mtz. ATTENZIONE: l&#39;esposizione prolungata o un aumento della concentrazione di Mtz è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione. </li><li> Separare le larve in gruppi di controllo e sperimentali per il trasferimento di numero desiderato di larve in due diversi 100 mm piatto di Petri o un piatto multi-bene. Per il gruppo sperimentale, mantenere le larve in 10 soluzione Mtz mM; per il gruppo di controllo, tenerli in acqua uovo contenente 0,2% DMSO. </li><li> Coprire le piastre o capsule di Petri contenenti la soluzione Mtz con un foglio di alluminio per evitare che la foto-inattivazione di Mtz, e incubare a 28 ° C. La durata del trattamento Mtz dipende dallo stadio larvale e la linea transgenica. </li><li> Per osservare simile grave ablazione epatociti nella <em&gt; Tg (fabp10a: CFP-NTR) linea, trattare le larve con la soluzione da Mtz da 3,5 giorni dopo la fecondazione (dpf) (per una durata di 36 ore) e da 5 dpf (per una durata di 24 ore). </li></ol> 3. Analisi delle vie biliari-driven rigenerazione del fegato <ol><li> Alla fine del periodo di ablazione, rimuovere la soluzione Mtz dalle piastre. Lavare le larve Mtz trattati aggiungendo 25 ml di acqua uovo. Agitare la piastra 2-3 volte per lavare le larve prima di gettare l&#39;acqua uovo. Ripetete per tre volte e poi immergere le larve di nuovo in acqua uovo. Per evitare edema cardiaca e morte larvale nelle larve Mtz trattati, aggiungere una minore concentrazione di Tricaine, ad una concentrazione finale di 0,008%, per immobilizzare le larve. </li><li> Per l&#39;analisi del fegato, esaminare la dimensione del fegato delle larve Mtz trattati sotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro della PCP. Valutare i livelli di ablazione epatociti in base alle dimensioni del fegato relative: grande (non ablazione; 0-10% larve), medio (parzialmente ablated; 10-20%), e molto piccola (completamente ablated; 80-90%). </li><li> Rimuovere le larve con fegati non ablazione o parzialmente ablazione. Tenere larve solo con un minuscolo fegato, che è indicativo di grave ablazione epatociti. Per l&#39;analisi del fegato presso la rigenerazione 0 punto tempo hr (R0h), raccogliere le larve dopo Mtz washout e CFP ordinamento. In caso contrario, mantenere le larve ordinati in acqua uovo integrato con 0,2 PTU mm, fino pronto per la raccolta. </li><li> Trasferire larve raccolte in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e sostituire l&#39;acqua uovo con la soluzione di fissaggio del 3% formaldeide in tampone PEM. Incubare la provetta su un rotatore O / N a 4 ° C. </li><li> Sostituire la soluzione di fissaggio con 1 ml di PBSDT e ruotare il tubo contenente le larve sul rotatore per 5 min. </li><li> Trasferire le larve fissato in una capsula di Petri 100 millimetri contenente PBSDT e usando pinze, rimuovere manualmente tuorlo e pinne pettorali sotto un microscopio da dissezione. Trasferire fino tp 20 larve sezionato in una provetta da 1,5 ml. </li> &lt;li&gt; Sostituisci soluzione PBSDT con 1 ml di soluzione di blocco e Rock il tubo su un rotatore a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Sostituire soluzione bloccante con 100 ml di soluzione bloccante contenente anticorpi primari. Lentamente rock il tubo su un rotatore O / N a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpo primario e lavare con PBSDT 5 volte per 10 minuti ogni volta. Quindi aggiungere 100 ul di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari e rock su un rotatore a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Lavare 5 volte con PBSDT per 10 minuti ogni volta a RT da dondolo su un rotatore. </li><li> Orientare le larve lateralmente su un vetrino e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio. Coprirli con cura con un vetro di copertura e sigillare il vetro di copertura con un lucidatore del chiodo. Ora, è pronto per la microscopia confocale. </li></ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Cell+Adhesion+Molecule+(EpCAM)+Marks+Hepatocytes+Newly+Derived+from+Stem/Progenitor+Cells+in+Humans.">Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans.</a> Hepatology. 53, 964-973 (2011).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).</li><li>Michalopoulos, G. 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R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+against+a+Stem+Cell+Origin+of+New+Hepatocytes+in+a+Common+Mouse+Model+of+Chronic+Liver+Injury.">Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury.</a> Cell reports. 8, 933-939 (2014).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+alpha+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Sadler, K. 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Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish.">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).</li><li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model.">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. , (2014).</li><li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish.">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).</li><li>Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+signals+modulate+hepatocyte+apicobasal+polarization+in+zebrafish.">Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish.</a> Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).</li><li>Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+Notch+signaling+regulate+quiescence,+renewal+and+differentiation+in+pancreatic+endocrine+progenitors.">Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors.</a> Development. 139, 1557-1567 (2012).</li><li>Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+notch+signal+during+zebrafish+intrahepatic+biliary+development.">Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).</li><li>Itoh, T., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Regeneration+by+Stem/Progenitor+Cells.">Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells.</a> Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).</li><li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase.">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li><li>Stueck, A. E., Wanless, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+cirrhosis:+The+maturation+sequence+of+buds+arising+from+hepatocyte+progenitor+cells.">Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells.</a> Hepatology. 58, 235A (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Grave, ma non mite, epatociti ablazione suscita rigenerazione epatica biliare-driven. Pertanto, dopo il trattamento Mtz e washout, è importante esaminare la dimensione del fegato delle larve Mtz trattato, che può essere valutata intrinseca CFP fluorescenza dal fabp10a: CFP-NTR transgene. Poiché una piccola percentuale di larve Mtz trattati visualizzerà non ablazione (0-5%) o parzialmente ablato (10-20%) fegati, è essenziale per risolvere e solo analizzare le larve con un piccolo fegato, che è indicativo di grave ablazione epatociti. Anche se nel nostro protocollo, abbiamo trattato larve zebrafish con Mtz 3,5-5 dpf (un periodo di trattamento 36 ore), stadi alternativi e la durata del trattamento Mtz sono inoltre possibili. Ad esempio, le larve trattate dal 5 al 6 dpf (un periodo di trattamento di 24 ore) esposto anche gravi ablazione epatociti, simile al periodo di trattamento 36 hr suddetto. Due gruppi addizionali generati in modo indipendentefabp10a simile: linee transgeniche NTR e riportati anche sul processo di rigenerazione epatica biliare-driven seguito l&#39;ablazione specifiche epatociti. Mentre un gruppo trattato con larve Mtz 6-7 dpf 21, un altro lo ha fatto 3,5-4,5 dpf, giungere a conclusioni analoghe 20. Poiché ogni fabp10a: NTR linea transgenica può presentare un diverso livello di espressione NTR, la durata e il dosaggio del trattamento Mtz dovrebbero essere determinati separatamente per ciascuna linea transgenica utilizzato. Può anche essere utile per generare una linea transgenica con una versione migliorata del gene NTR, in cui l&#39;introduzione di tre mutazioni puntiformi porta ad un aumento della sua attività enzimatica 26. Questo mutante NTR si tradurrà in un evento di ablazione più veloce rispetto al wild-type NTR 26. Ciò è particolarmente vantaggioso quando wild-type NTR cinetica possono limitare la possibilità di ablazione cellula completa in una fase desiderata. Dal momento che centinaia di larvepuò contemporaneamente subire epatociti ablazione, questo modello danno epatico zebrafish può essere applicato agli schermi chimici per identificare piccole molecole che possono sopprimere o aumentare la rigenerazione epatica biliare-driven. Ad esempio, utilizzando questo modello, il gruppo Shin a Georgia Tech eseguito un schermo chimica e trovato diversi agonisti e antagonisti Wnt Notch che hanno facilitato la rigenerazione del fegato 20. Abbiamo anche eseguito un piccolo schermo chimica scala e identificato numerosi composti che possono sopprimere la rigenerazione del fegato (SK, TYC, JS, e DS, in preparazione). Marker analizza negli esseri umani hanno suggerito che BEC può contribuire a epatociti rigenerati nel fegato malato 5,6. Gruppo Dr. Wanless &#39;ha recentemente riferito che una grande percentuale di parenchima nella cirrosi regredito sembra essere derivato da LPCs / BEC negli esseri umani 27, implicando l&#39;importanza della rigenerazione epatica BEC-driven in cirrosi regressione. Dato il fatto che BEC principalmentecontribuire alle epatociti rigeneranti del modello danno epatico zebrafish qui descritto, questo modello sarà uno strumento prezioso per determinare i meccanismi cellulari e molecolari alla base di rigenerazione epatica BEC-driven. La comprensione di tali meccanismi fornirà approfondimenti significativi in ​​come per aumentare la rigenerazione epatica innata nei pazienti con malattie epatiche gravi. Inoltre, in combinazione con schermi chimici, questo modello zebrafish può essere utile per identificare un farmaco potenziale che può facilitare la rigenerazione epatica innata in pazienti umani.

Il fegato è un organo altamente rigenerativa. Durante la rigenerazione del fegato, rigenerante epatociti, le cellule parenchimali del fegato, sono derivati ​​da epatociti preesistenti (rigenerazione del fegato epatociti-driven) o BEC (rigenerazione epatica biliare-driven) 1,2. Danno epatico solito provoca la proliferazione di epatociti preesistenti; tuttavia, quando la proliferazione degli epatociti è compromessa, BEC può contribuire agli epatociti 2-4. Queste due modalità di rigenerazione epatica sono clinicamente significativi. Dopo la rimozione chirurgica di una porzione di fegato umano (ad esempio, a causa di tumori epatici o donatori di fegato vivi), epatociti nel fegato residuo proliferano per recuperare la massa epatica persa. Al contrario, nei pazienti con malattie epatiche gravi, epatociti proliferazione è notevolmente compromessa, in modo che BECs o cellule progenitrici epatiche (LPC) sembrano contribuire a epatociti rigeneranti 5,6. Il modello di epatectomia roditore 2/3 parziale, in cuiepatociti proliferano a recuperare la massa epatica perso, ha contribuito in modo significativo l&#39;attuale comprensione di epatociti-driven rigenerazione epatica 7,8. Tuttavia, non esiste un modello roditore valido che epatociti rigeneranti sono derivati ​​principalmente da BEC. Sebbene diversi modelli di tossina roditori fegato hanno portato all&#39;identificazione di biliare-driven rigenerazione epatica 2-4, recenti studi lineage tracing in topi indicano un contributo minimo di BEC per rigenerare epatociti in questi modelli 9,10. Alcuni dei modelli di pregiudizio roditori fegato, tra cui epatectomia parziale 11-13 e paracetamolo indotto danni al fegato 14,15, sono state applicate a zebrafish e ha portato alla identificazione di nuovi geni o percorsi implicati nella rigenerazione epatica. Tuttavia, epatociti-driven, ma non BEC-driven, la rigenerazione del fegato si verifica in questi modelli danno epatico zebrafish. Pertanto, un modello di danno epatico romanzo in cui BEC contribuiscono ampiamente a regeneratepatociti zione è necessario per una migliore comprensione della rigenerazione epatica BEC-driven. Gli obiettivi generali del modello di ablazione epatociti qui descritte sono (1) per generare un modello di danno epatico nel quale BEC contribuiscono ampiamente a epatociti rigeneranti, e (2) chiarire i meccanismi molecolari e cellulari alla base di rigenerazione epatica BEC-driven. Abbiamo ipotizzato che la gravità del danno determina la modalità di rigenerazione epatica; quindi, abbiamo previsto che la rigenerazione epatica biliare-driven avrebbe avviato su gravi lesioni degli epatociti. Per verificare questa ipotesi, abbiamo sviluppato un modello danno epatico zebrafish generando una linea transgenica, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, che altamente esprime nitroreduttasi batterica (NTR) fusa con proteina fluorescente ciano (PCP) sotto il fabp10a specifiche epatociti promoter. Poiché NTR converte il profarmaco non tossico, metronidazolo (Mtz), in un farmaco citotossico, che l&#39;ablazione solo destinato NTR-cellule che esprimono 16-18, in questo caso, gli epatociti. Manipolando la durata del trattamento Mtz, il grado di epatociti ablazione può essere controllato. Utilizzando questo modello, abbiamo recentemente riportato che su di una grave perdita epatociti, BEC ampiamente danno luogo a rigeneranti epatociti 19, che è stato ulteriormente confermato da altri due studi indipendenti 20,21. Pertanto, rispetto al suddetto roditori e modelli danno epatico zebrafish, il nostro modello ablazione epatociti è più vantaggiosa per studiare la rigenerazione epatica BEC-driven. Questo protocollo descrive la procedura per eseguire esperimenti di rigenerazione del fegato utilizzando il modello di epatociti di ablazione zebrafish. Questo modello sarà opportuno per determinare i meccanismi alla base di rigenerazione epatica biliare-driven e per schermi chimici per identificare piccole molecole in grado di reprimere o aumentare la rigenerazione del fegato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media (Vectashield)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm petri dish&#160;</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>M5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540-A and 12-542-A</td>
			<td>18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zn-5 (mouse anti-Alcam)</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>zn-5</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-Hnf4a</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6556 (C-19)</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-RFP</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ACT-CM-MRRFP10</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson laboratories</td>
			<td>705-605-147</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21240</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rat IgG</td>
			<td>Jackson laboratories</td>
			<td>712-165-150</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>S6F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M205FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 g/L of sea salts &#8216;Instant Ocean&#8217; and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.6 g Na2HPO4&#183;7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.&#160; Bring to 1 L with distilled water.&#160; Adjust pH 7.&#160; Autoclave for 20 min at 121&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBSDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&#160; Bring to 1 L with distilled water.&#160; Adjust pH 7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hepatocyte-specific ablation in zebrafish to study biliary-driven liver regeneration

Il fegato ha una grande capacità di rigenerarsi. Gli epatociti, le cellule parenchimali del fegato, può rigenerare in uno di due modi: rigenerazione epatica hepatocyte- o biliare-driven. In rigenerazione del fegato epatociti-driven, epatociti rigeneranti sono derivati ​​da epatociti preesistenti, mentre, nella rigenerazione biliare-driven, epatociti rigeneranti sono derivati ​​da cellule epiteliali biliari (BECS). Per la rigenerazione del fegato epatociti-driven, ci sono ottimi modelli di roditori che hanno significativamente contribuito alla attuale comprensione della rigenerazione epatica. Tuttavia, non esiste tale modello roditore per la rigenerazione epatica biliare-driven. Recentemente abbiamo riportato su un modello di danno epatico zebrafish in cui BEC ampiamente danno luogo a epatociti sul grave perdita degli epatociti. In questo modello, gli epatociti sono specificamente asportate da un mezzo di farmacogenetica. Qui vi presentiamo in dettaglio i metodi per l&#39;ablazione epatociti e di analizzare il processo di rigenerazione epatica BEC-driven.Questo modello di ablazione specifici epatociti può essere ulteriormente utilizzato per scoprire i meccanismi molecolari e cellulari alla base della rigenerazione epatica biliare-driven. Inoltre, questi metodi possono essere applicati agli schermi chimici per identificare piccole molecole che aumentano o sopprimono rigenerazione epatica.

Trattamento Mtz per 36 ore (A36h, A sta per l&#39;ablazione) 3,5-5 dpf ridotto drasticamente le dimensioni del fegato (Figura 1B). Dopo Mtz washout, considerato come l&#39;inizio della rigenerazione epatica (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: espressione DsRed riapparso in 30 ore (Figura 1B). La rete biliare intraepatica, valutata mediante espressione di Alcam che è presente nella membrana di BECs 22, inizialmente crollata ma fu ripristinata al 54 hr post-washout (R54h) (Figura 1C). Questi dati indicano che la rigenerazione epatica e recupero rapidamente verificano nel nostro modello di danno epatico. La Figura 2 mostra che epatociti rigeneranti sono derivati ​​da BECs. Il Tg (Tp1: H2B-mCherry) linea S939 esprime una proteina fluorescente rosso nucleare sotto il controllo di un elemento contenente 12 RBP-Jĸ siti di legame di 23. Questo respo Notchelemento nsive sembra guidare l&#39;espressione genica esclusivamente BECs nel fegato 24; tuttavia, è possibile che si spinge l&#39;espressione genica in LPCs perché segnale di Notch è strettamente legato alle LPCs 25. Pertanto, questa linea transgenica consente una facile individuazione di BEC, e probabilmente LPC, nuclei. Inoltre, la stabilità estesa del H2B-mCherry permessi proteina di fusione a breve termine lineage tracing. La maggior parte delle cellule H2B-mCherry + nel fegato rigenerante a R0h espresso Hnf4α (Figura 2A), che si esprime in epatociti, ma non in BEC, nel fegato di controllo. Gli epatociti, come valutato dal fabp10a: Espressione CFP-NTR, a R48h conservavano ancora Tp1: espressione H2B-mCherry (Figura 2B, frecce). Questi dati indicano BEC conversione in epatociti su grave perdita epatociti, che è stato ulteriormente confermato dal lignaggio permanente tracciando 19. <img<html> alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52785 / 52785fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Un modello danno epatico zebrafish. (A) Schema che illustra i periodi di trattamento Mtz e rigenerazione del fegato. (B) 36 ore di trattamento Mtz fortemente ridotte dimensioni del fegato e fabp10a: PCP e fabp10a: DsRed fluorescenza a R0h; tuttavia, forte CFP e DsRed fluorescenza riapparvero a R30h. Le frecce indicano il fegato (li). visite (C) confocale proiezione di tutto il fegato immunostained con anticorpi anti-Alcam che etichettati BEC. La rete biliare intraepatica è crollata a R0h ma rapidamente ripristinata in R54h. Regioni tratteggiate delineano il fegato. Bar Scala:. 100 (B), 20 (C) micron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52785/52785fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> _upload / 52785 / 52785fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. BEC danno luogo a epatociti su grave perdita degli epatociti (A) vista confocale proiezione del fegato mostrano Hnf4α (verde) e Tp1:. H2B-mCherry (rosso) espressione in R0h. (B) confocale immagini singole-ottico sezione mostrano fabp10a: CFP-NTR (grigio) e Tp1: H2B-mCherry (rosso) espressione nel fegato. espressione mCherry è stato rivelato da anti-mCherry immunocolorazione. Si noti l&#39;espressione deboli mCherry nei nuclei delle PCP + epatociti (frecce). Cellule Forte mCherry + sono BEC. Bar Scala:. 20 micron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52785/52785fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Nanyang Technological University

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Cell Biology

Developmental Biology

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Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

8.5K Views.  University of Pittsburgh. To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Video: Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

Analisi istologiche di lesioni al fegato acuto alcolico in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult liver regeneration after 70% partial hepatectomy results in hepatocyte hypertrophy with some replication in remaining lobes with restoration of metabolic activity, but with permanent loss of the injured lobe&#39;s morphology and architecture. Here, we detail a new surgical method in the neonate that leaves a physiologic environment conducive to regeneration. This model involves amputation of the left lobe apex and a subsequent conservative management regimen, and lacks the necessity for ligation of major liver vessels or chemical injury, leaving a physiologic environment where regeneration may occur. We extend this protocol to amputations on juvenile (P7-14) mice, during which the injured liver transitions from organ regeneration to compensatory growth by hypertrophy. The presented, brief 30 min protocol provides a framework to study the mechanisms of regeneration, its age-associated decline in mammals, and the characterization of putative hepatic stem or progenitors.

Here, we present a new method for partial resection of the left hepatic lobe in neonatal (day 0) mice. This new protocol is suitable for studying acute liver injury and injury response in the neonatal setting.

Epatectomia parziale lobulare: Un modello chirurgico per rigenerazione epatica morfologica

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...